用于抑制MHC-I和/或II信号通路的试剂在治疗胆道闭锁中的应用的制作方法

用于抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂在治疗胆道闭锁中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及用于抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂在治疗胆道闭锁中的应用。


背景技术：

2.胆道闭锁(biliary atresia，ba)发生在婴幼儿围生期(例如，孕28周至出生后4周)，发病率在不同国家和地区从1/5000～1/18000不等。其病因及发病机理至今未明，一般认为由发育和/或环境因素(例如病毒感染等)共同决定，表现为由严重的胆管炎介导的肝外胆管阻塞引发的黄疸和肝衰竭疾病，预后差，病死率高。胆道闭锁的基本病理变化例如为肝内、外胆管进行性炎症、肝纤维化及肝硬化，其肝纤维化/肝硬化的发展比其他成人疾患更快且更具有侵袭性。虽然肝外胆道梗阻通过葛西手术(kasais operation)能部分缓解症状，延缓病情进展，但大多数患儿仍因术后肝内胆管炎症呈进行性发展，最终导致肝硬化和门脉高压，甚至肝衰竭，成为危及患儿生命的严重疾病。目前缺乏有效的预防、诊断和/或治疗ba的方法，ba确诊后需立即进行葛西手术祛除阻塞的胆管残留，肝门肠吻合以疏通胆汁流。如不进行葛西手术治疗，一年内就会发展成终末期肝硬化和肝功能衰竭。葛西手术后，约有50％的患儿需要在两岁以内进行肝移植，而剩余的患者会受累于长期的差预后如反复胆管炎症、门静脉高压、食管静脉曲张性出血、肝性骨营养不良等。因此，在孕期和围产期对孕妇及婴幼儿进行预防干预，以及在新生儿黄疸期对患儿进行筛查、及早鉴别诊断出ba，并进行早期干预，对ba的预防、治疗和预后均具有重要意义。
3.研究发现，病毒感染引发的胆管的自身免疫性损伤是ba发生发展的重要因素。其中，文献“hepatic overexpression of mhc class ii antigens and macrophage-associated antigens(cd68)in patients with biliary atresia of poor prognosis”，hiroyuki kobayashi等，journal of pdidatric surgery，1997，公开了mhc ii类抗原和cd68抗原的肝表达与ba患者的临床病程严重程度密切相关，并且可以作为这些患者的预后因素。文献“hla and cytokine gene polymorphisms in biliary atresia”，howard ehadzic nclare m等，liver，2002，公开了早期的研究表明，ba与hla关联较弱，但这些尚未得到证实，而本研究进一步通过比对ba和健康对照发现，胆道闭锁不是hla相关疾病。文献“type-i but not type-ii interferon receptor knockout mice are susceptible to biliary atresia”，joachim f kubler等，pediatr res.，2006，公开了i型ifn受体的失活显着增加了产后轮状病毒感染后ba的发生率。然而，上述文献均未公开或验证：通过哪些指标，才能及早又准确地发现，是否存在ba相关的免疫损伤并进行应对；如何对ba疾病的早期或预后诊断、预防和/或治疗，才能达到安全又准确有效的目的。


技术实现要素：

4.本发明第一个方面的目的，在于提供mhc-i和/或mhc-ii信号通路的试剂的应用。
5.本发明的第二方面的目的，在于提供检测igm和igg4比值的试剂在制备用于胆道闭锁预后分析的产品中的用途。
6.本发明的第三方面的目的，在于提供一种胆道闭锁预后分析的试剂盒。
7.本发明的第四方面的目的，在于提供igm和igg4的比值作为胆道闭锁预后分析的标志物中的用途。
8.本发明的第五方面的目的，在于提供检测igg的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途。
9.本发明的第六方面的目的，在于提供胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物。
10.本发明的第七方面的目的，在于提供一种胆道闭锁的诊断或辅助诊断试剂盒。
11.本发明的第八方面的目的，在于提供igg抗体作为胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物的用途。
12.本发明的第九方面的目的，在于提供检测肝功能生化指标的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途。
13.本发明的第十方面的目的，在于提供胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物。
14.本发明的第十一方面的目的，在于提供ifnar的阻断剂的应用。
15.本发明的第十二方面的目的，在于提供检测baff的试剂在制备疾病诊断产品中的用途。
16.本发明的第十三方面的目的，在于提供一种胆道闭锁或胆道闭锁纤维化程度的诊断试剂盒。
17.本发明的第十四方面的目的，在于提供baff的特异性阻断剂的应用。
18.本发明的第十五方面的目的，在于提供一种药物组合物。
19.本发明的第一个方面，提供抑制mhc-i和/或mhc-ii信号通路的试剂在(a1)～(a8)中任一种中的用途；
20.(a1)制备防治胆道闭锁的药物；
21.(a2)制备降低黄疸率的产品；
22.(a3)制备降低促炎因子水平的产品；
23.(a4)制备抑制rrv病毒基因表达的产品；
24.(a5)制备提高cx3cl1和c1q水平的产品；
25.(a6)制备抑制自身反应性cd8

t细胞活化的产品；
26.(a7)制备提高kupffer细胞比例的产品；
27.(a8)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
28.优选地，所述促炎因子为ifn-γ。
29.优选地，所述rrv病毒基因包括nsp3和vp6中的至少一种。
30.优选地，所述试剂为mhc-i和/或mhc-ii的阻断抗体。
31.优选地，所述试剂为mhc-i和mhc-ii的双特异性阻断抗体。
32.优选地，所述阻断抗体是单克隆抗体。
33.优选地，所述试剂是hla-dr的阻断抗体。
34.优选地，所述hla-dr的阻断抗体选自immu-114、hu1d10和lym-1中的至少一种。
35.优选地，所述试剂为mhc-i和/或mhc-ii的嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体或全人
抗体。
36.优选地，所述试剂为阻断mhc-i和/或mhc-ii的抗体片段。
37.优选地，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfv-fc、双特异抗体和抗体最小识别单位。
38.优选地，所述药物包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲质和稳定剂中的至少一种。
39.优选地，所述药物为冻干粉剂或注射剂。
40.优选地，所述药物制备成适用于成人或儿童的剂型；进一步优选地，所述药物制备成适用于儿童的剂型。
41.本发明的第二个方面，提供检测igm和igg4比值的试剂在制备用于胆道闭锁预后分析的产品中的用途；优选地，所述产品选自检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒；优选地，所述比值为含量比值或浓度比值。
42.优选地，所述胆道闭锁预后分析为胆道闭锁进行葛西手术术后的预后分析。
43.优选地，所述预后分析包括步骤1)，测定来自受试者的样品中igm和igg4的比值。
44.优选地，所述预后分析还包括步骤2)，将1)中所述的比值与参考水平比较。
45.优选地，当预后分析包括步骤1)时，igm和igg4的比值＞0.01，优选≥0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05或0.055，则指示胆道闭锁预后良好。
46.优选地，当包括步骤1)和步骤2)时，igm和igg4的比值相对参考水平升高，则指示胆道闭锁预后良好。
47.优选地，所述参考水平是来自胆道闭锁预后较差的患者样品中的igm和igg4比值。
48.优选地，所述胆道闭锁预后良好包括体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低中的一种或多种。
49.优选地，所述受试者的样品为全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清液中的一种或多种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
50.优选地，所述胆道闭锁预后分析的产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
51.优选地，所述用于胆道闭锁预后分析的产品包括抗人igm和抗人igg4。
52.优选地，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
53.本发明的第三个方面的目的，在于提供一种胆道闭锁预后分析的试剂盒，所述试剂盒包括检测igm和igg4比值的试剂，优选地，所述比值为含量比值或浓度比值。
54.优选地，所述胆道闭锁预后分析为胆道闭锁进行葛西手术术后的预后分析。
55.优选地，所述预后分析包括以下步骤1)，或包括以下步骤1)和2)：
56.1)测定来自受试者的样品中的igm和igg4比值；
57.2)将1)中所述的比值与参考水平进行比较。
58.优选地，当包括步骤1)时，igm和igg4的比值＞0.01，优选≥0.02、0.025、0.03、
0.035、0.04、0.045、0.05或0.055，则指示胆道闭锁预后良好；当包括步骤1)和2)时，igm和igg4的比值相对参考水平升高，则指示胆道闭锁预后良好。
59.优选地，所述参考水平是来自胆道闭锁预后较差的患者样品中的igm和igg4比值。
60.优选地，所述胆道闭锁预后良好包括体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低中的一种或多种。
61.优选地，所述受试者的样品为全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清液中的一种或多种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
62.优选地，所述胆道闭锁预后分析的试剂盒适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
63.优选地，所述试剂盒包括抗人igm和抗人igg4。
64.优选地，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
65.优选地，所述试剂盒的受试者为儿童或成人，优选儿童。
66.本发明的第四个方面的目的，在于提供igm和igg4的比值作为胆道闭锁预后分析的标志物中的用途，优选地，所述比值为含量比值或浓度比值。
67.优选地，所述胆道闭锁预后分析为胆道闭锁进行葛西手术术后的预后分析。
68.优选地，当igm和igg4的比值相对于参考水平升高，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁预后良好。
69.优选地，所述参考水平从胆道闭锁预后较差的患者样品中的igm和igg4比值确定。
70.优选地，所述参考水平的igm和igg4比值为0～0.01。
71.优选地，所述胆道闭锁预后良好包括体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低中的一种或多种。
72.优选地，所述标志物来自于全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清液中的一种或多种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
73.优选地，所述igm和igg4的比值是通过以下检测方法中的一种或多种检测得到：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
74.优选地，所述标志物从儿童或成人中检测得到，优选从儿童中检测得到。
75.本发明的第五方面的目的，在于提供检测igg的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途。
76.优选地，所述产品包括检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
77.优选地，所述igg是ro/ssa特异性igg。
78.优选地，当igg抗体相对于参考水平增加，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
79.优选地，所述产品检测的样本包括来自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织/组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种。
80.优选地，所述产品检测的样本选自组织或组织裂解液、全血、血清、血浆中的至少一种，优选地，所述组织/组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
81.优选地，所述产品还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
82.优选地，所述产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
83.优选地，所述产品包括抗人igg抗体，优选为抗人ro/ssa特异性igg自身抗体。
84.优选地，所述产品还包括检测igm抗体的试剂；优选地，所述igm抗体为天然igm抗体；进一步优选地，所述igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种；优选地，当所述igm抗体相对于参考水平降低，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
85.优选地，所述产品还包括检测baff的试剂；优选地，当baff相对于参考水平升高，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
86.优选地，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
87.本发明的第六方面的目的，在于提供胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物，所述标志物包括：
88.a)igg抗体；和/或
89.b)igm抗体；和/或
90.c)baff。
91.优选地，所述igg是ro/ssa特异性igg。
92.优选地，所述igm抗体为天然igm抗体；优选地，所述天然igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种。
93.优选地，当igg自身抗体相对于参考水平增加，和/或igm抗体相对于参考水平降低，和/或baff相对于参考水平升高，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
94.优选地，所述标志物从儿童或成人中检测得到，优选从儿童中检测得到。
95.本发明的第七方面的目的，在于提供一种胆道闭锁的诊断或辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
96.a)检测igg抗体的试剂；和/或
97.b)检测igm抗体的试剂；和/或
98.c)检测baff的试剂。
99.优选地，所述igg是ro/ssa特异性igg；优选地，当检测到igg抗体相对于参考水平增加，和/或baff相对于参考水平升高，和/或igm抗体相对于参考水平降低，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
100.优选地，所述igm抗体为天然igm抗体；优选地，所述igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种。
101.优选地，所述试剂盒适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
102.优选地，所述试剂盒的样本包括来自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种。
103.优选地，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
104.优选地，所述试剂盒的受试者为儿童或成人，优选儿童。
105.本发明的第八方面的目的，在于提供igg抗体作为胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物的用途。
106.优选地，所述igg是ro/ssa特异性igg。
107.优选地，所述标志物还包括igm抗体和/或baff。
108.优选地，所述igm抗体为天然igm抗体；优选地，所述igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种。
109.优选地，所述标志物采样自全血、血清或血浆。
110.本发明的第九方面的目的，在于提供检测肝功能生化指标的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途，所述肝功能生化指标包括r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil；优选地，所述产品包括检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
111.优选地，r-gt、alt、ast、tba、dbil相对于参考水平的增加联合ibil相对于参考水平的下降，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
112.优选地，所述产品还包括如下检测试剂中的一种或多种：检测ggt的试剂、检测igg4的试剂、检测tbil的试剂、检测ifn-β的试剂。
113.优选地，ggt、igg4、tbil、ifn-β中的一种或多种相对于参考水平的增加，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受
试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
114.优选地，所述胆道闭锁诊断或辅助诊断试剂盒的受试样本包括来自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织/组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清或血浆。
115.优选地，所述胆道闭锁诊断或辅助诊断产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
116.优选地，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
117.本发明的第十方面的目的，在于提供胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物，所述诊断或辅助诊断标志物包括r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil。
118.优选地，当r-gt、alt、ast、tba、dbil相对于参考水平的增加联合ibil相对于参考水平的下降，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
119.优选地，所述诊断或辅助诊断标志物还包括ggt、igg4、tbil、ifn-β中的一种或多种；优选地，当ggt、igg4、tbil、ifn-β中的一种或多种相对于参考水平的增加，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
120.优选地，所述标志物从儿童或成人中检测得到，优选从儿童中检测得到。
121.本发明的第十一方面的目的，在于提供ifnar的阻断剂在(b1)～(b8)中任一种中的用途；
122.(b1)制备治疗疾病的药物
123.(b2)制备降低黄疸率的产品；
124.(b3)制备降低促炎因子水平的产品；
125.(b4)制备提高il-17a水平的产品；
126.(b5)制备降低炎症性单核细胞水平的产品；
127.(b6)制备抑制自身反应性cd4

t细胞、cd8

t细胞活化的产品；
128.(b7)制备提高kupffer细胞比例的产品；
129.(b8)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
130.优选地，所述ifnar的阻断剂为ifnar的阻断抗体。
131.优选地，所述ifnar的阻断抗体为中和抗体或功能性抗体。
132.优选地，所述ifnar的阻断抗体为单克隆抗体，优选为抗ifnar的人源化单克隆抗体。
133.优选地，所述抗体为嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体、全人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或抗体片段。
134.优选地，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfv-fc、双特异抗体和抗体最小识别单位。
135.优选地，所述人源化抗体选自anifrolumab、faralimomab、medi-545、rontalizumab、sifalimumab、ags-009、ifnαkinoid、ni-0101中的一种或多种。
136.优选地，所述药物包括药学上可接受的载体。
137.优选地，所述药物为冻干粉剂、注射剂或口服液体注射胶囊。
138.优选地，所述药物制备为适用于儿童或成人的剂型，优选儿童的剂型。
139.优选地，所述胆道闭锁为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
140.优选地，所述促炎因子为ifn-γ。
141.优选地，所述炎症性单核细胞为ly6g

ly6c

cd11b

细胞。
142.本发明的第十二方面的目的，在于提供检测baff的试剂在制备疾病诊断产品中的用途，所述疾病诊断产品为胆道闭锁疾病诊断产品或胆道闭锁疾病肝纤维化程度的诊断产品。
143.优选地，所述产品包括检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
144.优选地，所述检测baff的试剂是检测baff的蛋白质水平或mrna水平的试剂。
145.优选地，当baff相对于参考水平增加，则诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者；baff水平与肝脏纤维化呈正相关，当所述受试者诊断为胆道闭锁后，baff水平越高，则诊断为胆道闭锁疾病肝纤维化程度越严重。
146.优选地，所述产品还包括如下检测试剂中的一种或一种以上的组合：检测ggt的试剂、检测igg4的试剂、检测alt的试剂、检测ast的试剂、检测tbil的试剂、检测dbil的试剂、检测ibil的试剂、检测tba的试剂、检测ifn-β的试剂。
147.优选地，所述产品的受试样本包括来自待测对象的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种。
148.优选地，所述产品的受试样本选自组织或组织裂解液、全血、血浆、血清中的至少一种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
149.优选地，所述产品的还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
150.优选地，所述产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、免疫斑点印迹、流式细胞术以及免疫组织化学分析。
151.优选地，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
152.优选地，所述产品还包含检测mmp7的检测试剂；优选地，检测mmp7的试剂是其蛋白质或mrna水平；优选地，当mmp7相对于参考水平增加，则进一步诊断为胆道闭锁。
153.本发明的第十三方面的目的，在于提供一种胆道闭锁或胆道闭锁纤维化程度的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：baff的检测试剂，以及mmp7的检测试剂；优选地，所述检测试剂检测蛋白质或mrna水平；优选地，baff和/或mmp7相对于参考水平增加，则诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述
非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者；baff水平与肝脏纤维化呈正相关，当所述受试者诊断为胆道闭锁后，baff水平越高，则诊断为胆道闭锁疾病肝纤维化程度越严重。
154.优选地，所述试剂盒适用的样本来源是全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种；优选地，为全血、血清或血浆。
155.优选地，所述试剂盒包括抗baff抗体和抗人mmp-7抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体。
156.优选地，所述试剂盒适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、免疫斑点印迹、流式细胞术以及免疫组织化学分析。
157.优选地，所述试剂盒还包括样品处理试剂、样品稀释试剂、阳性或阴性对照液、洗涤液、终止液、防腐剂中的一种或多种。
158.优选地，所述试剂盒适用的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
159.本发明的第十四方面的目的，在于提供baff的特异性阻断剂在制备在(c1)～(c7)中任一种中的用途；
160.(c1)制备防治疾病的药物
161.(c2)制备降低黄疸率的产品；
162.(c3)制备降低igg4水平的产品；
163.(c4)制备降低肝脏功能指标的产品；
164.(c5)制备降低促炎因子水平的产品；
165.(c6)制备提高kupffer细胞比例的产品；
166.(c7)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品；
167.优选地，所述疾病为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
168.优选地，所述baff的特异性阻断剂阻断baff与选自bcma、taci及baff-r中至少一种baff受体的结合；或者，所述baff的特异性阻断剂使得baff的功能减弱或失效。
169.优选地，所述baff的特异性阻断剂为baff的阻断抗体。
170.优选地，所述抗体为中和抗体或功能性抗体。
171.优选地，所述中和抗体中和膜结合型b细胞活化因子(mbbaff)、可溶性三聚b细胞活化因子(sbaff)、可溶性60-mer b细胞活化因子中的至少一种形式的人b细胞活化因子。
172.优选地，所述抗体为抗baff的单克隆抗体，优选为抗baff的人源化单克隆抗体。
173.优选地，所述抗体为嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体、全人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或抗体片段。
174.优选地，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfv-fc、双特异性抗体和抗体最小识别单位。
175.优选地，所述阻断抗体选自他贝鲁单抗(tabalumab)、贝利单抗(lymphostat b)、anti baff scfv、anti baff scfv fc。
176.优选地，所述药物还包括其他活性成分；优选地，所述活性成分选自mhc-i的阻断
抗体、mhc-ii的阻断抗体、ifnar的阻断抗体中的至少一种。
177.优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
178.优选地，所述药物为冻干粉剂、注射剂或口服液体注射胶囊。
179.优选地，所述药物的适用对象为儿童或成人，优选为儿童。
180.本发明的第十五方面的目的，在于提供一种药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化，所述药物组合物包含：该药物组合物包含a)、b)和c)中的至少一种：进一步地，包含a)、b)和c)中的至少两种；更进一步地，包含a)、b)和c)；
181.a)抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂；
182.b)ifnar的特异性阻断剂；
183.c)baff的特异性阻断剂。
184.优选地，所述baff的特异性阻断剂为aff的阻断抗体；优选地，所述抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂为mhc-i的阻断抗体和/或mhc-ii的阻断抗体；优选地，所述ifnar的特异性阻断剂为ifnar的阻断抗体；优选地，所述阻断抗体为人源化抗体或全人抗体。
185.优选地，所述阻断抗体为单克隆抗体；或所述阻断抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体。
186.优选地，所述baff的阻断抗体选自他贝鲁单抗(tabalumab)、贝利单抗(lymphostat b)、anti baff scfv、anti baff scfv fc；所述mhc-i的阻断抗体或mhc-ii的阻断抗体选自immu-114、hu1d10和lym-1；所述ifnar的阻断抗体选自anifrolumab、faralimomab、medi-545、rontalizumab、sifalimumab、ags-009、ifnαkinoid、ni-0101。
187.优选地，所述药物组合物的剂型为冻干粉剂、注射剂或口服液体注射胶囊。
188.优选地，所述药物的适用对象为儿童或成人，优选为儿童。
189.本发明的有益效果是：
190.本发明通过单细胞rna测序和生物信息法分析、流式细胞法和免疫荧光法等技术，惊奇地发现，人类在出生后肝脏内仍存在着完整的b细胞发育过程，b细胞的失调导致了ba患儿的自身抗体积累和肝功能衰竭，从而推断出b细胞修饰疗法可能是ba疾病的有效防治方法。
191.进一步地，通过收集大量临床样本和结合多种免疫学分析方法、生物信息学分析方法，一方面发现了多种可用于ba诊断、辅助诊断或预后诊断的便捷、无创、经济、有效的生物标志物，包括：采用igm/igg4比值(例如全血/血清/血浆中的比值)来评价葛西手术后ba患者的预后情况，igm/igg4比值高代表预后良好；在例如血清/血浆/肝脏中，高ro/ssa特异性igg、和/或低天然igm(包括dsdna特异性igm、nucleosome特异性igm、rnp特异性igm、ro/ssa特异性igm)，是胆道闭锁的指征；r-gt、alt、ast、tba、dbil的增加联合ibil下降，是胆道闭锁的有效指征；ba患者血清/血浆和肝脏中，baff水平均正相关地升高，且baff还与ba肝纤维化进程相关，以及baff与ggt、ro/ssa-igg自身抗体、igg4也呈正相关，从而baff水平升高以及baff联合igg4、ggt、ro/ssa-igg自身抗体等，均可作为ba及其纤维化进展的标志物。因此，所述标志物单独或组合均可开发成相关胆道闭锁和/或纤维化进程诊断或辅助诊断或预后诊断的产品，例如检测芯片或检测试剂盒。
192.另一方面，通过取样自肝脏和血液(包括全血、血清、血浆)的人体标本实验、体内
外细胞实验、初生幼鼠感染恒河猴轮状病毒(rrv)诱导的ba疾病模型动物实验，多角度发现和验证了多种可用于ba预防和/或治疗的便于服用、经济又有效的药物或药物靶点，包括：抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂(例如mhc-i/ii的阻断抗体、它们的双特异性抗体、单克隆抗体等)、ifnar和/或baff的特异性阻断剂(例如阻断抗体、中和抗体)。它们均可以通过多种本发明发现的机制(包括改善体重减少、降低黄疸率、降低炎症因子ifn-α/β/γ的水平、降低肝损伤生化指标、ifn-抑制病毒增殖、增加kupffer细胞数量和增强其清道夫功能、减少淋巴细胞浸润，降低肝纤维化程度)，达到明确的预防和/或治疗胆道闭锁疾病发生、发展(例如发展成肝纤维化/肝硬化)的目的。因此，它们可单独和/或组合应用于制备预防和/或治疗胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或肝硬化的药物或药物组合物中，为临床有效防治ba提供了全新的和多种有利于降低药物耐药性和毒性的选择。
附图说明
193.图1是ba患儿肝脏内存在b细胞发育和自身反应性b细胞扩增的现象的结果图：其中，a是b细胞发育过程不同阶段细胞亚群在t-sne上的分布图；b是显示造血干细胞(hsc)、pre-pro-b、pro-b、pre-b和immature b细胞亚群的标志基因的表达的小提琴图；c是显示b细胞发育不同阶段标志基因表达的热图；d是显示不同组内样本间的b细胞子集分布的条形图；e是流式细胞法检测肝脏和骨髓内的b细胞前体的结果图；f是显示从肝活检、骨髓和外周血中分离的不同阶段b细胞中的标记基因表达的热图；g是显示b细胞在不同样本上的发育情况的二维主元分析(pc)图；h是肝脏样本中rag1/2和cd10在前体b细胞中的表达情况的免疫荧光结果图；i是显示ba患者肝脏内前体b细胞的丰度的点状图；j是不同患儿肝脏内前体b细胞的丰度的散点图；k是不同患儿的肝内b细胞亚群的重链和轻链的fv区域内的突变核苷酸数的结果图；l是不同患儿的记忆b细胞(csr)亚群的ig类组成的柱状图；m是不同患儿肝脏内的表示ba患儿肝脏内tnfsf8的含量图；n是tnfsf8在t细胞和nk细胞内的表达的t-sne图。
194.图2是葛西手术术后血清中高igm/igg4比率和低igm/igg4比率的ba患儿生存曲线图。
195.图3是ba患儿、cc对照组、其他对照组患儿的血清、肝脏中的igm、igg浓度图。
196.图4是ro/ssa特异性igg在区分ba与非ba(cc)受试者的预测性能的接受者操作特征(roc)曲线图。
197.图5是不同处理对小鼠体重、黄疸率、炎症因子、肝内b1-a、b细胞前体和成熟b细胞的影响图：其中，a是对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠的体重增加情况图；b为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠的无黄疸率图；c为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内ifn-γ

cd4

t细胞、ifn-γ

cd8

t细胞丰度图；d为流式细胞法检测对照组、rrv组小鼠在11天时肝内b1-a、b细胞前体和成熟b细胞生成的结果图；e为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内b1-a，b细胞前体，成熟b细胞的比率图。
198.图6是不同处理对rrv病毒基因的表达、肝内cx3cr1和c1q浓度、肝内kupffer细胞、肝脏的影响图：其中，a为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii
小鼠rrv病毒基因的相对表达水平图；b为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内cx3cr1和c1q浓度图；c为不同组别小鼠肝脏内的kupffer细胞吞噬荧光标记的大肠杆菌的结果图；d为不同组别小鼠肝脏kupffer细胞的吞噬能力和比例图；e为对照组、rrv组、anti-mhc-i/ii组小鼠的肝脏切片he染色图；f为对照组、rrv组、anti-mhc-i/ii组小鼠的肝脏切片masson三色染料染色图。
199.图7是显示包含ba和非ba受试者的12943份电子病历中，通过回归模型确定的58个显著临床指标的热图。
200.图8是显示沿时间轴的tba、dbil、ibil浓度的散点图。
201.图9是ibil降低与r-gt、alt、ast、tba和dbil增加的组合值在区分ba与非ba受试者的预测性能的接受者操作特征(roc)曲线图。
202.图10是不同处理的小鼠肝脏中的ifn-β水平图。
203.图11是不同处理的小鼠的大小和黄疸率的直观图。
204.图12是不同处理的小鼠的肝脏和脾脏的cd4

t细胞、cd8

t细胞比例图。
205.图13是不同处理的小鼠肝脏中ifn-γ

cd4t、ifn-γ

cd8t、il-17a

cd4t细胞的丰度图。
206.图14是不同处理的小鼠炎症性的单核细胞、kupffer细胞、kupffer的吞噬功能的结果图。
207.图15是不同患者血浆中ifn-β水平图。
208.图16是不同患儿baff的水平、肝脏与血清中baff浓度的相关关系、血清中的baff与γ-谷氨酰转移酶(ggt)浓度的相关关系、肝脏与血清中baff的水平与肝脏的淋巴细胞浸润以及纤维化程度的相关关系的结果图：其中，a是不同患儿(ba和cc)血清和肝脏中的baff的水平图；b是肝脏与血清中baff浓度的相关关系图；c是不同患儿(ba、cc对照组、其他对照组)血清和肝脏中的baff的水平图；d是baff在区分ba与非ba(cc)受试者的预测性能的接受者操作特征(roc)曲线图；e是血清中的baff与γ-谷氨酰转移酶(ggt)浓度的相关关系图；f是肝脏与血清中baff的水平与肝脏的淋巴细胞浸润以及纤维化程度的相关关系的结果图。
209.图17是不同患儿baff基因表达、cd14

和cd68

表达、igg4、cd20、igg4与baff水平的相关关系的结果图：其中，a为显示baff基因主要表达在髓系细胞亚群的t-sne图；b为显示b细胞亚群内编码baff受体的基因表达水平以及髓系细胞中编码结合igg恒定区域的受体的基因表达水平的小提琴图；c为显示肝脏中cd14

和cd68

与baff有共染的dapi免疫荧光图；d是cd14 、cd68

在不同患儿肝脏中共染的细胞数量图；e是不同患儿血浆和肝脏中免疫球蛋白igg4水平图；f是igg4与baff水平的相关关系图；g是cd20

b细胞以及igg4

细胞在ba患者肝脏标本中的dapi免疫荧光结果图；h是肝脏内baff的浓度与ro/ssa-igg自身抗体的水平的相关关系图。
210.图18是baff相关的体外细胞实验结果图：其中，a是不同处理的天然b细胞中igg4的表达水平图；b是不同处理人星状细胞系lx-2中成纤维化相关的基因col1a2、acta1的表达水平图；c是病原体毒素成分lps和炎症因子ifn-β刺激thp1细胞系后baff的表达水平图；d是baff的抗体(anti-baff)对ifn-β导致的igg4表达水平的影响图。
211.图19是baff及其阻断抗体相关的体内动物实验结果图：其中，a是不同处理小鼠的baff水平图；b是不同处理小鼠的无黄疸率图；c是不同处理小鼠的体重变化量图；d是不同
处理小鼠的肝细胞坏死灶以及淋巴细胞浸润情况的he染色图；e是不同处理小鼠的肝脏功能指标alt、ast、dbil、tba水平图。
212.图20是baff阻断抗体相关的体内动物实验结果图：其中，a是不同处理小鼠的肝脏和脾脏中cd4

t细胞和cd8

t细胞里的ifn-γ表达水平图；b是不同处理小鼠的kupffer细胞数量及吞噬功能的结果图；c是不同处理小鼠血浆中的baff浓度图；d是不同处理小鼠的血浆中细胞因子tnf-α、ifn-β、ifn-γ的水平图；e是不同处理小鼠的脾脏中igg1的表达水平图。
具体实施方式
213.以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。
214.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
215.本发明的第一个方面，涉及抑制mhc-i和/或mhc-ii信号通路的试剂在(a1)～(a8)中任一种中的用途；
216.(a1)制备防治疾病的药物；
217.(a2)制备降低黄疸率的产品；
218.(a3)制备降低促炎因子水平的产品；
219.(a4)制备抑制rrv病毒基因表达的产品；
220.(a5)制备提高cx3cl1和c1q水平的产品；
221.(a6)制备抑制自身反应性cd8

t细胞活化的产品；
222.(a7)制备提高kupffer细胞比例的产品；
223.(a8)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
224.在一些实施方式中，所述促炎因子为ifn-γ。
225.在一些实施方式中，所述rrv病毒基因包括nsp3和vp6中的至少一种。
226.其中，术语“mhc”是指主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)，人类的mhc被称为hla(human leukocyte antigen，hla)，即人白细胞抗原。mhc可以分为经典mhc与非经典mhc两类，经典mhc包括mhc i、mhc ii、mhc iii基因，分别编码mhc i分子、mhc ii分子、mhc iii分子。在适应性免疫应答中，外来抗原被b淋巴细胞和t淋巴细胞上的受体分子(如免疫球蛋白和t细胞受体或tcr)识别。这些外来抗原作为肽片段由专门蛋白在细胞表面呈递，统称为主要组织相容性复合物(mhc)分子。
227.在本发明中，“抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂”其意指部分抑制或阻断mhc-i和/或ii信号通路的各关键节点的试剂，例如mhc-i的阻断剂、mhc-ii的阻断剂、tcr的阻断剂、cd4的阻断剂、cd8的阻断剂。这样的试剂可以是化学试剂(例如专利ep1605963b1所述的化合物或专利wo03061702a1所述的他汀类化合物)或生物试剂(例如抗体)。
228.在一些实施例中，所述试剂为mhc-i和/或mhc-ii的阻断抗体，例如为mhc-i和mhc-ii的双特异性阻断抗体。
[0229]“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。在一些实施方式中，所述阻断抗体是单克隆抗体。抗体的类型可以选择igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige、igd。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及全人抗体、以及相关的合成异构形式
(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
[0230]
在一些实施方式中，所述试剂为人源化抗体或全人抗体。
[0231]
在一些实施方式中，所述试剂为mhc-i和/或mhc-ii的人源化抗体。“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白序列或种系基因序列的精确拷贝。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体或全人源化抗体。
[0232]
在一些实施方式中，所述试剂为mhc-i和/或mhc-ii的全人抗体。“全人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点区均来源于人起源的序列。如果所述抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人起源的序列。
[0233]
在一些实施方式中，所述试剂为hla-dr阻断抗体。
[0234]“hla-dr”是指人类白细胞ⅱ类抗原，是mhc-ii类分子，含有2个分子量分别为36kd和27kd的亚基(α亚基和β亚基)。hla-dr表达于b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化t淋巴细胞、活化nk淋巴细胞和人祖细胞上。
[0235]
在一些实施方式中，所述hla-dr阻断抗体选自immu-114、hu1d10和lym-1中的至少一种。
[0236]
由美国garden state cancer center开发，immunomedics公司推进的immu-114是一种anti-hla-dr抗体药物，由于置换了抗体类型至igg4，所以immu-114不会产生如补体依赖性的细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的副作用。immu-14可有效清除包括b细胞、单核细胞、mdc1、mdc2、pdc在内的所有抗原呈递细胞。immu-114可选择性抑制hla-dr t细胞的增殖。目前immu-114正处于phase i，用于单一疗法治疗非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病。immu-114还具有治疗gvhd的潜能。
[0237]
lym-1是一种针对hla-dr10蛋白的小鼠igg2a单克隆抗体，这是一种存在于80％以上淋巴瘤细胞上的细胞表面标记物。当与放射性同位素结合时，lym-1单克隆抗体选择性地将细胞毒性放射性同位素转运到表达hla-dr10的肿瘤细胞，从而保护健康的b细胞和正常组织不被杀伤。该药物还介导adcc，从而促进人中性粒细胞的raji b淋巴样细胞裂解。
[0238]
hu1d10(阿波利珠单抗，apolizumab)的人源化单克隆抗体(remitogentm3；protein design labs，fremont，ca)，这是hla-drβ链上的多态性决定簇，在正常和肿瘤b细胞上表达。阿波利珠单抗在体外诱导cdc和adcc，促进1d10抗原阳性b细胞的半胱天冬酶非依赖性(caspase-independent)凋亡。
[0239]
在一些实施方式中，所述试剂为阻断mhc-i和/或mhc-ii的抗体片段。“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scfv-fc等。
[0240]
本发明的第二个方面，还涉及ifnar的特异性阻断剂在(b1)～(b8)中任一种中的用途；
[0241]
(b1)制备防治疾病的药物
[0242]
(b2)制备降低黄疸率的产品；
[0243]
(b3)制备降低促炎因子水平的产品；
[0244]
(b4)制备提高il-17a水平的产品；
[0245]
(b5)制备降低炎症性单核细胞水平的产品；
[0246]
(b6)制备抑制自身反应性cd4

t细胞、cd8

t细胞活化的产品；
[0247]
(b7)制备提高kupffer细胞比例的产品；
[0248]
(b8)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
[0249]
在一些实施方式中，所述促炎因子为ifn-γ。
[0250]
在一些实施方式中，所述炎症性单核细胞为ly6g

ly6c

cd11b

细胞。
[0251]“ifnar”是结合i型干扰素(包括干扰素-α和-β)的受体。“ifnar的特异性阻断剂”可以为化学试剂或生物试剂，其作用在于特异性阻断ifn-α/β与ifnar的特异性结合(例如，与ifn-α/β竞争性结合ifnar，或封闭ifn-α/β与ifnar结合位点)、或者可以使得ifnar减弱或失效，使其无法有效激活下游信号通路蛋白。
[0252]
在一些实施方式中，所述ifnar的特异性阻断剂为ifnar阻断抗体。这样的抗体也可称为中和抗体或功能性抗体。
[0253]
在一些实施方式中，所述ifnar的特异性阻断剂选自anifrolumab、faralimomab、medi-545、rontalizumab、sifalimumab、ags-009、ifnαkinoid、ni-0101中的一种或多种。
[0254]
medi-545是全人源147000道尔顿igg单克隆抗体(mab)，其结合大多数干扰素-α(ifn-α)亚型。medi-545是由100％人类蛋白质序列制成，从而使它成为全人源单克隆抗体。全人源单克隆抗体可具有超过其它形式的单克隆抗体(如嵌合和人源化抗体)的优势，因为其可能有更有利的安全性且可从人体不太快地消除，从而可能降低用药频率。medi-545源自igg4ic抗体(13h5)，它是基于功能分析而被选定，因为它具有用于潜在治疗剂的最令人满意属性。13h5随后转换为iggl抗体同型，在cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中产生，并选择作进一步表征和临床前开发，其中开始被指定为mdx-1103，现在被称为medi-545。
[0255]“anifrolumab”是一种抗干扰素α受体单克隆抗体，由阿斯利康公司研发，用于系统性红斑狼疮、狼疮肾炎等疾病的治疗。
[0256]“faralimomab”是指法拉莫单抗，是一种抗干扰素α单克隆抗体。
[0257]“rontalizumab”是指一种抗干扰素α单克隆抗体，又称罗利珠单抗，cas：948570-30-7。
[0258]“sifalimumab”是指西法木单抗，又称司法利木单抗，一种抗干扰素α单克隆抗体，cas：1006877-41-3。
[0259]“ags-009”是指一种抗干扰素α单克隆抗体，可以降低ifn-α水平，由argos公司研发。
[0260]“ifnαkinoid”可以诱导抗α干扰素(ifnα)抗体应答，从而降低ifn-α水平，又称ifn-k-001，由neovacs公司研发。
[0261]“ni-0101”是阻断tlr4的第一代人源性单克隆抗体。
[0262]
本发明的第三个方面，还涉及baff的特异性阻断剂在(c1)～(c7)中任一种中的用途；
[0263]
(c1)制备防治疾病的药物
[0264]
(c2)制备降低黄疸率的产品；
[0265]
(c3)制备降低igg4水平的产品；
[0266]
(c4)制备降低肝脏功能指标的产品；
[0267]
(c5)制备降低促炎因子水平的产品；
[0268]
(c6)制备提高kupffer细胞比例的产品；
[0269]
(c7)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
[0270]
在一些实施方式中，促炎因子为tnf-α、ifn-β和ifn-γ中的至少一种。
[0271]“baff”是指baff(b细胞活化因子或b淋巴细胞活化因子，b lymphocyte activating factor，b cell-activating factor，baff)、blys(blymphocyte stimulator)、thank(tnf homology that activates apoptosis，nuclear factor-κb and c-jun nh2-terminal kinase)或tall-1(tnf-and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)，于1999年被发现，属于肿瘤坏死因子超家族(tnf)的第17位成员，是含有285个氨基酸的跨膜蛋白，对于b细胞分化、免疫球蛋白类别转换和维持b细胞存活、抑制凋亡均具有重要的作用。baff通过与其受体结合发挥作用，其受体分别为b细胞成熟抗原(b cell maturation antigen，bcma)、穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and caml interactor，taci)、b细胞活化因子受体(ba ff receptor，baff-r)。3个受体中baff-r与baff的结合具有特异性，在baff发挥作用的过程中扮演着十分重要的角色。
[0272]
在一些实施方式中，“baff的特异性阻断剂”可以为化学试剂或生物试剂(例如抗体)，其作用在于特异性阻断baff与其受体(bcma、taci及baff-r中的至少一种)的特异性结合，或者可以使得baff的功能减弱或失效，使其无法有效激活下游信号通路蛋白。
[0273]
在一些实施方式中，所述用于baff的特异性阻断剂为baff的阻断抗体。这样的抗体也可称为中和抗体或功能性抗体。
[0274]
在一些实施方式中，所述baff的特异性阻断剂选自他贝鲁单抗、贝利单抗、anti baff scfv和anti baff scfv fc中的一种或多种。
[0275]“他贝鲁单抗”是指tabalumab，一种中和可溶性和膜结合b细胞激活因子的人单克隆抗体。
[0276]“贝利单抗(lymphostat b)”是指benlysta，又称lymphostat-b、贝利尤单抗，贝利单抗是作用于b淋巴细胞刺激因子的抑制剂，它是一种重组的完全人源化igg2λ单克隆抗体，可与可溶性baff高亲和力结合并抑制其活性。
[0277]
scfv，单链可变区，single-chain variable fragment，是由抗体重链可变区(heavy chain variable domain，vh)和轻链可变区(light chain variable domain，vl)通过一个10-25个氨基酸组成的柔性短肽(linker)连接而成，是最小的重组抗体形式(约27kda)。本质上，scfv是一种融合蛋白，并保留了原始免疫球蛋白对抗原的特异性。scfv较小的分子尺寸，带来了强大的肿瘤内穿透力、在血液中快速降解、人体内负反馈小等优势。
[0278]“anti baff scfv”是指抗baff的单链可变区抗体。
[0279]“anti baff scfv fc”是指抗baff的受体fc区域的单链可变区抗体。
[0280]
在本发明的第一、二、三个方面中，所述“疾病”包括感染性疾病、免疫性疾病或肿瘤。
[0281]
在一些实施方式中，所述感染性疾病为病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、支原体或衣原体感染。
[0282]
在一些实施方式中，所述病毒包括：腺病毒科(adenoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、星状病毒科(astroviridae)、本雅病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科
(caliciviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、单分子负链rna病毒目(mononegavirales)、网巢病毒目(nidovirales)、小rna病毒科(picornaviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)以及披膜病毒科(togaviridae)中的一种或多种。
[0283]
在一些实施方式中，所述细菌为革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌，例如包括：葡萄球菌属、链球菌属、李式杆菌属、丹毒丝菌属、肾杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、分支杆菌属、放线菌属、奴卡菌属、棒状杆菌属、红球菌属、炭疽杆菌、丹毒杆菌、破伤风杆菌、李氏杆菌、气肿疽杆菌结核杆菌、大肠杆菌外、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡他摩拉克氏菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌以及副溶血性杆菌中的一种或多种。
[0284]
在一些实施方式中，所述真菌包括：粗球孢子菌、普赛德斯球抱子菌、荚膜组织胞浆菌、杜氏组织胞浆菌、洛博芽生菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、申克氏孢子丝菌、马尔尼菲青霉菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、葡萄牙假丝酵母、曲霉菌、甄氏外瓶霉、裴氏着色霉、紧密着色霉、疣状着色霉、皮炎着色霉、白地霉、波氏足肿菌、新型隐球菌、丝孢酵母菌、米根霉、印度毛霉、伞枝犁头霉、总状共头霉、蛙粪霉、冠状耳霉、异孢耳霉、西伯鼻孢子菌、透明丝孢霉以及暗色丝孢霉中的一种或多种。
[0285]
在一些实施方式中，所述寄生虫包括：消化道内寄生虫、肝内寄生虫、肺内寄生虫、脑组织寄生虫、血管内寄生虫、淋巴管内寄生虫、肌肉组织寄生虫、细胞内寄生虫、骨组织寄生虫以及眼内寄生虫中的一种或多种。
[0286]
在一些实施方式中，所述免疫性疾病选自：系统红斑狼疮、多发性硬化症、i型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、类风湿关节炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本氏甲状腺炎、addisons病、白斑、graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管炎、自身免疫性噬中性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎縮性胃炎、自身免疫性不育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮以及致密沉积物疾病。
[0287]
在一些实施方式中，所述肿瘤选自：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、血液、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、瘠髓、脑瘠液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。
[0288]
在一些实施方式中，所述疾病为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
[0289]
本发明的第四个方面，还涉及预防和/或治疗胆道闭锁的药物组合物，该药物组合物包含a)、b)和c)中的至少一种：进一步地，包含a)、b)和c)中的至少两种；更进一步地，包含a)、b)和c)；
[0290]
a)本发明第一方面的抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂；
[0291]
b)本发明第二方面的ifnar的特异性阻断剂；
[0292]
c)本发明第三方面的baff的特异性阻断剂。
[0293]
根据本发明的第一、二、三、四方面，所述药物或药物组合物，还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲质、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。此类材料应当是非毒性的并且不应干扰活性成分的功效。此类材料可以包括，任何一种溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂以及和前述所列材料生理学相容的物质等。药学上可接受的载体可以是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其组合。在许多情况下，所述药物组合物中可以包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。药学上可接受的其他材料还可以是湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲质，其增强抗体的保存期或效用。载体或其他材料的精确性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服、局部、通过吸入或通过注射，例如静脉内。本发明可选的给药方式是静脉注射或腹腔注射；也可以通过任何已知的给药方法施用本发明的用于抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂，例如，从口服、皮粘膜给药(如表面、舌下、鼻腔内和直肠)，非肠道给药(如，经皮下注射、肌内注射、关节内注射、静脉注射、动脉注射)及吸入法给药等中进行适当地选择。因此，具体的给药方式包括，但不限于例如口服、经皮、粘膜、舌下、肌内、静脉、腹膜内、皮下给药及局部用药。
[0294]
对于静脉内注射，或在痛苦部位(例如肿瘤部位)注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pk、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员将能够容易地例如使用等渗媒介物例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸盐林格注射液来制备合适的溶液。需要时，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲质、抗氧化剂和/或其他添加剂。经静脉注射给药的药物，一般是固体的灭菌组合物形式。这些组合物还可以含有添加剂，特别是甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸等。在使用时溶解于灭菌注射用水或其它注射用灭菌介质中。
[0295]
经静脉注射给药的人尿激肽原酶组合物也可以是水溶液形式。组合物还可以含有添加剂，特别是甘露醇、氯化钠、葡萄糖等。
[0296]
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或液体形式，例如含有惰性稀释剂或可同化的可食用载体。片剂可以包含固体载体例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。特异性结合成员(需要时，以及其他成分)还可包封在硬或软壳明胶胶囊内，压缩成片剂，或直接掺入受试者饮食中。对于口服治疗施用，活性成分可以与赋形剂相掺合，并以可吸收的片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式进行使用。为了通过除肠胃外施用以外的其他方式施用本发明的化合物，可能必需用防止其失活的材料包被所述化合物或将所述化合物与所述材料共施用。
[0297]
所述药物或药物组合物可制备为制剂形式，所述制剂可选为单位剂量形式。在这种形式中，制剂被细分为含有合适量的活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装的制剂，该包装含有分立的制剂量，诸如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉剂。而且，单位剂量形式可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是合适数量的这些剂量形式中任
意一种的包装形式。用于口服给药的片剂或胶囊和用于静脉内给药和持续输注的液体是可选的组合物。
[0298]
在一些实施方式中，所述制剂为冻干粉剂。所述冻干粉剂的制备方法为本领域常规制备方法，例如为：原料
→
预冻
→
缓慢冻结或快速冻结
→
真空
→
升华干燥
→
检测包装。
[0299]
在一些实施方式中，所述制剂为注射剂。
[0300]
在一些实施方式中，所述制剂为口服液体注射胶囊。口服液体注射胶囊为近年来改善单克隆抗体等生物大分子药物的使用困境，来自麻省理工学院的工程师团队与医药公司诺和诺德的科学家携手研发出一种新型的药物递送方式。患者只需口服一颗小“药丸”，药丸会在进入胃部后自动插入胃壁向全身释放单克隆抗体药物或其他生物大分子药物。
[0301]
特别地，对于抗体而言，施用的剂量可以是0.1μg/kg到100mg/kg患者体重。例如0.1mg/kg到20mg/kg患者体重，1mg/kg到10mg/kg患者体重。通常，由于对外来多肽的免疫反应，全人抗体或人源化抗体在人体中比来自其他物种的抗体有更长的半寿期。从而，较低剂量的全人抗体或人源化抗体和较低频率的施用通常是可能的。此外，通过修饰，如脂化，增强抗体的摄入和组织穿透(例如，进入脑)可以减少抗体的剂量和施用频率。本发明还涉及用于治疗、预防、减轻和/或缓解疾病例如胆道闭锁的方法，其包括给予受试者给予有效量的如上所述用于抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂、或如上所述的用于ifnar的特异性阻断剂、或所述用于治疗胆道闭锁的药物的步骤。
[0302]
本发明中所述的术语“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明中所述疾病或病症的剂量。
[0303]
本发明中所述的术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明所述试剂或药物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的动物，受试者包括温血动物，诸如哺乳类，像是灵长类，且较佳地是人类。非人类的灵长类也是个体。用语个体包括驯养动物，诸如猫、狗等，家畜(举例来说，牛、马、猪、绵羊、山羊等)以及实验动物(举例来说，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。
[0304]
在一些实施方式中，本发明的受试者为人类中的儿童或成人。因此，药物或药物组合物可制备为儿童适用的剂型或成人适用的剂型。所述儿童包括出生28天内的新生儿、1岁以内的婴儿、1-6岁的幼儿、以及6岁以上18岁以下的儿童；所述成人可选自妊娠期的女性成年人、围产期的女性成年人或哺乳期的女性成年人。
[0305]
在一些实施方式中，所述方法涉及的给药方式为一次性给药或间隔多次给药。
[0306]
本发明还涉及一些疾病例如胆道闭锁或其导致的肝纤维化/肝硬化的标志物。
[0307]“标志物”或“生物标志物”是指与另一种表型状态(例如未患有疾病)相比，在取自一种表型状态(例如患有疾病)的受试者的样品中差别存在的有机生物分子，是要用作分析患者实验样品的靶标的分子，在本文中有时也用“待检测物”来指代。这样的分子靶标的实例可以是蛋白、多肽、基因，或它们的片段、变体、复合物或可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
[0308]
如果在不同组中生物标志物的平均或中位水平、例如表达水平经计算为统计学显著的，则生物标志物在不同的表型状态中差别存在。统计学显著性的常见检验特别包括t-检验、anova、kruskal-wallis、wilcoxon、mann-whitney和优势比。单独或组合的生物标志物提供受试者属于一种表型状态或另一种表型状态的相对风险的度量。因此，它们用作标
志物，例如，用于疾病(预后和诊断)、药物的治疗功效(治疗诊断学)的标志物。
[0309]
标志物的“水平”或生物标志物的“水平”是指在待测试的样品中存在的标志物的量。标志物的水平可以是绝对水平或量(例如μg/ml)或相对水平或量(例如相对信号强度)。标志物的“更高水平”或“水平增加”是指大于用于评估标志物水平的测定法的标准误差的试验样品中的标志物水平，和优选为对照样品中标志物水平。标志物的“更低水平”或“水平降低”是指小于用于评估标志物水平的测定法的标准误差的试验样品中的标志物的水平，和优选为对照样品中标志物水平。术语“已知的标准水平”或“对照水平”是指标志物的公认的或预定的水平，其用于比较源自受试者的样品中的标志物的水平。在一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自非胆道闭锁疾病，例如正常健康、胆总管囊肿或生理性黄疸受试者的样品中的标志物的水平。
[0310]
本发明的第五个方面，检测igm和igg4比值的试剂(简称试剂1)在制备用于胆道闭锁预后分析的试剂盒中的用途。
[0311]
其中igm/igg4比值增加，例如全血/血清/血浆中的含量或浓度比值的增加，是胆道闭锁预后良好的标志。
[0312]
在一些实施方式中，所述胆道闭锁预后良好是葛西手术术后预后良好。
[0313]
在一些实施方式中，所述葛西手术术后预后良好的主要指标是体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低等中的至少一项。例如，体重相对于同龄参考水平增加、黄疸减轻、5年或10年生存率增加、肝纤维程度减轻，所述增加或减轻的程度例如与参考水平相差≥10％，包括大约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，肝脏纤维化程度则根据本技术表1的标准降低1级及以上；同龄参考水平的获得例如选预后较差人群的参考水平。
[0314]
本发明的第六个方面，还涉及用于检测igg的试剂(简称试剂2)和/或检测igm的试剂(简称试剂3)在制备胆道闭锁诊断试剂盒中的用途。
[0315]
在一些实施方式中，所述检测igg的试剂包括用于检测肝脏中igg的试剂。
[0316]
其中，igg相对于同龄参考水平增加是胆道闭锁的指征；同龄参考水平的获得选自非胆道闭锁疾病，例如正常健康、胆总管囊肿或生理性黄疸受试者。
[0317]
其中，igm相对于同龄参考水平降低是胆道闭锁的指征；同龄参考水平的获得选自非胆道闭锁疾病，例如正常健康、胆总管囊肿或生理性黄疸受试者。
[0318]
在一些实施方式中，所述igg是ro/ssa特异性igg。
[0319]
在一些实施方式中，所述igm包括dsdna特异性igm、nucleosome特异性igm、rnp特异性igm和ro/ssa特异性igm中的至少一种。
[0320]
本发明的第七个方面，还涉及标志物组合，包括r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil。
[0321]
其中，r-gt、alt、ast、tba、dbil相对于同龄参考水平的增加联合ibil相对于同龄参考水平的下降是胆道闭锁的指征，同龄参考水平的获得选自非胆道闭锁疾病，例如正常健康、胆总管囊肿或生理性黄疸受试者。
[0322]
本发明的第八个方面，还涉及检测本发明第七方面的标志物组合的试剂(简称试剂4)在制备胆道闭锁诊断试剂盒中的用途。
[0323]
本发明的第九个方面，还涉及检测baff的试剂(简称试剂5)在制备胆道闭锁诊断
试剂盒中的用途。
[0324]
在一些实施方式中，所述检测baff的试剂是检测baff的蛋白质水平或mrna水平的试剂。
[0325]
当baff相对于同龄参考水平增加，则诊断为胆道闭锁，同龄参考水平的获得选自非胆道闭锁疾病，例如正常健康、胆总管囊肿或生理性黄疸受试者。
[0326]
baff水平与肝脏纤维化呈正相关，当所述受试者诊断为胆道闭锁后，baff水平越高，则诊断为胆道闭锁疾病肝纤维化程度越严重。
[0327]
如前所述，“baff”是b细胞活化因子，属于tnf家族成员。进一步地，已知，baff可以以三种形式存在：膜结合型(mbbaff)，可溶性三聚baff(sbaff)和由60个baff单体组成的多聚形式。
[0328]“膜结合型b细胞活化因子(mbbaff)”是指膜结合型baff(mbbaff)，膜结合性baff作为典型的ii型跨膜蛋白，n端位于细胞内，c端位于细胞外。
[0329]“可溶性三聚b细胞活化因子(sbaff)”又称溶解型baff，溶解型baff是膜结合型baff经蛋白酶剪切得到的分子量为17kd的小分子可溶性片段，其中可溶性片段具有生物学活性，以单体或同源三聚体形式进入外周血循环。
[0330]“可溶性60-merb细胞活化因子”是指可溶性baff结晶的60聚体。
[0331]
在本发明的第五、六、七、八、九个方面中，所述胆道闭锁为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
[0332]
在本发明的第五、六、七、八、九个方面中，所述“诊断”包括辅助诊断和/或预后分析。
[0333]
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在胆道闭锁中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物或生化指标来以某种可能性或预测值评估胆道闭锁的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
[0334]
为表述方便，下面用试剂a同时指代试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、试剂5中的任意一种。
[0335]
在一些实施方式中，试剂a为定量检测剂。
[0336]
在一些实施方式中，所述试剂a用于执行以下任一种或者多种方法：
[0337]
间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、放射免疫法、免疫双扩散法、对流免疫电泳法、胶体金法或胶体金标斑点免疫渗滤法、流式细胞术、免疫组织化学分析法、生物质谱法、电泳法、色谱法、酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹法等。
[0338]“间接免疫荧光法”是指间接免疫荧光试验，是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原-抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体。
[0339]“颗粒凝集法”是通过向不溶性载体固定化抗体，然后向其混合含作为测定对象的抗原的试样，引发基于抗原-抗体反应的免疫凝集反应，对成为测定对象的抗原进行测定的
方法。涉及的方法为了提高检测灵敏度，使用的抗体也优选使用识别多克隆抗体等的多用的表位的多种抗体。因为通过1个抗原分子与多个抗体(不溶性载体)结合而发生凝集。也可在其代替各抗体分子之中有亲和性低的。
[0340]“抗体确认实验检测法”是指在抗体初筛的基础上确认，目前可用于确认的方法有：
①
免疫印迹法(wb)；
②
条带免疫实验法(lia)；
③
免疫荧光实验法(ifa)；
④
放射免疫沉淀实验(ripa)；
⑤
病毒分离法等，在临床上应用较多的是wb法和lia法。
[0341]“快速诊断试剂法”是较便捷且灵敏度高的实验方法，利用病毒与试剂间发生的化学反应来取得实验结果。
[0342]“放射免疫法”是指利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。又称竞争性饱和分析法(radioimmuneassay，ria)。
[0343]“免疫双扩散法”是指抗原与抗体在同一凝胶中扩散的方法(double immunodiffusion assay)，是观察可溶性抗原与相应抗体反应和抗原抗体鉴定的最基本方法之一。其原理为相应的抗原与抗体，在琼脂凝胶板上的相应孔内，分别向周围自由扩散。在抗原和抗体孔之间，扩散的抗原与抗体相遇而发生特异性反应，并于两者浓度比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线，证明有抗原和抗体反应发生。若将待检抗体做系列倍比稀释，根据白色沉淀线逐渐消失的情况可测定抗体效价。
[0344]“对流免疫电泳法”是免疫电泳技术中的一种，还包括免疫电泳、火箭电泳等方法。在ph值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。如将抗原置阴极，抗体置阳极，电泳时，两种成分相对泳动，一定时间后抗原和抗体将在两孔之间相遇，并在比例适当的地方形成肉眼可见的沉淀线。这样由于电泳的作用，不仅帮助抗体定向移动，因而加速了反应的出现，而且也限制了琼脂扩散时，抗原抗体向四周自由扩散的倾向，因而也提高了敏感性，本法比琼脂扩散法的灵敏度要高10～16倍，而且反应时间短，可用于各种蛋白的定性和半定量测定。
[0345]“胶体金法”是一种将抗原抗体免疫反应与胶体金标记示踪技术结合用于抗原、抗体含量定性定量检测的技术。目前，胶体金检测平台常用的检测方法有双抗夹心法、竞争法、间接法等，不同检测方法检测原理及适合检测的物质不同。其中，“胶体金标斑点免疫渗滤法”是指在斑点免疫渗滤测定法基础上，改用胶体金标记物代替酶，省去底物显色的步骤。试验方法是以硝酸纤维素膜(nc膜)为载体，将试剂及标本滴加在膜上，通过渗滤而逐步反应。全过程可于数分钟内完成，阳性结果在膜上呈红色斑点。
[0346]“流式多因子检测法”是指细胞因子微球检测技术，细胞因子微球检测技术(cytometric bead array，cba)是一种基于流式细胞仪上的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个细胞因子指标进行检测，对样本量的要求更少，具有更高的灵敏度、更宽的检测范围和更好的重复性。
[0347]“生物质谱法”是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析。双向凝胶电泳分离的蛋白质点数目多、量少，其鉴定方法是利用蛋白质的各种属性参数如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。
[0348]“电泳法”是指是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(％)的方法。
[0349]“色谱法”是一种分离和分析方法，又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”。
[0350]“酶联免疫吸附试验”是是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的elisa法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
[0351]“免疫荧光法”是指将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
[0352]“免疫化学发光法”亦称化学发光标记免疫测定法，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体(化学发光剂标记物)，与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。用酶标记的抗半抗原抗体或抗生物素蛋白与之结合，结合于半抗原上的酶标记抗体或抗生物素蛋白能催化化学发光底物发光。如抗体分子以吖啶酯标记，加触发剂激活后发光，用于检测固相化的抗原。
[0353]“免疫比浊法”是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
[0354]“免疫印迹法”是指将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
[0355]“斑点印迹”是指一种定性检测核酸或蛋白质的技术。即将待测核酸或蛋白点样于固相载体上，以同位素或非同位素标记探针与之杂交，通过显影或显色而进行检测。
[0356]
在一些实施方式中，试剂a通常是特异性的试剂，例如，待检测物的配体或受体(如果存在的话)、结合待检测物的凝集素、结合待检测物的适配体或结合待检测物的抗体及抗体片段。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性的结合剂可选对其靶分子具有108l/mol、或更可选109l/mol的亲和力。
[0357]
在一些实施方式中，所述试剂a为待检测物的特异性抗体。
[0358]
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
[0359]
本发明的第十个方面，还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：d1)～d5)中的至少一种：
[0360]
d1)本发明第五方面中的检测igm和igg4比值的试剂(简称试剂1)；
[0361]
d2)本发明第六方面中的检测igg的试剂(简称试剂2)；
[0362]
d3)本发明第六方面中的检测igm的试剂(简称试剂3)；
[0363]
d4)本发明第八方面中的检测r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil的试剂(简称试剂
4)；
[0364]
d5)本发明第九方面中的检测baff的试剂(简称试剂5)。
[0365]
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
[0366]
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括抗体包被的酶标板、阴性对照液、阳性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。
[0367]
上文所述的材料，以及其他材料，可以以任何适合的组合包装在一起作为试剂盒，其可用于执行或辅助进行所公开的方法。将试剂盒构成进行设计和调适以用于所公开的方法是有用的。
[0368]
本发明的第十一个方面，还涉及一种胆道闭锁的诊断方法，所述方法包括：使用试剂1～试剂5中的至少一种或本发明第十方面的试剂盒检测待检测物。
[0369]
在一些实施方式中，所述待检测物选自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织/组织裂解液、精液、唾液样品、羊水和绒毛中的至少一种。
[0370]
本文使用的“组织裂解物”也可与“裂解物”、“裂解的样品”、“组织或细胞提取物”等用语通用，表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。
[0371]
特别地，组织/组织裂解液来自肝脏。
[0372]
在本发明的第一至第十一方面中，
[0373]“ro/ssa”是指核糖核蛋白抗原，是含有小的细胞质rna的核糖核蛋白。ro/ssa抗原的蛋白成分是一种60-kd蛋白质(60-kd ro/ssa，ro60)，与几个小细胞质rna分子之一结合。ro/ssa抗原的另一种成分是52-kd肽(52-kd ro/ssa，ro52)。la/ssb抗原由含有408个氨基酸的多肽构成。60-kd ro/ssa和la/ssb蛋白都是一种rna结合蛋白家族的成员，该家族含有被称为rna识别基元(rnp)的80个氨基酸的序列。
[0374]“igg”是指抗体的免疫球蛋白g类(immunoglobulin g)，在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。igg抗体持续时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。它们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿第一时间得到抗体保护。igg是四链单体，占血清ig总量的75％，是血清和细胞外液中最主要的抗体成分，可将人igg分为四个亚类，依其在血清中浓度高低，分别为igg1、igg2、igg3、igg4。igg自出生后三个月开始合成，三到五岁接近成人水平。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生，血清半衰期较长，约20-23天，是再次体液免疫应答产生的主要抗体，其亲和力高，在体内广泛分布，具有重要的免疫效应，是机体抗感染的主力军。
[0375]“胆总管囊肿”又称小儿先天性胆管扩张症((choledochal cyst，cc))为临床上最常见的一种先天性胆道畸形。其病变主要是指胆总管的一部分呈囊状或梭状扩张，有时可伴有肝内胆管扩张的先天性畸形。女性发病高于男性，约占总发病率的60％～80％。又称为先天性胆总管囊肿、先天性胆总管扩张症、原发性胆总管扩张等。近年，随着对本症研究的深入，发现除了胆总管的囊性扩张之外，约有半数的患者仅表现为胆总管的梭形或圆柱形扩张，而非巨大的囊肿。另外除了肝外胆总管的扩张外，约1/4的病例同时合并有肝内胆管
β。它是一种异聚细胞表面受体，由一条带有两个亚基的链组成，称为ifnar1和ifnar2。在结合i型ifn后，ifnar激活jak-stat信号传导途径。干扰素刺激导致抗病毒免疫应答。
[0391]“mmp7”是指基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinases-7，mmp-7)，已有运用双抗体夹心elisa法定量测定人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清或其它相关生物液体中mmp7含量的试剂盒，以及将mmp7检测试剂盒应用于胆道闭锁诊断的报道(例如cn 108267585 a)，本发明在发明人发现的baff的基础上引入mmp7作为胆道闭锁的二联检，应用于试剂盒等产品的制备中，以达到进一步提高胆道闭锁疾病诊断准确性的目的。
[0392]“胆道闭锁”是指胆道闭锁(biliary atresia，ba)，是婴儿期常见的严重肝胆系统疾病之一，以肝内、外胆管进行性炎症和纤维化为特征；如不及时治疗，晚期会出现胆汁性肝硬化、门静脉高压、肝衰竭，是一种病因不明的波及肝内、外胆管闭塞性病变，导致胆汁淤积及进行性肝纤维化直至肝硬化并危及患儿生命的疾病。临床表现为：(1)生后黄疸延迟消退(足月儿大于2周，早产儿大于3周)，或消退后再次出现，并持续性加重。(2)粪便颜色逐渐变浅至白陶土色，尿色加深至浓茶色。(3)腹部膨隆，肝脾肿大，腹壁静脉曲张等。(4)由于脂溶性维生素吸收障碍导致营养不良或生长发育迟缓。
[0393]“肝纤维化”是指肝脏中肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝细胞之间的胶原蛋白等细胞外基质的增生与降解失去平衡，表现为胶原蛋白增生过多或者胶原蛋白降解减少，进而导致肝脏内肝细胞之间、肝小叶之间的纤维结缔组织异常沉积的病理过程，少量的胶原蛋白沉积称为肝纤维化，大量的胶原蛋白沉积，伴有肝小叶结构改建，假小叶生成及其特殊结节形成，就可以逐渐演化为为肝硬化、肝癌等，严重危害着人们的健康。
[0394]“胆道闭锁导致的肝纤维化/肝硬化”，是指胆道闭锁疾病引发的并发性肝纤维化，并且该类肝纤维化并且发展迅速，通常在几个月内即发展为肝硬化。胆道闭锁疾病激活的通路产生大量炎性介质损伤肝细胞和胆管细胞，释放各种促炎因子、氧代谢产物和细胞因子，进一步加重肝、胆系统损伤造成肝星形细胞异常快速地激活并转化为成纤维细胞，快速促进了肝纤维化/肝硬化进程。
[0395]“肝纤维化程度”是指根据肝纤维化ishak评分系统进行评价肝脏纤维化的程度，共有0、1、2、3、4、5、6级，具体评价标准见本技术表1。
[0396]
关于本发明的具体实施方式更详细描述如下。
[0397]
一、抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂在治疗胆道闭锁中的用途
[0398]
(1)用于抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂在(a1)～(a8)中任一种中的用途；
[0399]
(a1)制备治疗胆道闭锁的药物；
[0400]
(a2)制备降低黄疸率的产品；
[0401]
(a3)制备降低促炎因子水平的产品；
[0402]
(a4)制备抑制rrv病毒基因表达的产品；
[0403]
(a5)制备提高cx3cl1和c1q水平的产品；
[0404]
(a6)制备抑制自身反应性cd8

t细胞活化的产品；
[0405]
(a7)制备提高kupffer细胞比例的产品；
[0406]
(a8)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
[0407]
(2)根据上述(1)所述的用途，所述试剂为mhc-i和/或ii的阻断抗体。
[0408]
(3)根据上述(2)所述的用途，所述试剂为mhc-i和mhc-ii的双特异性阻断抗体。
[0409]
(4)根据上述(2)所述的用途，所述阻断抗体是单克隆抗体。
[0410]
(5)根据上述(4)所述的用途，所述阻断抗体是hla-dr的阻断抗体。
[0411]
(6)根据上述(5)所述的用途，所述hla-dr的阻断抗体选自immu-114、hu1d10和lym-1中的至少一种。
[0412]
(7)根据上述(2)所述的用途，所述试剂为mhc-i和/或ii的嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体或全人抗体。
[0413]
(8)根据上述(1)所述的用途，所述试剂为阻断mhc-i和/或ii的抗体片段。
[0414]
(9)根据上述(8)所述的用途，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfv-fc、双特异抗体和抗体最小识别单位。
[0415]
(10)根据上述(1)-(9)任一项所述的用途，所述药物包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲质和稳定剂中的至少一种。
[0416]
(11)根据上述(1)-(10)任一项所述的用途，所述药物为冻干粉剂或注射剂。
[0417]
(12)根据上述(1)-(11)任一项所述的用途，所述药物制备成适用于成人或儿童的剂型；优选地，所述药物制备成适用于儿童的剂型。
[0418]
(13)根据上述(1)-(12)任一项所述的用途，所述促炎因子为ifn-γ。
[0419]
(14)根据上述(1)-(13)任一项所述的用途，所述rrv病毒基因包括nsp3和vp6中的至少一种。
[0420]
(15)根据上述(1)-(14)任一项所述的用途，所述胆道闭锁为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
[0421]
二、igm/igg4比值在胆道闭锁预后伴随诊断中的用途
[0422]
(1)检测igm和igg4比值的试剂在制备用于胆道闭锁预后分析的产品中的用途；优选地，所述产品选自检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒；优选地，所述比值为含量比值或浓度比值。
[0423]
(2)根据上述(1)所述的用途，所述胆道闭锁预后分析为胆道闭锁进行葛西手术术后的预后分析。
[0424]
(3)根据上述(1)～(2)任一所述的用途，所述预后分析包括步骤1)，测定来自受试者的样品中igm和igg4的比值；优选地，所述预后分析还包括步骤2)，将1)中所述的比值与参考水平比较。
[0425]
(4)根据上述(3)所述的用途，当预后分析包括步骤1)时，igm和igg4的比值＞0.01，优选≥0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05或0.055，则指示胆道闭锁预后良好；当包括步骤1)和步骤2)时，igm和igg4的比值相对参考水平升高，则指示胆道闭锁预后良好。
[0426]
(5)根据上述(3)-(4)任一所述的用途，所述参考水平是来自胆道闭锁预后较差的患者样品中的igm和igg4比值。
[0427]
(6)根据上述(4)所述的用途，所述胆道闭锁预后良好包括体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低中的一种或多种。
[0428]
(7)根据上述(3)所述的用途，所述受试者的样本为全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清液中的一种或多种；优选地，所述组织或组织
裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
[0429]
(8)根据上述(1)-(7)任一所述的用途，所述胆道闭锁预后分析的产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0430]
(9)根据上述(1)-(8)所述的用途，所述用于胆道闭锁预后分析的产品包括抗人igm和抗人igg4。
[0431]
(10)根据上述(1)-(9)所述的用途，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
[0432]
(11)一种胆道闭锁预后分析的试剂盒，所述试剂盒包括检测igm和igg4比值的试剂，优选地，所述比值为含量比值或浓度比值。
[0433]
(12)根据上述(11)所述的试剂盒，所述胆道闭锁预后分析为胆道闭锁进行葛西手术术后的预后分析。
[0434]
(13)根据上述(11)-(12)任一所述的试剂盒，所述预后分析包括以下步骤1)，或包括以下步骤1)和2)：
[0435]
1)测定来自受试者的样品中的igm和igg4比值；
[0436]
2)将1)中所述的比值与参考水平进行比较。
[0437]
(14)根据上述(13)所述的试剂盒，当包括步骤1)时，igm和igg4的比值＞0.01，优选≥0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05或0.055，则指示胆道闭锁预后良好；当包括步骤1)和2)时，igm和igg4的比值相对参考水平升高，则指示胆道闭锁预后良好。
[0438]
(15)根据上述(13)-(14)任一所述的试剂盒，所述参考水平是来自胆道闭锁预后较差的患者样品中的igm和igg4比值。
[0439]
(16)根据上述(14)所述的试剂盒，所述胆道闭锁预后良好包括体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低中的一种或多种。
[0440]
(17)根据上述(13)所述的试剂盒，所述受试者的样品为全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清液中的一种或多种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
[0441]
(18)根据上述(11)-(17)任一所述的试剂盒，所述胆道闭锁预后分析的试剂盒适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0442]
(19)根据上述(11)-(18)任一所述的试剂盒，所述试剂盒包括抗人igm和抗人igg4。
[0443]
(20)根据上述(11)-(19)任一所述的试剂盒，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
[0444]
(21)根据上述(11)-(20)任一所述的试剂盒，所述试剂盒的受试者为儿童或成人，
优选儿童。
[0445]
(22)igm和igg4的比值作为胆道闭锁预后分析的标志物中的用途，优选地，所述比值为含量比值或浓度比值。
[0446]
(23)根据上述(22)所述的用途，所述胆道闭锁预后分析为胆道闭锁进行葛西手术术后的预后分析。
[0447]
(24)根据上述(22)-(23)任一所述的用途，当igm和igg4的比值相对于参考水平升高，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁预后良好。
[0448]
(25)根据上述(24)所述的用途，所述参考水平从胆道闭锁预后较差的患者样品中的igm和igg4比值确定。
[0449]
(26)根据上述(25)所述的用途，所述参考水平的igm和igg4比值为0～0.01。
[0450]
(27)根据上述(24)所述的用途，所述胆道闭锁预后良好包括体重增加、黄疸减轻或消失、生存时间延长、肝脏纤维化程度降低中的一种或多种。
[0451]
(28)根据上述(22)-(27)所述的用途，所述标志物来自于全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清、血浆、组织或组织裂解液、细胞培养上清液中的一种或多种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
[0452]
(29)根据上述(22)-(28)任一所述的用途，所述igm和igg4的比值是通过以下检测方法中的一种或多种检测得到：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0453]
(30)根据上述(22)-(29)任一所述的用途，所述标志物从儿童或成人中检测得到，优选从儿童中检测得到。
[0454]
三、ro/ssa特异性igg自身抗体在胆道闭锁诊断中的用途
[0455]
(1)检测igg的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途，优选地，所述产品包括检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
[0456]
(2)根据上述(1)所述的用途，所述igg是ro/ssa特异性igg；优选地，当igg抗体相对于参考水平增加，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
[0457]
(3)根据上述(1)-(2)任一所述的用途，所述产品检测的样本包括来自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织/组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种。
[0458]
(4)根据上述(3)所述的用途，所述产品检测的样本选自组织或组织裂解液、全血、血清、血浆中的至少一种，优选地，所述组织/组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
[0459]
(5)根据上述(1)-(4)任一所述的用途，所述产品还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
[0460]
(6)根据上述(1)-(5)任一所述的用途，所述产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫
吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0461]
(7)根据上述(1)-(6)任一所述的用途，所述产品包括抗人igg抗体，优选为抗人ro/ssa特异性igg自身抗体。
[0462]
(8)根据上述(1)-(7)任一所述的用途，所述产品还包括检测igm抗体的试剂；优选地，所述igm抗体为天然igm抗体；进一步优选地，所述igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种；优选地，当所述igm抗体相对于参考水平降低，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
[0463]
(9)根据上述(1)-(8)任一所述的用途，所述产品还包括检测baff的试剂；优选地，当baff相对于参考水平升高，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
[0464]
(10)根据上述(1)-(9)所述的用途，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
[0465]
(11)胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物，所述标志物包括：
[0466]
a)igg抗体；和/或
[0467]
b)igm抗体；和/或
[0468]
c)baff。
[0469]
(12)根据上述(11)所述的标志物，所述igg是ro/ssa特异性igg；优选地，所述igm抗体为天然igm抗体；优选地，所述天然igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种。
[0470]
(13)根据上述(11)-(12)任一所述的标志物，当igg自身抗体相对于参考水平增加，和/或igm抗体相对于参考水平降低，和/或baff相对于参考水平升高，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
[0471]
(14)根据上述(11)-(13)任一所述的标志物，所述标志物从儿童或成人中检测得到，优选从儿童中检测得到。
[0472]
(15)一种胆道闭锁的诊断或辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
[0473]
a)检测igg抗体的试剂；和/或
[0474]
b)检测igm抗体的试剂；和/或
[0475]
c)检测baff的试剂。
[0476]
(16)根据上述(15)所述的试剂盒，所述igg是ro/ssa特异性igg；优选地，当检测到igg抗体相对于参考水平增加，和/或baff相对于参考水平升高，和/或igm抗体相对于参考水平降低，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者。
[0477]
(17)根据上述(15)-(16)任一所述的试剂盒，所述igm抗体为天然igm抗体；优选地，所述igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种。
[0478]
(18)根据上述(15)-(17)任一所述的试剂盒，所述试剂盒适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、流式多因子检测法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0479]
(19)根据上述(15)-(18)所述的试剂盒，所述试剂盒的样本包括来自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种。
[0480]
(20)根据上述(15)-(19)任一所述的试剂盒，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
[0481]
(21)根据上述(15)-(20)任一所述的试剂盒，所述试剂盒的受试者为儿童或成人，优选儿童。
[0482]
(22)igg抗体作为胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物的用途。
[0483]
(23)根据上述(22)所述的用途，所述igg是ro/ssa特异性igg；优选地，所述标志物还包括igm抗体和/或baff。
[0484]
(24)根据上述(23)所述的用途，所述igm抗体为天然igm抗体；优选地，所述igm抗体为抗双链dna的igm抗体、抗核小体的igm抗体、抗核糖核蛋白的igm抗体、抗ro/ssa的igm抗体中的一种或多种。
[0485]
(25)根据上述(22-(24)所述的用途，所述标志物采样自全血、血清或血浆。
[0486]
四、肝功能生化指标在胆道闭锁诊断中的用途
[0487]
(1)检测肝功能生化指标的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途，所述肝功能生化指标包括r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil；优选地，所述产品包括检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒。
[0488]
(2)根据上述(1)所述的用途，r-gt、alt、ast、tba、dbil相对于参考水平的增加联合ibil相对于参考水平的下降，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
[0489]
(3)根据上述(1)-(2)任一所述的用途，所述产品还包括如下检测试剂中的一种或多种：检测ggt的试剂、检测igg4的试剂、检测tbil的试剂、检测ifn-β的试剂。
[0490]
(4)根据上述(3)所述的用途，ggt、igg4、tbil、ifn-β中的一种或多种相对于参考水平的增加，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
[0491]
(5)根据上述(1)-(4)任一所述的用途，所述胆道闭锁诊断或辅助诊断试剂盒的受试样本包括来自受试者的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织/组织裂解液、细胞培养上清液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清或血浆。
[0492]
(6)根据上述(1)-(5)任一所述的用途，所述胆道闭锁诊断或辅助诊断产品适用于
执行以下检测方法中的一种或多种：生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0493]
(7)根据上述(1)-(6)任一所述的用途，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
[0494]
(8)胆道闭锁的诊断或辅助诊断标志物，所述诊断或辅助诊断标志物包括r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil。
[0495]
(9)根据上述(8)所述的标志物，当r-gt、alt、ast、tba、dbil相对于参考水平的增加联合ibil相对于参考水平的下降，则诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
[0496]
(10)根据上述(8)或(9)的标志物，所述诊断或辅助诊断标志物还包括ggt、igg4、tbil、ifn-β中的一种或多种；优选地，当ggt、igg4、tbil、ifn-β中的一种或多种相对于参考水平的增加，则进一步诊断或辅助诊断为胆道闭锁，其中，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、胆总管囊肿或生理性黄疸的同年龄段受试者。
[0497]
(11)根据上述(8)-(10)任一所述的标志物，所述标志物从儿童或成人中检测得到，优选从儿童中检测得到。
[0498]
(12)检测上述(8)-(11)任一所述的标志物的试剂在制备胆道闭锁诊断或辅助诊断产品中的用途，所述产品包括诊断试剂、检测芯片、试剂盒。
[0499]
(13)根据上述(12)所述的用途，其特征在于，所述产品的检测样本或受试样本包括来自待测对象的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的一种或多种；优选全血、血清或血浆。
[0500]
(14)根据上述(12)-(13)任一所述的用途，其特征在于，所述产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法以及斑点印迹。
[0501]
五、ifnar的阻断剂在防治胆道闭锁及其并发症中的用途
[0502]
(1)ifnar的阻断剂在(b1)～(b8)中任一种中的用途；
[0503]
(b1)制备治疗疾病的药物
[0504]
(b2)制备降低黄疸率的产品；
[0505]
(b3)制备降低促炎因子水平的产品；
[0506]
(b4)制备提高il-17a水平的产品；
[0507]
(b5)制备降低炎症性单核细胞水平的产品；
[0508]
(b6)制备抑制自身反应性cd4

t细胞、cd8

t细胞活化的产品；
[0509]
(b7)制备提高kupffer细胞比例的产品；
[0510]
(b8)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品。
[0511]
(2)根据上述(1)所述的用途，所述ifnar的阻断剂为ifnar的阻断抗体。
[0512]
(3)根据上述(2)所述的用途，所述ifnar的阻断抗体为中和抗体或功能性抗体。
[0513]
(4)根据上述(3)所述的用途，所述ifnar的阻断抗体为单克隆抗体，优选为抗ifnar的人源化单克隆抗体。
[0514]
(5)根据上述(2)所述的用途，所述抗体为嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体、全人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或抗体片段。
[0515]
(6)根据上述(5)所述的用途，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfv-fc、双特异抗体和抗体最小识别单位。
[0516]
(7)根据上述(5)所述的用途，所述人源化抗体选自anifrolumab、faralimomab、medi-545、rontalizumab、sifalimumab、ags-009、ifnαkinoid、ni-0101中的一种或多种。
[0517]
(8)根据上述(1)-(6)任一项所述的用途，所述药物包括药学上可接受的载体。
[0518]
(9)根据上述(1)-(7)任一项所述的用途，所述药物为冻干粉剂、注射剂或口服液体注射胶囊。
[0519]
(10)根据上述(1)-(9)所述的用途，所述药物制备为适用于儿童或成人的剂型，优选儿童的剂型。
[0520]
(11)根据上述(1)-(10)任一项所述的用途，所述胆道闭锁为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
[0521]
(12)根据上述(1)-(11)任一项所述的用途，所述促炎因子为ifn-γ。
[0522]
(13)根据上述(1)-(12)任一项所述的用途，所述炎症性单核细胞为ly6g

ly6c

cd11b

细胞。
[0523]
六、baff及其阻断剂在胆道闭锁发生和发展的诊疗中的用途
[0524]
(1)检测baff的试剂在制备疾病诊断产品中的用途，所述疾病诊断产品为胆道闭锁疾病诊断产品或胆道闭锁疾病肝纤维化程度的诊断产品；优选地，所述产品包括检测试剂、检测试纸或试纸条、检测芯片或试剂盒；优选地，所述检测baff的试剂是检测baff的蛋白质水平或mrna水平的试剂。
[0525]
(2)根据上述(1)所述的用途，当baff相对于参考水平增加，则诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者；baff水平与肝脏纤维化呈正相关，当所述受试者诊断为胆道闭锁后，baff水平越高，则诊断为胆道闭锁疾病肝纤维化程度越严重。
[0526]
(3)根据上述(1)-(2)任一所述的用途，所述产品还包括如下检测试剂中的一种或一种以上的组合：检测ggt的试剂、检测igg4的试剂、检测alt的试剂、检测ast的试剂、检测tbil的试剂、检测dbil的试剂、检测ibil的试剂、检测tba的试剂、检测ifn-β的试剂。
[0527]
(4)根据上述(1)-(3)任一所述的用途，所述产品的受试样本包括来自待测对象的全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种。
[0528]
(5)根据上述(4)所述的用途，所述产品的受试样本选自组织或组织裂解液、全血、血浆、血清中的至少一种；优选地，所述组织或组织裂解液为肝脏组织或肝脏组织裂解液。
[0529]
(6)根据上述(1)-(5)任一所述的用途，所述产品的还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及蛋白酶抑制剂中的至少一种。
[0530]
(7)根据上述(1)-(6)任一所述的用途，所述产品适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、免疫斑点印迹、流式细胞术以及免疫组织化
学分析。
[0531]
(8)根据上述(1)-(7)任一所述的用途，所述产品的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
[0532]
(9)根据上述(1)-(8)任一所述的用途，所述产品还包含检测mmp7的检测试剂；优选地，检测mmp7的试剂是其蛋白质或mrna水平；优选地，当mmp7相对于参考水平增加，则进一步诊断为胆道闭锁。
[0533]
(10)一种胆道闭锁或胆道闭锁纤维化程度的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：baff的检测试剂，以及mmp7的检测试剂；优选地，所述检测试剂检测蛋白质或mrna水平；优选地，baff和/或mmp7相对于参考水平增加，则诊断为胆道闭锁，所述参考水平代表来自代表非胆道闭锁的同年龄段受试者相应指标的水平；优选地，所述非胆道闭锁的同年龄段受试者为健康、生理性黄疸、胆总管囊肿或肝癌的同年龄段受试者；baff水平与肝脏纤维化呈正相关，当所述受试者诊断为胆道闭锁后，baff水平越高，则诊断为胆道闭锁疾病肝纤维化程度越严重。
[0534]
(11)根据(10)所述的诊断试剂盒，所述试剂盒适用的样本来源是全血、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、精液、唾液样品、羊水、绒毛中的至少一种；优选地，为全血、血清或血浆。
[0535]
(12)根据(10)所述的诊断试剂盒，所述试剂盒包括抗baff抗体和抗人mmp-7抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体。
[0536]
(13)根据(10)所述的诊断试剂盒，所述试剂盒适用于执行以下检测方法中的一种或多种：间接免疫荧光法、颗粒凝集法、抗体确认实验检测法、快速诊断试剂法、酶联免疫吸附试验、放射免疫法、免疫双扩散法、胶体金法、生物质谱法、电泳法、色谱法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫比浊法、免疫印迹法、免疫斑点印迹、流式细胞术以及免疫组织化学分析。
[0537]
(14)根据(10)-(13)任一所述的诊断试剂盒，所述试剂盒还包括样品处理试剂、样品稀释试剂、阳性或阴性对照液、洗涤液、终止液、防腐剂中的一种或多种。
[0538]
(15)根据(10)-(14)任一所述的诊断试剂盒，所述试剂盒适用的受试者为儿童或成人，优选为儿童。
[0539]
(16)baff的特异性阻断剂在制备在(c1)～(c7)中任一种中的用途；
[0540]
(c1)制备防治疾病的药物
[0541]
(c2)制备降低黄疸率的产品；
[0542]
(c3)制备降低igg4水平的产品；
[0543]
(c4)制备降低肝脏功能指标的产品；
[0544]
(c5)制备降低促炎因子水平的产品；
[0545]
(c6)制备提高kupffer细胞比例的产品；
[0546]
(c7)制备提高kupffer细胞的吞噬能力的产品；
[0547]
优选地，所述疾病为胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化。
[0548]
(17)根据上述(16)所述的用途，所述baff的特异性阻断剂阻断baff与选自bcma、taci及baff-r中至少一种baff受体的结合；或者，所述baff的特异性阻断剂使得baff的功
能减弱或失效。
[0549]
(18)根据上述(16)-(17)任一所述的用途，所述baff的特异性阻断剂为baff的阻断抗体。
[0550]
(19)根据上述(18)任一所述的用途，所述抗体为中和抗体或功能性抗体。
[0551]
(20)根据上述(19)所述的用途，所述中和抗体中和膜结合型b细胞活化因子(mbbaff)、可溶性三聚b细胞活化因子(sbaff)、可溶性60-mer b细胞活化因子中的至少一种形式的人b细胞活化因子。
[0552]
(21)根据上述(18)所述的用途，所述抗体为抗baff的单克隆抗体，优选为抗baff的人源化单克隆抗体。
[0553]
(22)根据上述(18)任一所述的用途，所述抗体为嵌合抗体、改型抗体、人源化抗体、全人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或抗体片段。
[0554]
(23)根据上述(22)所述的用途，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、scfv-fc、双特异性抗体和抗体最小识别单位。
[0555]
(24)根据上述(18)所述的用途，所述阻断抗体选自他贝鲁单抗(tabalumab)、贝利单抗(lymphostat b)、anti baff scfv、anti baff scfv fc。
[0556]
(25)根据上述(16)-(24)任一项所述的用途，所述药物还包括其他活性成分；优选地，所述活性成分选自mhc-i的阻断抗体、mhc-ii的阻断抗体、ifnar的阻断抗体中的至少一种。
[0557]
(26)根据上述(16)-(25)任一项所述的用途，所述药物还包括药学上可接受的载体。
[0558]
(27)根据上述(16)-(26)任一项所述的用途，所述药物为冻干粉剂、注射剂或口服液体注射胶囊。
[0559]
(28)根据上述(16)-(27)任一所述的用途，所述药物的适用对象为儿童或成人，优选为儿童。
[0560]
(29)一种药物组合物，所述药物组合物用于预防和/或治疗胆道闭锁、胆道闭锁导致的肝纤维化或胆道闭锁导致的肝硬化，所述药物组合物包含：该药物组合物包含a)、b)和c)中的至少一种：进一步地，包含a)、b)和c)中的至少两种；更进一步地，包含a)、b)和c)；
[0561]
a)抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂；
[0562]
b)ifnar的特异性阻断剂；
[0563]
c)baff的特异性阻断剂。
[0564]
(30)根据上述(29)的药物组合物，所述baff的特异性阻断剂为aff的阻断抗体；优选地，所述抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂为mhc-i的阻断抗体和/或mhc-ii的阻断抗体；优选地，所述ifnar的特异性阻断剂为ifnar的阻断抗体；优选地，所述阻断抗体为人源化抗体或全人抗体。
[0565]
(31)根据上述(30)的药物组合物，所述阻断抗体为单克隆抗体；或所述阻断抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体。
[0566]
(32)根据上述(30)的药物组合物，所述baff的阻断抗体选自他贝鲁单抗(tabalumab)、贝利单抗(lymphostat b)、anti baff scfv、anti baff scfv fc；所述mhc-i的阻断抗体或mhc-ii的阻断抗体选自immu-114、hu1d10和lym-1；所述ifnar的阻断抗体选
自anifrolumab、faralimomab、medi-545、rontalizumab、sifalimumab、ags-009、ifnαkinoid、ni-0101。
[0567]
(33)根据上述(29)-(32)任一项所述的药物组合物，所述药物组合物的剂型为冻干粉剂、注射剂或口服液体注射胶囊。
[0568]
(34)根据上述(29)-(33)任一所述的药物组合物，所述药物的适用对象为儿童或成人，优选为儿童。
[0569]
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0570]
除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组dna等是本领域的常规技能。
[0571]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0572]
下述实施例中涉及的材料与方法如下：
[0573]
1.肝活检样本处理
[0574]
肝活检是在腹腔镜检查或葛西手术期间获得。将样品收集在补充有0.5％bsa和1mm edta(ph＝8.0)(facs缓冲液)的无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。每个样品进行组织病理学评估，并将备用组织用于分离肝内淋巴细胞：用facs缓冲液将肝组织(0.05～0.2g)洗涤3次以消除血液污染并去除血管内淋巴细胞。将样品转移到预先用2ml facs缓冲液浸湿的70μm细胞过滤器中，将其置于50mm培养皿中，用眼科剪刀切成《1mm3的碎片，并用1ml胰岛素注射器的柱塞轻轻切碎。添加额外的2ml facs缓冲液以洗涤细胞过滤器。通过细胞过滤器(falcon，带有细胞过滤器盖的圆底管)过滤总共4ml细胞悬浮液。为了去除大部分肝细胞，将细胞以50
×
g离心2分钟。收集上清液在1800rpm下进一步离心5分钟。将上清液(肝脏匀浆)保存在-80℃的冰箱中。将细胞沉淀物在室温下(rt)用1～2ml红细胞裂解缓冲液重悬5分钟。离心之前，添加10ml facs缓冲液以终止反应。将细胞沉淀重悬于10ml 35％percoll中，在4℃下以2000rpm离心30分钟。将所得的细胞沉淀(淋巴细胞)在pbs中洗涤一次，然后重悬于facs缓冲液中，以备用于表型流式细胞术分析。
[0575]
2.多重流式细胞珠法分析(multiplex cytometric bead assay)测定免疫球蛋白
[0576]
血浆、肝匀浆和细胞培养上清液中的免疫球蛋白浓度(igg1，igg2，igg3，igg4，iga，igm，igd和ige)通过legendplex
tm cba免疫测定法根据制造商的instructions(biolegend)进行测定。肝匀浆经过高速离心(13，000rpm，5min，4℃)，收集上清液并进行稀释测试。将血浆和细胞培养上清液稀释5倍用于免疫球蛋白测定。样品与微珠混合物和二抗孵育2小时。加入检测抗体，并再温育30分钟。将珠洗涤并重悬在洗涤缓冲液中，并使用facsaria流式细胞仪(bd science)进行分析。肝脏中免疫球蛋白的浓度以毫克蛋白质表示，该毫克蛋白质是使用bca蛋白测定试剂盒(beyotime biotechnology)根据制造商提供的instructions从相应肝脏匀浆样品中以bradford法测定蛋白质浓度。
[0577]
3.使用bio-plex pro
tm
人类细胞因子标准27-plex和37-plex试剂盒来测定ctrl-other(其他对照组患儿，肝癌或肝脏肿瘤、生理性黄疸)，ctrl-cc(cc对照组，胆总管囊肿患儿对照组)和ba组(ba患儿)的血浆和肝脏匀浆样品中64种细胞因子，趋化因子和生长因子
的浓度，根据制造商(bio-rad实验室)提供的预先优化的协议，37层面板。肝匀浆经过高速离心(13，000rpm，5min，4℃)，并收集上清液用于测试。使用配备有bio-plex manager软件版本6.0(bio-rad laboratory)的bio-rad bio-plex 200仪器收集和分析数据。使用bca蛋白质测定试剂盒(beyotime biotechnology)测定蛋白质浓度，用于浓度的标准化。
[0578]
4.elisa检测和定量自身抗体
[0579]
将96孔透明聚苯乙烯微孔板在4℃下用100μl pbs中的重组抗原(10μg/ml)包被过夜。用pbs-t(pbs 0.05％tween20)洗涤后，将微孔板用溶解在pbs-t(200μl)中的10％fbs封闭2小时，并用pbs-t彻底洗涤。将100μl血清稀释液(在pbs中为1：100)和肝匀浆在室温搅拌下加入板中1小时。经过类似的洗涤后，加入100μlpbs-t中以1：1000稀释的碱性磷酸酶偶联的兔抗人igg或igm，并在室温下搅拌孵育1小时。洗涤3次后，在1ml二乙醇胺缓冲液(ph 9.8)中，以1mg/ml的浓度将100μl对硝基苯基磷酸酯(sigma)显影1小时，以产生碱性磷酸酶活性。在elisa reader(bio-rad)上在450nm下测量每个样品的平均光密度(od)。血清结果以elisa活性单位表示，而肝匀浆的结果以elisa活性单位表示(以每毫克蛋白质计)。
[0580]
5.免疫荧光染色(if)
[0581]
肝活检的石蜡包埋切片已按照以下流程进行固定包埋。简而言之，将切片在二甲苯中脱蜡，并在70℃的烤箱中放置1小时，然后依次在100％，90％，70％的乙醇中再水化。抗原是用酸缓冲液(ph 6.0)在95℃水浴、20分钟条件下回收。通过在3％h2o2中孵育15分钟，然后与10％正常山羊血清预孵育30分钟来封闭非特异性结合位点，从而使内源性过氧化物酶失活。将切片与一抗在潮湿的室内于4℃在黑暗中孵育过夜。然后将切片用pbs洗涤两次，每次5分钟，在黑暗中与二抗在室温下孵育1小时，并用带有dapi的抗荧光淬灭封片剂(vectashield antifade mounting medium——h-1200，vector laboratories，ca，美国)进行核染色。使用20
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0.75干物镜，使用leica tcs sp8倒置荧光显微镜(leica microsystems)获取免疫荧光图像。用于染色切片的一抗包括抗cd10，rag1和rag2抗体。本研究中使用的荧光素偶联二抗为山羊抗兔igg h&l-cy3(1：3000)，山羊抗小鼠igg1-alexa fluor 488(1：500)，驴抗小鼠igg-alexa fluor 488(1：500)。使用imagej软件对阳性染色的细胞计数。
[0582]
6.恒河猴轮状病毒(rrv)诱导的胆道闭锁(ba)小鼠模型
[0583]
balb/c小鼠购自广东省实验动物中心。将无rrv感染的成年雄性和雌性balb/c小鼠饲养在一起。利用whitten效应(dalal等人，2001年；van der lee和boot，1955年)，在同一周内获得了最大的怀孕次数。雌性一旦怀孕，便将它们放在单独的笼内。对新生幼崽随机注射50μlpbs或腹膜内感染50μl含有1.5
×
106pfu(斑块形成单位)rrv的pbs。在治疗性实验中，在rrv感染前3小时，对小鼠给予b细胞清除抗体(5μg，clone:18b12，mouse igg2a，absolute antibody)、mhc-i阻断抗体(6μg，clone:28-14-8，mouse igg2a)和mhc-ii(ia/ie)阻断抗体(6μg，clone:m5/114，rat igg2b)，anti-ifnar(0.1mg，clone:mar1-5a3，mouse igg1)。每48小时重复给与相同剂量的每种抗体。所有方案均已获得中国广州医科大学动物伦理委员会批准。每天监测小鼠并在第11天安乐死。
[0584]
通过轻轻切碎并通过40μm细胞过滤器，从灌注的肝脏中制备单核细胞，离心并重新悬浮于35％percoll中，然后在2000r.p.m的温度下于4℃离心30分钟并进行红细胞溶解。
如上所述进行表型分析。通过以下抗体鉴定不同的b细胞亚型：cd45，cd3，b220，cd20，igd，igm，cd21，cd23，cd43，cd5。用facscalibur分析染色的细胞。在流式细胞仪采集之前，添加pi染料以排除死细胞。用flowjo分析数据。
[0585]
为了检测细胞内细胞因子，将肝单细胞悬液在含有10％热灭活的fbs，2mm谷氨酰胺，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640培养基中的96孔u型底板中培养，并在pma(100ng/ml)，碘霉素(1ng/ml)和莫能菌素(2μm)存在4～6小时。将细胞用抗cd45，cd4，cd3，cd8进行表面染色，然后固定，用透化/固定缓冲液透化，并用抗ifn-γ和il-17a抗体进行细胞内染色。在cd4t和cd8t细胞中分析ifn-γ和il-17的表达。在表面染色之前添加微珠以计算细胞数。加入zombie染料以排除死细胞。用flowjo分析数据。
[0586]
7.组织学染色
[0587]
新鲜的肝组织用4％多聚甲醛固定并包埋在石蜡中，然后切成薄片(厚度为2μm)并用苏木精和曙红(h&e)染色以进行形态学评估，并用masson三色染色以检测纤维化。
[0588]
8.kupffer细胞对荧光标记的大肠杆菌的吞噬作用
[0589]
制备肝样品的单细胞悬液，并接种到96孔板(2
×
106/孔)中，然后与5μl/孔的大肠杆菌浆液在细胞培养箱中孵育2小时。用冰冷的吞噬作用分析缓冲液清洗孔三遍后，将人类样品的细胞表面用cd68和vsig4染色，并将小鼠细胞的表面用cd45，cd3，cd19，cd11b，f4/80，iy6g，ly6c染色。立即用facscalibur分析染色的细胞。在流式细胞仪采集之前，添加pi以排除死细胞。吞噬活性表示为fitc kupffer细胞的比例。
[0590]
9.单细胞rna测序及分析
[0591]
单细胞rna测序：单细胞悬液里面的死细胞用pi染色跑流式去除。采用10x genomics公司的chromium single cell 5library kit进行单细胞5-端rna测序建库：单细胞悬液与rt-pcr预混液混合后，与隔离油以及纳米级的凝胶珠，获得单细胞油滴乳液一起转移到单细胞5’芯片。在单个细胞内，rna转录本被接上唯一的条形码，被反向转录成带有条形码的cdnas。经过纯化、扩增、末端修复、接上测序接头，构建单细胞rna测序文库。分离部分上述的单细胞rna测序文库，使用chromium single cell v(d)jenrichment kit生成富含tcr和bcr的文库。所有的文库于illumina novaseq 6000平台排序。
[0592]
单细胞测序分析：下机的5
’‑
单细胞测序数据拆分后，使用cell ranger v2.1.1(10x genomics)与人类转录组(grch38)比对。使用seurat v 3.1.2将umi矩阵转换为seurat object。进行下游分析前，过滤保留质量合格的细胞(200～5000个基因数，50000以下的umi数，和12.5％以下的线粒体基因占比)。对每个细胞的原始基因表达量进行normalization in(umi-per-10000 1)。单细胞数据的降维、细胞类型的定义、单细胞伪时序发育轨迹分析、bcr/tcr分析、细胞亚群的差异基因分析等方法参考(cell 2019；179(5):1160-76e24.)。
[0593]
10.流式细胞法
[0594]
(1)获取术中肝脏组织标本。
[0595]
(2)获取肝脏单个核淋巴细胞：首先把肝脏在冰上用组织剪，充分剪碎并研磨，然后在70um的滤网下过滤成单个悬浮细胞，去除肝脏研磨液中的残余过多的结缔组织。然后肝脏组织经过50g条件，4℃，2分钟离心，然后留取上清，通过40um的蓝色滤网流式管。然后继续1800rpm，4℃离心5分钟，留上清作后续实验(检测细胞因子)，沉淀用2ml红细胞裂解液
在室温条件下，充分裂解5min(期间可晃动数次)。然后用pbs溶液稀释到10ml终止反应，继续1800rpm，4℃离心5分钟，然后用35％的percol缓冲液重悬沉淀细胞，在4℃，2000rpm下离心30分钟去除上清以及离心下来的组织，用1ml的facs(2％fbs pbs)溶液重悬，计数。
[0596]
(3)细胞染色：获得的单细胞悬液，根据流式细胞panel方式分别铺在96孔板上，每孔大约1*106细胞。然后4℃离心，1800rpm。去上清，然后根据(t表型，b发育表型，myeliod)表型染色：每孔加30μl抗体溶液(抗体稀释1：200)，用100μl排枪充分混匀。尽量避免气泡形成。在4℃冰箱避光孵育30分钟。然后每孔加200μlfacs稀释中止，4℃1800rpm离心5分钟，去上清，重复一次。最后用100μl含pi的facs重悬(1：100)等待上机。
[0597]
胞内染色：首先进行细胞表面膜受体染色，每孔加30μl抗体溶液(抗体稀释1：200)，用100ul排枪充分混匀，尽量避免气泡形成影响染色排除边际效应。放置在4℃冰箱避光孵育30分钟。然后每孔加200μlfacs稀释中止，在4℃1800rpm离心5分钟，吸去上清，重复一次。随后用固定液，在4℃冰箱，避光孵育30分钟，随后，4℃1800rpm离心吸去上清，用1x破膜液重悬细胞，在4℃冰箱，避光孵育15分钟后4℃1800rpm离心吸去上清，用1x破膜液1：100配制内染抗体溶液，然后每孔加30μl内染抗体溶液，避光，4℃孵育约1小时，随后每个样本孔加150μl的1x破膜液重悬细胞，4℃1800rpm离心(重复一次)，最后用100μl的facs重悬细胞，等待上机。
[0598]
11.rna提取和rt-qpcr
[0599]
从细胞和组织中采用苯酚-氯仿方法提取rna。使用逆转录试剂盒(vazyme)逆转录成cdna。在abi prism 7700实时荧光定量pcr仪上，使用sybr green master mix(vazyme)和人类纤维化基因(col1a1和col1a2)、病毒复制基因(vp6和nsp3)等实施例涉及的基因相关检测引物，在384孔板中一式三份地进行rt-qpcr(用途生物系统)。
[0600]
实施例1.b细胞生成和自身耐受缺陷导致ba患儿自身反应性b细胞的扩增
[0601]
现有的研究报道，肝脏的造血作用发生在人类胎肝内，在出生后会停止(holt和jones，2000)，但发明人通过本实施例的实验研究，惊奇地发现，人类在出生后肝脏内仍存在着完整的b细胞发育过程。
[0602]
方法：
[0603]
对ba患者(n＝6)和相应的对照肝组织(选用胆总管囊肿6例以及对照其他疾病6例)进行单细胞rna测序及分析，研究ba患儿肝脏内存在b细胞发育和自身反应性b细胞扩增的现象，其中，利用t-sne图分析b细胞发育过程不同阶段细胞亚群的分布，利用小提琴图显示各b细胞亚群的基因表达情况，再结合热图分析b细胞发育不同阶段标志基因表达的情况，以及利用条形图显示不同组内样本间b细胞子集的分布情况。利用单细胞分析的方法得到ba患者(n＝6)、cc患者(n＝6)、其他对照患者(n＝6)中肝脏内的前体b细胞的丰度，将其与个体的年龄(天数，0-3000天)进行相关性分析。采用单细胞测序结合bcr等生物信息学分析ba患儿、cc患者、其他对照患者的肝内b细胞亚群的重链和轻链的fv区域内的突变核苷酸数，以及检测它们中csig、igm、igd的表达比例。
[0604]
采用流式细胞法和免疫荧光实验检测b细胞情况。其中，分别从肝活检、骨髓和pbmc中，分离多种b细胞及rna序列分析检测其标记基因的表达，并利用热图、二维主元分析(pc)图显示b细胞在不同样本上的情况。进一步地，发明人采用免疫荧光染色法，显示肝脏样本中rag1和rag2在前体b细胞中的表达情况，以及采用点状图、通过显著性分析比对
ctrl-cc(胆总管囊肿，n＝4)和ba(n＝16)受试者肝脏中每平方毫米视野中的rag1/2 细胞数。
[0605]
使用bio-plex pro人类细胞因子标准37-plex试剂盒检测tnfsf8/cd30l的浓度及其在t细胞和nk细胞内的表达情况。
[0606]
结果：
[0607]
图1为ba患儿肝脏内存在b细胞发育和自身反应性b细胞扩增的现象的结果图。
[0608]
其中，图1中a为b细胞发育过程不同阶段细胞亚群在t-sne上的分布图；图1中b为显示造血干细胞(hsc)、pre-pro-b、pro-b、pre-b和immature b细胞亚群的标志基因的表达的小提琴图；图1中c为显示b细胞发育不同阶段标志基因表达的热图，细胞按照伪时序发育轨迹排列；图1中d为显示不同组内样本间的b细胞子集分布的条形图，其中，块表示不同的样本，并按其派生组进行颜色编码。以上的单细胞转录组研究发现，ba患者和相应的对照(cc对照、其他疾病对照)患者中肝组织、外周血细胞，都发现了整个b细胞发育阶段相关的多种b细胞，包括造血干细胞(hscs)(cd34 spink2 sox4 il1b )，pre-pro-b(cd19-cd34 cd10 rag1 rag2 )，祖b细胞(pro-b、progenitor)(cd19 cd34locd10 rag1 rag2 )，前体b细胞(precursor,pre-b)(cd19 cd10 cd34-rag1 rag2 )，未成熟b细胞(immature，cd19 cd10lorag1/2lo/-)，移行b细胞(transitional，cd19 cd24intcd38int)，(cd19 cd27-ighd )，cd27 classic memory(cd27 memory)，cd27-non-classic memory(cd27-memory)，浆母细胞(pb)(cd27 cd38 mki67 )和浆细胞(pc)(cd27 cd38 tnfrsf17 )(见图1中a到d)，因此，出人意料的是，发明人发现出生后肝脏b细胞淋巴细胞生成保持完整。
[0609]
图1中e为流式细胞法检测肝脏和骨髓内的b细胞前体的结果图，发明人对hsc进行了大量rna序列分析，并分别从肝活检、骨髓和pbmc中，筛选出发育中的b细胞。图1中f为显示从肝活检、骨髓和外周血中分离的不同阶段b细胞中的标记基因表达的热图，数据来自批量rna序列分析。图1中g为显示b细胞在不同样本上的发育情况的二维主元分析(pc)图，从图中可看出，多个阶段的b细胞在骨髓、肝脏、外周血中均有表达，也可看出，在肝脏和骨髓中，对应b细胞在各自发育阶段的转录谱几乎相同(图1中f和图1中g)。以上结果证明了b细胞在肝、骨髓和pbmc中生成，而未在出生后停止。
[0610]
图1中h为肝脏样本中rag1/2和cd10在前体b细胞中的表达情况的免疫荧光结果图：肝脏样本中前体b细胞[rag1/rag2 (绿色)和cd10 (红色)双阳)存在]，图中显示在ba患者的肝活检中，rag1和rag2在pre-b细胞(显示为cd10 b细胞)中表达；图1中i为显示ba患者肝脏内前体b细胞的丰度的点状图，ba患者显著高于对照；显著性通过students t-test获得，**表示p《0.01，结果显示，与ctrl-cc(胆总管囊肿，n＝4)受试者相比，ba(n＝16)受试者肝脏中每平方毫米视野中的rag1/2 细胞数显著增加(p《0.01)。
[0611]
可见，流式细胞分选实验(pro-，pre-，immature，transitional b)和免疫荧光实验均表明了b细胞前体(cd10

rag1/2

)在婴幼儿肝脏中的存在(图1中f至i)。
[0612]
图1中j为不同患儿肝脏内前体b细胞的丰度的散点图，显示经过单细胞分析方法还发现，肝脏内前体b细胞的丰度与个体的年龄(天数，days)成反比，图中r表示pearsons相关系数。图中可见，b细胞前体的丰度随着年龄的增加逐渐降低，且在ba患者中，相对于其他对照疾病，可见b细胞异常增殖(图1中j)。
[0613]
图1中k为不同患儿的肝内b细胞亚群的重链和轻链的fv区域内的突变核苷酸数的
结果图：ba患儿的肝内b细胞亚群的重链和轻链的fv区域内的突变核苷酸数明显少于对照组；图1中l为不同患儿的记忆b细胞(csr)亚群的ig类组成的柱状图：ba患儿记忆性b细胞(csr)亚群具有显著少的发生类型转换的bcr比例，其中，csig表示发生类型转换的ig。从图中bcr研究结果可见，ba患者肝脏内的记忆性b细胞、浆细胞和浆母细胞的重链(igh)和轻链(igk)的可变区体细胞高频突变(somatic hypermutation，shm)以及抗体类型转换(csr，class switch recombination)明显低于对照组(图1中k-l)，说明ba患儿肝脏内的b细胞具有自身抗体的特征。
[0614]
图1中m为不同患儿肝脏内的表示ba患儿肝脏内tnfsf8的含量图：ba患儿具有显著高的tnfsf8的浓度；mann
–
whitney u test，*p《0.05，***p《0.001；图1中n为tnfsf8在t细胞和nk细胞内的表达的t-sne图；每个细胞的颜色强度与标准化后的umi计数成正比【in(umi-per-10000 1)】(从1到7不等)。图1中n的结果说明，ba患者肝脏内csr的下降可能与t和nk细胞表达的tnfsf8(cd30l)升高有关，因为在缺乏炎症细胞因子的情况下，tnfsf8/cd30l可抑制cd40介导的b细胞的csr。
[0615]
结论：
[0616]
发明人团队发现，肝脏中的b细胞生成在出生后持续存在，至少在生命的最初几个月持续存在，并进一步发现这些b细胞形成了一个功能中枢，它们的失调导致ba患儿的自身抗体积累和肝功能衰竭。以上证据也表明，b细胞修饰疗法可能是恢复ba患儿肝脏免疫功能的有效方法。
[0617]
在实施例1证明了b细胞生成和自身耐受缺陷导致ba患儿自身反应性b细胞的扩增的前提下，为了进一步研究b细胞发育和耐受缺陷导致的ba发病机制及其对ba疾病进程影响的机制、研究ba与b细胞发育可能相关的其他免疫指标的相关关系，进行以下实施例2-7的实验。
[0618]
实施例2.高igm/igg4比率的胆道闭锁预后良好
[0619]
方法：
[0620]
通过测定葛西手术后ba患儿(26例)血清中免疫球蛋白各亚型(包括igg1，igg2，igg3，igg4，iga，igm，igd和ige)的浓度，随后检测血清中所有类型的igm和igg4，并进行igm/igg4比值的比对，评价葛西手术后ba患者的预后情况。
[0621]
结果：
[0622]
图2为葛西手术术后血清中高igm/igg4比率和低igm/igg4比率的ba患儿生存曲线图；所述高、低通过对26例患儿进行生物信息学聚类分析分类得到。
[0623]
由图2可以看出，高igm/igg4比率的ba患儿(13例)无黄疸生存概率约为62.5％、低igm/igg4比率的ba患儿(13例)无黄疸生存概率约为12.5％，出现显著性差异(p《0.05)，其中，igm/igg4比率可相对于参考水平比较得出，所述参考水平从ba葛西手术预后较差人群的比较得到，本实验中，ba葛西手术预后较差人群的igm/igg4大多＜0.01，而ba葛西手术预后良好的人群中igm/igg4均＞0.01，且igm/igg4在0.012-0.076范围内)。根据图中结果可合理分析得出，高igm/igg4比率的ba患儿在接受葛西手术后，具有更高的无黄疸生存率，也即具有更加良好的预后。
[0624]
结论：
[0625]
血清(或者类似地选择血浆、全血)中高igm/igg4比率的ba患者亚群具有显著长的
ii小鼠rrv病毒基因的相对表达水平。
[0639]
采用elisa方法检测对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内cx3cr1和c1q浓度。
[0640]
采用流式细胞法检测对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝脏内kupffer细胞吞噬fitc荧光标记的大肠杆菌(e.coli)的能力，并比较不同组别小鼠肝脏kupffer细胞的比例和各自的吞噬能力，方法如下：将肝脏免疫细胞(2*106/孔)与fitc荧光标记的大肠杆菌e.coli(abcam，)在圆底的96孔板在37
°
5％co2孵箱共培养2个小时，试剂盒中的漂洗缓冲液洗涤2次，apc-vsig4，bv785-cd68流式抗体(1:100)冰上染色40分钟，最后流式细胞仪分辨kupffer(cd68 vsig4 )细胞，并检测kupffer细胞对e.coli的吞噬作用。
[0641]
染色分析：采用he染色法对对照组、rrv组、anti-mhc-i/ii组小鼠的肝脏切片进行he染色分析；对对照组、rrv组、anti-mhc-i/ii组小鼠的肝脏切片进行masson三色染料染色分析。
[0642]
结果：
[0643]
图5中a为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠的体重增加情况图。从图5中a可见，在第11天时，rrv组小鼠体重增长量约为230％，并有继续下降趋势，与对照组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠、rrv-anti-mhc ii小鼠呈显著性差异(p《0.001、p《0.05、p《0.001)；rrv-anti-mhc i小鼠、rrv-anti-mhc ii小鼠的体重增长量约为400％，一直为上升趋势，与对照组小鼠无显著差异(p》0.05)。从图5中a可知，anti-mhc i/ii可以有效阻断mhc i/ii介导的抗原呈递作用，从而可以显著增加rrv小鼠体重，达到预防和治疗ba的效果。
[0644]
图5中b为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠的无黄疸率图。从图5中b可见，rrv小鼠组，在第8天时小鼠全部出现黄疸；在第11天时，rrv-anti-mhc ii小鼠黄疸率约为85％，而对照组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠则全部无黄疸，且该三组均与rrv组小鼠呈现显著性差异(p《0.001)。即anti-mhc i/ii给药后，rrv小鼠的无黄疸率得到了显著的提高，anti-mhc i/ii表现出显著的ba预防和治疗效果。
[0645]
图5中c为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内ifn-γ

cd4

t细胞、ifn-γ

cd8

t细胞丰度图：rrv组小鼠的ifn-γ

cd4

t细胞浓度显著高于对照组小鼠，说明ba小鼠的ifn-γ

cd4

t细胞浓度升高；rrv-anti-mhc ii小鼠和空白对照中的ifn-γ

cd4

t细胞占比相当，均与rrv组小鼠呈现显著性差异(p《0.001)；rrv-anti-mhc i小鼠和rrv小鼠差异不显著，浓度高于另两组，说明anti-mhc ii治疗可通过显著降低ba小鼠中的ifn-γ

cd4

t细胞浓度，达到预防和治疗ba的目的；rrv组小鼠肝内ifn-γ

cd8

t细胞显著高于对照组小鼠(p《0.01)，说明ba小鼠的ifn-γ

cd8

t细胞浓度升高；rrv-anti-mhc i/ii小鼠和对照组小鼠的肝内ifn-γ

cd8

t细胞浓度相当(p》0.05)，并显著低于rrv小鼠(p《0.05、p《0.001)，说明anti-mhc i/ii可通过显著降低ba小鼠中的ifn-γ

cd8

t细胞浓度，达到预防和治疗ba的目的。
[0646]
图5中d为流式细胞法检测对照组、rrv组小鼠在11天时肝内b1-a、b细胞前体和成熟b细胞生成的结果图，与实施例1中观察到的人类婴幼儿的结果相吻合。
[0647]
图5中e为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠
肝内b1-a，b细胞前体，成熟b细胞的比率图。从图5中e可以看出：rrv组小鼠和对照组小鼠的b1-a细胞浓度没有显著差异(p》0.05)，rrv-anti-mhc i小鼠、rrv-anti-mhc ii小鼠相比于rrv组小鼠的b1-a细胞浓度显著降低(p《0.05)，说明anti-mhci/ii可以降低b1-a细胞浓度；rrv组小鼠相对于对照组小鼠的b细胞前体浓度显著升高(p《0.001)，rrv-anti-mhc i小鼠、rrv-anti-mhc ii小鼠相比于rrv组小鼠的b细胞前体细胞浓度显著降低(p《0.001)、与对照组差异不显著(p》0.05)，说明anti-mhc i/ii可以降低ba疾病引起的b细胞前体浓度升高；rrv组小鼠相对于对照组小鼠的成熟b细胞浓度显著降低(p《0.001)，rrv-anti-mhc i小鼠与rrv组小鼠差异不显著(p》0.05)，rrv-anti-mhc ii小鼠相比于rrv组小鼠的成熟b细胞浓度显著降低(p《0.001)、与对照组小鼠差异不显著，说明anti-mhc ii可以降低ba疾病引起的成熟b细胞浓度升高。
[0648]
图6中a为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠rrv病毒基因的相对表达水平图。nsp3、vp6为rrv病毒的非结构蛋白和结构蛋白，从图中可以看出，对照组小鼠不表达nsp3、vp6，rrv组小鼠高表达nsp3、vp6，anti-mhc i/ii给药则可以显著降低nsp3、vp6的表达，即anti-mhc i/ii给药不仅没有破坏小鼠对rrv感染后的机体病毒清除机能反而可以显著抑制rrv病毒的增殖。
[0649]
图6中b为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内cx3cr1和c1q浓度图。cx3cl1和c1q可以抑制自身反应性cd8

t细胞活化，从图中可以看出，rrv小鼠相对于对照组小鼠的cx3cl1和c1q浓度显著降低(p《0.05、p《0.01)，rrv-anti-mhc i/ii小鼠相对于rrv小鼠的cx3cl1和c1q浓度显著提高(p《0.01、p《0.001)。说明ba小鼠体内的cx3cl1和c1q浓度降低，自身反应性cd8

t细胞活化升高，而anti-mhc i/ii可以提高cx3cl1和c1q浓度，抑制自身反应性cd8

t细胞活化，从而达到预防和治疗ba的目的。
[0650]
图6中c、d为对照组小鼠、rrv组小鼠、rrv-anti-mhc i小鼠和rrv-anti-mhc ii小鼠肝内kupffer细胞相关结果图：其中，图6中c为不同组别小鼠肝脏内的kupffer细胞吞噬荧光标记的大肠杆菌的结果图，可以看出rrv组小鼠kupffer细胞吞噬大肠杆菌病原体的能力显著低于对照组，而anti-mhc i/ii组的小鼠kupffer细胞吞噬大肠杆菌病原体的能力则接近甚至稍高于对照组，所以anti-mhc i/ii给药后kupffer细胞吞噬大肠杆菌病原体的能力显著恢复；图6中d为不同组别小鼠肝脏kupffer细胞的吞噬能力和比例图，从图中可见，rrv组小鼠kupffer细胞的比例和吞噬能力均显著低于对照组，而anti-mhc i/ii组的小鼠kupffer细胞的吞噬能力和比例则接近对照组(没有显著差异，p＞0.05)，所以anti-mhc i/ii给药后kupffer细胞的比例和吞噬能力显著恢复。
[0651]
图6中e为对照组、rrv组、anti-mhc-i/ii组小鼠的肝脏切片he染色图。从图中可以看出，anti-mhc-i/ii组小鼠与rrv小鼠相比，肝门区周围的淋巴细胞浸润减少，小叶结构更完整，说明anti-mhc-i/ii可以减少肝脏炎症，对ba有显著的预防和治疗效果。
[0652]
图6中f为对照组、rrv组、anti-mhc-i/ii组小鼠的肝脏切片masson三色染料染色图。从图中可以看出，anti-mhc-i/ii组小鼠与rrv小鼠相比肝纤维化程度降低，说明anti-mhc-i/ii治疗可以降低肝纤维化程度，对ba有显著的预防和治疗效果。
[0653]
结论：
[0654]
上述实验结果说明了，anti-mhc-i/ii可以显著地阻断mhc i类或mhc ii类介导的抗原呈递，显著改善ba疾病导致的体重减少，增加无黄疸率，降低炎症因子ifn-γ的水平，
有效抑制rrv病毒的增殖且并没有破坏小鼠对rrv感染后的机体病毒清除机能，抑制自身反应性cd8

t细胞的活化，kupffer细胞数量和吞噬功能增强，淋巴细胞浸润减少，肝纤维化程度降低。综上，通过抗mhc-i/ii可以改善新生balb/c小鼠中rrv诱导的ba小鼠模型的肝损伤，anti-mhc疗法可以显著预防和治疗胆道闭锁疾病。因此，用于抑制mhc-i和/或ii信号通路的试剂(例如mhc-i/ii的阻断抗体、它们的双特异性抗体、单克隆抗体等)可应用于制备预防和/或治疗胆道闭锁的药物中。
[0655]
实施例5.r-gt(r-谷氨酰转移酶)、alt(丙氨酸氨基转移酶)、ast(天冬氨酸氨基转移酶)、tba(总胆汁酸)、dbil(直接胆红素)的增加联合ibil(间接胆红素)下降是胆道闭锁的指征
[0656]
已知胆道闭锁与其他生理性黄疸、胆总管囊肿等疾病难以区分，本实施例继续探究是否有区分它们的生化指标。
[0657]
方法：
[0658]
通过电子病历收集健康对照(n＝2471)、患有ba(n＝927)、胆总管囊肿(cc)(n＝248)或生理性黄疸(n＝9297)的受试者的血液和肝活检免疫细胞的队列特征，尤其是肝功能临床生化指标及相对值，应用lasso回归模型来确定ba患者和非ba对照受试者之间的特定临床指标：只有在12943份电子病历报告中记录超过20％的索引才包含在机器学习过程中，从中随机选择10％的受试者子集作为训练过程的数据集，其余90％的受试者用于采用roc曲线(接收者操作特征，receiver operating characteristic)、根据auc(曲线下面积)来验证ba特异性临床指标的预测性能，以探究所选指标是否能够真正区分ba儿童与cc、生理性黄疸和非疾病对照受试者。
[0659]
结果：
[0660]
通过回归模型，确定了58个显著系数(临床指标)作为组别参数，采用热图显示健康对照(n＝2471)或患有ba(n＝927)、胆总管囊肿(cc)(n＝248)或生理性黄疸(n＝9297)的受试者在这58个系数中的临床指标相对值，结果如图7所示，从图中可明显看到，ba患儿的r-谷氨酰转移酶(r-gt)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、总胆汁酸浓度持续升高(tba)和直接胆红素(dbil)水平显著升高，与肝脏疾病晚期的病理学表现相一致，相比之下，cc或生理性黄疸患者的上述指标和长期预后与健康对照受试者相当。此外，从图7可见，指标ibil(间接胆红素)的变化趋势与前述指标不一致，因而，进一步地，查找是否可以作为联合检测指标，因此，图8为显示沿时间轴的tba、dbil、ibil浓度的散点图，展示了相比非ba患儿，在ba患儿中，尤其是早期，tba、dbil浓度显著上升(与图7结果一致)，而ibil的浓度则显著下降(p＜0.05)。以上结果预测了，ibil降低与r-gt、alt、ast、tba和dbil升高的组合值可能为ba患者的检测提供一个额外的生物标记物组合。
[0661]
进一步对上述预测结果进行roc曲线验证，结果通过roc曲线显示。如图9所示，ibil降低与r-gt、alt、ast、tba和dbil增加的组合值，能够非常有效地区分ba受试者与健康对照(auc＝0.978)、生理性黄疸(auc＝0.967)或cc病例(auc＝0.806)。因此，r-gt、alt、ast、tba、dbil的增加联合ibil下降，是胆道闭锁的有效指征。
[0662]
结论：
[0663]
本实施例发现了，ba患者dbil、tba、肝酶(r-gt、alt和ast)持续升高而ibil则从最早期的发病开始则已呈现出持续下降的趋势，并且本实施例还通过roc曲线验证了ibil降
低与r-gt、alt、ast、tba和dbil增加的组合值，能够非常有效地区分ba受试者与健康对照、生理性黄疸或cc病例。因此，r-gt、alt、ast、tba、dbil的增加联合ibil下降，是胆道闭锁的有效指征，可作为联合生物标志物应用在胆道闭锁疾病的诊断、尤其是早期诊断中，以快速筛查出胆道闭锁的患儿、大大降低胆道闭锁疾病的预后风险。
[0664]
实施例6.ifnar阻断剂可显著缓解rrv致ba模型鼠的疾病表型
[0665]
ifnar是结合i型干扰素(干扰素-α/β)的受体。本实施例进一步研究i型干扰素、其受体及受体阻断剂在ba疾病中的相关性，以研究其对ba的诊断、预防、治疗是否能够起作用。
[0666]
方法：
[0667]
rrv诱导balb/c乳鼠构建ba疾病模型(实验中，设置对照组、rrv-ba小鼠组、anti-ifnar组)，检测小鼠肝脏组织中ifn-β水平，并利用ifnar阻断抗体(anti-ifnar)进行试验，同步检测各组小鼠的体重、黄疸率变化、(肝脏和/或脾脏中)ifn-γ以及il-17a在活化前后cd4t和cd8t细胞中的丰度变化、炎症性的单核细胞数量、kupffer细胞数量及吞噬功能。
[0668]
通过多重细胞因子检测人血浆中ifn-β的情况，以进一步验证小鼠实验的正确性。其中，分别设置正常健康同龄对照的hc组、ba疾病对照组(control，胆总管囊肿或生理性黄疸)以及ba组。
[0669]
结果：
[0670]
图10～图15为本实施例中anti-ifnar可以有效缓解rrv-ba模型鼠的疾病表型的示意图，其中，
[0671]
图10可见，相对于对照组(n＝10)，在rrv病毒诱导的ba模型小鼠(n＝10)肝脏组织中，ifn-β水平显著升高，说明存在i型干扰素通路的激活。
[0672]
图11可见，对照小鼠(n＝3)未见黄疸现象、体型正常；rrv-ba小鼠(n＝3)相比之下，出现明显黄疸、体型偏小；而anti-ifnar处理rrv-ba小鼠后(n＝6)，大部分小鼠和对照组体型相似、未见黄疸发生，小鼠的黄疸发生率也降低至33.3％。因此，anti-ifnar可显著增加ba小鼠的体重并降低黄疸的发生率，小鼠的生存状况得到显著改善。
[0673]
进一步分析抑制i型ifn激活改善ba的机制发现，相比rrv诱导的ba模型小鼠组，在采用anti-ifnar阻断ifnar以后，肝脏和脾脏的cd4

t细胞、cd8

t细胞均显著减少(p＜0.05)，同时，脾脏的活化的cd4

t细胞和cd8

t细胞比例也显著降低(p＜0.05)，结果见图12。表明：i型ifn的激活参与ba小鼠t细胞的激活，anti-ifnar处理抑制了cd4

t细胞、cd8

t细胞在肝脏和/或脾脏中的活化。
[0674]
图13显示，相比rrv诱导的ba模型小鼠，通过anti-ifnar的方式阻断ifnar后还发现，在无黄疸的小鼠中ifn-γ显著减少(p＜0.05)，anti-ifnar处理rrv-ba小鼠中，无黄疸的小鼠肝脏中ifn-γ

cd4t和ifn-γ

cd8t细胞的丰度显著降低，而il-17a

cd4t细胞的丰度显著升高(p＜0.05)。以上说明，ifnar阻断剂可降低ba疾病中t细胞表达炎性细胞因子同时也是ba肝脏纤维化的活化因子——ifn-γ的表达，并使il-17a的表达接近对照组，起到一定的预防和治疗ba疾病的作用。
[0675]
图14可见，在无黄疸发生的利用anti-ifnar阻断ifnar的rrv小鼠中，炎症性的单核细胞减少、具有病原体清理功能的kupffer细胞增加、kupffer本身的吞噬功能也得到增强。这些结果说明，炎症性的单核细胞增加、具有病原体清理功能的kupffer细胞减少及吞
噬功能减弱，是i型ifn激活参与rrv诱导的ba疾病的发病机制，而anti-ifnar可通过上述机理有效预防和治疗ba。
[0676]
图15表示，ba患者血浆中ifn-β水平较健康同龄以及ba疾病对照组(control)显著升高(p＜0.0001)；该结果与前述小鼠实验相吻合，也说明ba疾病中存在i型干扰素通路的异常激活。
[0677]
结论：
[0678]
在rrv病毒诱导的小鼠中存在i型干扰素通路的激活，具体表现为小鼠体重降低、黄疸率为100％、肝脏组织中ifn-β及ifn-γ水平显著升高、il-17a水平显著降低、肝脏和脾脏的活化前后的cd4

及cd8

t细胞增加、炎症性的单核细胞增加、kupffer细胞减少及其吞噬能力降低，且在人ba患者中同样可以看到血清/血浆中ifn-β水平的升高。而使用了阻断ifnar的抗体，则发现小鼠的黄疸发生率显著降低、体重显著增加、ifn-β及ifn-γ水平显著降低、il-17a水平显著增加、肝脏活化前后的cd4和cd8t细胞比例降低、炎症性的单核细胞减少、具有病原体清理功能的kupffer细胞增加、kupffer本身的吞噬功能也得到增强，因此，ba疾病伴随i型ifn的激活，ifnar的阻断剂(例如阻断抗体、中和抗体)是有效的ba预防和治疗药物。
[0679]
实施例7.baff在肝/血中升高与ba及其肝纤维化进程正相关、baff阻断剂可在体内外实验中显著缓解ba及其肝纤维化进程
[0680]
baff(b细胞活化因子)是众多的b细胞激活剂之一，是受体tnfrsf13b/taci、tnfrsf17/bcma和tnfrsf13c/baffr的配体，本实施例进一步研究baff在ba疾病及其肝纤维化进程中的相关性，以研究其对ba的诊断、预防、治疗(包括延缓ba的肝纤维化、肝硬化进程)是否能够起作用。
[0681]
方法：
[0682]
1.人体标本实验：
[0683]
收集和制备ba患者、对照患者的肝脏和血液(包括全血、血清、血浆)标本，其中，临床标本以及数据的收集步骤包括：
[0684]
胆道闭锁及其他对照组患儿的病史，尤其是肝脏损伤相关实验室检测指标从医院的电子医疗档案系统中获得。伦理声明：本项目已获得广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会批准。按照“赫尔辛基宣言”中所述的“涉及人体研究的国际伦理准则”进行实验。项目研究的知情同意书将从患者或患者的法定监护人获得。受试者的入选标准：本研究的受试者在广州市妇女儿童医疗中心肝胆外科接受肝胆手术的患儿中招募。
[0685]
对照患儿和ba患儿依据以下标准判断：
[0686]
(1)对照：0～4个月龄肝胆疾病(胆总管囊肿、肝癌或肝脏肿瘤、生理性黄疸)需手术治疗的患儿。
[0687]
(2)胆道闭锁：0～4个月龄梗阻性黄疸患儿，经术中胆道造影和/或肝活检明确诊断ba。
[0688]
(3)排除标准：(1)合并全身炎症反应综合征或多系统畸形的患儿；(2)原发疾病诊断不明确的患儿；(3)父母拒绝参加研究或无法获得父母授权的患儿。
[0689]
对收集的肝脏和血液标本，elisa法检测肝脏和血液标本中baff浓度，其步骤包括，将-80℃冻存的ba患者和对照疾病的血清以及肝脏上清低温离心15分钟，取上清，利用
酶联免疫法检试剂盒(bio-rad公司)检测baff浓度，具体操作根椐说明书进行；检测γ-谷氨酰转移酶(ggt)的浓度(医院检验科检测)；biolegend公司生产的cba(cytometric bead array)免疫球蛋白试剂盒检测免疫球蛋白(igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga、ige、igd)的浓度；分析baff浓度和上述指标中的相关关系；rt-qpcr方法检测b细胞中baff受体的基因表达水平。
[0690]
对获取的肝脏进行he和masson染色，并根据ishak score对肝脏淋巴细胞浸润、炎症细胞以及纤维化程度进行检测和评分，其中肝脏病理切片ishak评分标准如表1所示。
[0691]
表1.肝脏ishak评分标准
[0692]
[0693][0694]
利用t-sne(t-分布式随机领域嵌入)的非线性降维算法和作图方法将收集的多维数据进行聚类和降维分析；利用线性相关分析和其他分析方法研究ba患儿肝脏内baff的浓度水平，及其与ro/ssa-igg自身抗体水平的关系。
[0695]
免疫荧光法检测baff来源、cd14

细胞/cd68

细胞/cd20

b细胞/igg4

细胞以及sma

成纤维细胞的基因表达、细胞数量和分布情况。其中，免疫荧光检测ba肝脏中igg4的表达以及igg4

细胞在肝脏分布的位置的步骤包括：取对照和ba患者的肝脏组织石蜡切片放入二甲苯中脱蜡，入水，热修复暴露抗原，pbs洗3分钟，3次，加1％正常山羊血清室温封闭1小时，吸去封闭液，直接滴加一抗，4℃保湿过夜。用预冷pbs清洗2次，室温孵育标记的二抗1小时，避光。pbs清洗2次。在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下拍照。
[0696]
2.体外细胞实验：
[0697]
在体外用baff激活天然b细胞，并elisa检测培养上清中igg4的表达情况。其中，体外激活b细胞实验步骤包括：将外周血中外周血单个核细胞(pbmc)分离出来，利用流式分选机器将cd45 cd19 igd cd27-分选，以100，000细胞每孔种在96孔板，cpg

il-4

cd40l激活b细胞，加或不加baff，培养至少7天，收集上清，检测igg4的表达。
[0698]
体外人重组免疫球蛋白igg4增加促成纤维化基因表达的实验研究：在体外利用人重组igg4刺激人星状细胞系lx-2，检测成纤维化相关基因表达水平，以及分析igg4与成纤维化相关基因的关系，具体过程包括：体外培养肝脏星状细胞系hsc，37
°
，5％co2，诱导分化( tgf-β)，并同时给与igg4刺激三天，收集细胞，提取rna，并做rt-qpcr检测成纤维化相关的基因sma，col1a1，col1a2，col3a1，acta1的表达；
[0699]
由于围产期病原体(例如，病毒)感染所诱导自身免疫的异常是ba可能的发病机制，病原体包括细菌和病毒感染所导致的机体i型干扰素通路的激活，lps水平升高，因此，通过体外实验研究病毒感染是否促进baff介导肝脏损伤：利用来自病原体的lps以及炎症因子ifn-β刺激已分化成巨噬细胞的细胞系thp1，观察baff的表达情况。
[0700]
进一步地，分选外周血中的b细胞以及单核细胞，建立b细胞-单核细胞共培养体系，给予ifn-β刺激或同时给予baff中和抗体(anti-baff)来阻断baff的作用，分别收集上清并检测igg4的表达，观察ifn-β与igg4表达的关系，以及添加baff阻断剂后的影响。
[0701]
3.体内动物实验：
[0702]
建立胆道闭锁动物模型：(1)动物：成年balb/c孕鼠，无特定病原体级(spf级)，购自广东省医学实验动物中心。饲养在广州医科大学实验动物中心spf级环境。待孕鼠产下新
生小鼠(每只孕鼠平均产8只新生鼠)，平均体重1.5g，根据实验分组随机选取新生小鼠进行实验。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。(2)造模方法：将新生的balb/c小鼠，于出生24小时内腹腔注射猴mmu18006轮状病毒20μl(滴度1.0
×
106pfu)，建立ba小鼠动物模型。(3)观察小鼠的生存状况：包括小鼠生存率、生长体重、皮肤黄疸和肝功能的变化等。
[0703]
anti-baff的效果实验：在已建立的急性胆道闭锁小鼠模型上，根据实验要求进行配对实验，将ba模型分为不同实验组别：1)对照小鼠组(腹腔给予pbs)；2)rrv诱导ba小鼠模型组；3)ba小鼠 anti-baff组(其中，抗小鼠baff抗体为兔igg，mab(sandy-2)(preservative free)prod.no.ag-20b-0063pf-c100，adipogen life sciences)，给药量2μg/g，腹腔注射，病毒感染后第1、3、6、9天给药，实验在第12天终止；4)ba小鼠 igg(兔来源，clone 18b12，购自abcam)同型对照组(给药方式与ba小鼠 anti-baff组相同)。
[0704]
以上实验中，同步在实验前后及进程中，观察上述各组小鼠肝胆表观、黄疸特征、体重及生存率等表型；同时观察肝脏中坏死细胞、淋巴细胞浸润情况(通过he染色)等免疫细胞功能的改变情况；流式细胞学检测肝脏和脾脏免疫细胞亚型；elisa检测baff的表达水平；cba检测tnf-α、ifn-β、ifn-γ等细胞因子的表达；医院检验科检测肝脏功能指标alt、ast、dbil、tba水平；使用免疫荧光和流式细胞学技术，检测肝脏和/或脾脏组织中cd4

t细胞、cd8

t细胞、b220

细胞、cd138

细胞的表达情况、检测kupffer细胞数量和功能、igg1的表达(小鼠igg1与人体内igg4功能类似)。
[0705]
结果：
[0706]
1.人体标本实验结果：
[0707]
图16是不同患儿baff的水平、肝脏与血清中baff浓度的相关关系、血清中的baff与γ-谷氨酰转移酶(ggt)浓度的相关关系、肝脏与血清中baff的水平与肝脏的淋巴细胞浸润以及纤维化程度的相关关系的结果图。其中，选取了50例ba患儿以及25例疾病的对照组(胆总管囊肿，cc)进行试验，结果如图16中a所示，通过elisa检测，baff的水平在ba的血清和肝脏中均显著高于cc对照组(p＜0.0001)，并且肝脏baff的浓度与血清中baff浓度呈正相关(r＝0.4082，p＝0.0003)(图16中b)；此外，在其他非ba的肝脏疾病对照(包括肝癌、胆汁淤积症、生理性黄疸，n＝18)中，肝脏的baff水平也接近cc对照组(n＝35)，并且与ba患者组(n＝53)呈显著差异(p＜0.0001)(图16中c)。同时，baff在区分ba与非ba(cc)受试者的预测性能的接受者操作特征(roc)曲线图如图16中d所示：baff能够非常有效地区分ba受试者与cc病例(auc＝0.923)。因此，baff可以成为ba疾病的早期诊断的指标或标志物之一。
[0708]
进一步地，在与临床检测的各项肝功能指标做了相关性分析后发现，血清中的baff与血清中γ-谷氨酰转移酶(ggt)的浓度呈正相关，r＝0.4485，p＝0.0023，见图16中e。ggt是检测是否有胆管损伤所致肝脏疾病最敏感的肝功能指标，但是特异性却不高，在其他原因例如肿瘤或者病毒性肝炎中ggt的水平依然升高，因此，本实验通过与baff检测的合并，提高了ggt的特异性，可以成为ba疾病的早期诊断的指标或标志物之一。
[0709]
此外，对获取的肝脏标本进行染色，并根据ishak score进行肝脏淋巴细胞浸润以及纤维化程度的评分时，发现肝脏中baff的水平与肝脏的淋巴细胞浸润以及纤维化程度呈正相关，见图16中f。因此，baff不仅可作为胆道闭锁疾病诊断的指标或标志物，还可为胆道闭锁疾病肝纤维化程度的诊断提供诊断依据，也即，当baff水平越高，则可预判胆道闭锁疾病肝纤维化程度越严重。
[0710]
同时，研究发现，baff基因主要表达在髓系细胞亚群中，见图17中a、b，其中，图17中a为t-sne图，显示baff基因主要表达在髓系细胞亚群中；图17中b为显示b细胞亚群内编码baff受体的基因表达水平以及髓系细胞中编码结合igg恒定区域的受体的基因表达水平的小提琴图。
[0711]
在上述基础上，通过dapi免疫荧光染色，还发现，肝脏中cd14

和cd68

与baff有共染，并且cd14

在ba肝脏中共染的细胞数量显著增加，见图17中c、d，再次为baff在ba中表达增加提供了依据。因此，结合图16的结果可以确定，baff是诊断ba疾病的有效检测指标或生物标志物。
[0712]
进一步地，通过人体标本实验，还证明了，baff促进igg4分泌增加、介导肝纤维化进程，结果如图17中e～g所示。其中，图17中e、f显示，在ba患者的血浆和肝脏中均存在免疫球蛋白igg4水平的显著升高(p＜0.05)，并且igg4与baff水平有正相关关系；图17中g显示，通过dapi免疫荧光染色发现，igg4

细胞在ba肝脏中显著增多且分布于sma

成纤维细胞的周围。因此，igg4也可以辅助baff作为ba诊断或ba肝纤维化程度诊断的指标或标志物。
[0713]
此外，实施例3发现ba患儿肝内、血清中的ro/ssa-igg自身抗体均显著升高，而此处进一步发现，ba患儿肝脏内baff的浓度与ro/ssa-igg自身抗体的水平成正相关，见图17中h。因此，除了如前可采用baff或进一步加入ggt、igg4作为ba的诊断标志物外，还可考虑，加入ro/ssa-igg自身抗体，类似地还可加入前文实施例5中记载的r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil的检测试剂作为ba诊断的指标或生物标志物，来进一步提升诊断或辅助诊断ba的准确性。以及，还可加入已报导的mmp7作为标志物，以达到增加灵敏度和特异性的协同诊断、减少假阳性、假阴性的目的。
[0714]
2.体外细胞实验结果：
[0715]
如前所述，图17中e～g已经通过人体标本实验，验证了baff促进igg4分泌增加，介导肝脏纤维化。进一步地，体外激活天然b细胞并检测培养上清中igg4的表达的实验中，同样发现，baff的刺激与前述人体标本实验相吻合，即baff显著地促进了igg4的分泌(图18中a)。以上结果表明了，baff促进igg4的表达。
[0716]
在接下来的体外实验中，利用人重组igg4刺激人星状细胞系lx-2，发现人重组igg4显著促进了成纤维化相关的基因col1a2、acta1的表达升高，p＜0.05(图18中b)，证明baff通过促进igg4的分泌参与了ba疾病中肝脏的纤维化进程，进一步证明了，igg4和baff可作为ba肝纤维化程度诊断的指标或生物标志物。
[0717]
图18中c显示病原体感染促进baff介导肝脏损伤。其中发现，当利用病原体毒素成分lps以及机体受刺激所产生的炎症因子ifn-β刺激已分化成巨噬细胞的细胞系thp1，都可以极显著地促进baff的表达(p＜0.0001)。
[0718]
进一步的b细胞-单核细胞共培养体系实验也同样发现，ifn-β可以促进igg4的表达，而当在共培养体系中继续通过添加anti-baff来阻断baff的作用时，igg4的水平则得到显著降低(图18中d)，说明病毒感染激活的i型干扰素通路可通过baff促进igg4的分泌，参与ba疾病的产生以及ba疾病的肝脏纤维化进程，而baff的特异性阻断剂能有效抑制igg4分泌，从而防治了ba疾病的发生、发展。
[0719]
3.体内动物实验结果：
[0720]
在出生24小时内感染恒河猴轮状病毒(rrv)建立ba模型发现，在第6天时，rrv造模
组与对照组之间，baff已开始呈现显著差异(p＜0.05)，到第12天造模终止时，rrv造模组与对照组的baff呈现极显著差异(p＝0.002)，因此可见，随着的时间，baff在rrv感染的小鼠血浆中的水平逐渐升高(图19中a)。
[0721]
在rrv感染后1天，开始使用baff中和抗体(anti-baff)，观察小鼠表型和免疫细胞功能的改变，测试anti-baff是否有预防和治疗作用。结果发现，使用anti-baff阻断baff后，当rrv组的黄疸率达到100％时，anti-baff给药组的黄疸率只有30％，且实验结束时小鼠的黄疸率也呈现极显著下降差异，p＝0.001(图19中b)。同时，相比rrv造模组，anti-baff组的体重减轻也得到了显著改善，p＜0.05(图19中c)。
[0722]
进一步地，he染色结果发现，ba小鼠肝脏中坏死以及淋巴细胞浸润增多，而通过anti-baff特异性地阻断baff以后，肝脏中坏死灶以及淋巴细胞浸润均显著减少，接近对照组(图19中d)。
[0723]
此外，前文实施例5记载了r-gt、alt、ast、tba、dbil以及ibil的检测试剂可联合作为ba诊断的标志物，而本实施例进一步地证明了，anti-baff给药组较对照组肝脏功能指标alt、ast、dbil、tba水平均呈显著性的降低，p＜0.05(图19中e)。肝脏和脾脏中，cd4

t细胞和cd8

t细胞里的ifn-γ表达水平也均显著地减少，p＜0.01(图20中a)。因此，上述实验证明了，阻断baff可抑制t细胞分泌毒性细胞因子ifn-γ、肝脏功能也得到显著改善，从而对ba及其肝脏损伤的进程(例如肝纤维化/肝硬化进程)起显著的抑制和保护作用。
[0724]
其他方面，相比rrv造模组，anti-baff给药组的肝脏中，具有病原体清除功能的kupffer细胞数量极显著增多(p＜0.001)，并且kupffer细胞吞噬功能显著增强(图20中b)。elisa结果显示，baff中和抗体可以显著降低ba小鼠血浆中的baff浓度(p＜0.0001)(图20中c)。在对细胞因子的检测结果中还发现，相比rrv致ba模型小鼠组，anti-baff给药组小鼠的血浆中细胞因子tnf-α、ifn-β、ifn-γ的水平也都显著降低((p＜0.05)，并且接近空白对照组(图20中d)。再者，在实验中还发现，相比rrv致ba模型小鼠组，anti-baff给药组小鼠可以显著降低小鼠脾脏中igg1的在浆细胞的表达，p＜0.05，并且anti-baff给药组的igg1水平接近空白对照组(图20中e)，而在小鼠体内，igg1的功能与人体内igg4功能类似，因此，也与前述人体标本实验图17中e～g、体外细胞实验图18中a的结果中，baff促进igg4分泌增加、介导肝脏纤维化的结果相吻合，也结合说明了，anti-baff作为药物可以预防和治疗ba及其向肝纤维化甚至肝硬化的进程。
[0725]
结论：
[0726]
本实施例的结果说明了，诊断方面，胆道闭锁疾病及其纤维化进程中，baff及其调控的信号通路起重要的影响作用。其中，在例如病毒导致的ba的发生发展过程中，血清/血浆和肝脏中的baff水平均会成正相关性地升高，且肝脏中的baff水平也与ba的黄疸水平、体重减少、肝脏淋巴细胞浸润情况、肝脏纤维化评分情况、ifn-β等表型或指标呈正相关；进一步地，发现baff与ggt、ro/ssa-igg自身抗体呈正相关，还发现了，在ba肝脏和血浆中igg4水平均升高，且血清/血浆中的igg4升高与血清/血浆中baff的升高呈正比，baff可以显著刺激igg4的表达，而igg4则促进了成纤维相关基因的表达，加速了ba的纤维化进程。从而本实施例阐明了baff水平升高导致ba发生/发展的机制，以及首创性地提出了将baff联合igg4、ggt、ro/ssa-igg自身抗体等作为ba及其纤维化进展的诊断标志物。相应地，预防和治疗方面，通过采用baff的特异性阻断剂，例如中和抗体anti-baff，能够通过抑制tnf-α/
ifn-β/ifn-γ的分泌、增强kupffer细胞的吞噬功能、抑制促纤维化免疫球蛋白igg1(对应人igg4)的分泌，减轻肝脏细胞坏死及淋巴细胞浸润等肝损伤、降低肝损伤指标(alt、ast、dbil、tba)、延缓肝纤维化、降低黄疸率、抑制体重减少，达到显著预防和治疗胆道闭锁及其肝纤维化/肝硬化进程的作用。
[0727]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。