AVEN基因在缺血性心脏病中的应用

aven基因在缺血性心脏病中的应用
技术领域
1.本发明涉及aven基因在缺血性心脏病中的应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.心肌梗死与心力衰竭是全球住院率与病死率最高的疾病，尽管目前的治疗水平得到一定的发展，心肌梗死所致的左心室功能障碍和心力衰竭仍然严重影响着患者的寿命和生活质量。尽管坏死被认为是心梗后死亡的主要原因，近期越来越多的研究表明，急性心梗后的心肌细胞凋亡是导致心肌细胞功能丧失的重要原因，也是左心室重构和心力衰竭的重要原因。因此找到急性心梗后识别高危病人的一个敏感的凋亡标志物，并提供新的临床治疗策略非常重要。通过抗凋亡治疗抑制细胞凋亡可能是改善这些患者预后的新途径。因此，找到抑制心肌细胞凋亡的特异性分子及其分子通路具有非常重要的理论和临床意义。
3.aven(apoptosis and caspase activation inhibitor)是一个凋亡抑制基因，抑制apaf-1介导的细胞凋亡。在急性淋巴细胞白血病中作为一种促癌蛋白。但aven在心梗中的作用还未有报道。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：如何改善心肌梗死患者的生活质量和预后较差等问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了促进aven基因的表达和/或活性的试剂在制备用于预防和/或治疗缺血性心脏病的药物中的应用。
6.优选地，所述促进aven基因的表达和/或活性的试剂包括促进aven基因表达的腺相关病毒载体。
7.优选地，所述的腺相关病毒载体包括aav-aven。
8.优选地，所述腺相关病毒载体aav-aven的病毒滴度为1.8
×
10
12
vectorgenome(v.g.)/ml。
9.本发明还提供了检测aven基因的表达和/或活性的试剂在制备用于检测缺血性心脏病的试剂或试剂盒中的应用。
10.优选地，所述检测aven基因的表达和/或活性的试剂包括aven抗体。
11.本发明还提供了一种用于预防和/或治疗缺血性心脏病的药物，包括医学上可接受的载体和有效量的活性成分，所述的活性成分包括促进aven基因的表达和/或活性的试剂。
12.优选地，所述促进aven基因的表达和/或活性的试剂包括促进aven基因表达的腺相关病毒载体。
13.优选地，所述的腺相关病毒载体包括aav-aven。
14.优选地，所述腺相关病毒载体aav-aven的病毒滴度为1.8
×
10
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vectorgenome(v.g.)/ml。
15.本发明还提供了一种用于检测缺血性心脏病的试剂或试剂盒，包括检测aven基因的表达和/或活性的试剂。
16.优选地，所述检测aven基因的表达和/或活性的试剂包括aven抗体。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.本发明利用腺相关病毒载体，在小鼠心脏中特异性过表达aven，发现aven能在心梗模型中抑制心肌细胞凋亡，显著改善心功能；因此，对于临床上心肌梗死的病人给予aven腺相关病毒基因治疗能够抑制心肌细胞凋亡，改善心脏收缩和舒张功能，提高患者的生活质量和远期预后，为临床上防治缺血性心脏病提供了新的靶标和策略。
附图说明
19.图1为心梗病人(a)以及小鼠心梗模型(b)中aven表达水平，a中normal表示正常人，icm表示缺血性心肌病人，b中sham表示假手术组，mi_7d表示心梗7天组；
20.图2为aven过表达减轻心肌梗死模型小鼠心肌细胞凋亡水平，改善心衰表型的结果；其中，a为aven在小鼠心脏中过表达成功，b为过表达aven后显著降低促进凋亡因子bax的表达，c为心衰标志物bnp在过表达aven后明显下调；mi表示心梗组，aav9-aven表示过表达组，aav9-nc表示过表达对照组。
21.图3为m型超声结果显示，aven过表达可以改善mi引起的心功能恶化(a)以及提高心衰小鼠的射血分数(ef％)、缩短分数(fs％)、降低左心室收缩末内径(lveds)与左心室舒张末内径(lvedd)(b)和提高心衰小鼠的心重/体重(hw/bw)与肺重/体重(lw/bw)(c)；其中，ns表示无统计学差异，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。改善心梗后心功能；
具体实施方式
22.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
23.实施例
24.本实施例提供了aven基因在预防和治疗缺血性心脏病中的应用：
25.1、实验方法
26.1.1小鼠结扎左冠状动脉前降支(lad)法致心肌梗死模型的建立(采用“无气管插管的挤心脏”术式完成)，具体步骤包括：
27.(1)小鼠置于异氟烷麻醉诱导箱处理至深度麻醉；
28.(2)取出小鼠，置于手术麻醉小鼠面罩处，心前区脱毛，并固定小鼠四肢；
29.(3)心前区三四肋间隙处手术开口，钝性分离肌肉组织，暴露心尖搏动处；
30.(4)右手使用持针器突破三四肋间隙胸壁，左手积压胸腔至心脏完全暴露至胸壁外，直视小鼠心脏使用6-0手术缝合线结扎心脏左前降支冠脉；
31.(5)松开左手，使用持针器引导心脏还纳与胸腔，积压胸腔排出可能存在的空气以防气胸；
32.(6)使用4-0手术缝合线关闭胸壁手术开口，并使用小鼠心电图观察心肌梗死模型是否成功，若模型成功，小鼠导联心电图会出现明显的st段抬高现象。
33.1.2小鼠心脏超声
34.小鼠脱毛后，用异氟醚麻醉后固定在加热垫上(1％-2％)。小心控制异氟醚流量，
使心率维持在450次/分左右。采用配备30mhz线性换能器的二维(2-d)引导m型超声心动图(visualsonics vevo 2100，加拿大)评估心脏的几何结构和功能。获得胸骨旁长轴视图，同时记录心率。得到心脏几何形状和功能指标：射血分数(ef)、缩短分数(fs)、左室舒张末期内径(lvedd)、左室舒张末期容积(lvesv)。每个测量指标至少经过5个连续的心脏周期取平均值。
35.1.3免疫印迹试验
36.首先用sds-page胶预混液配置sds-page胶，下层分离胶配置：依次取2.5ml分离胶a液和b液，再先后依次加入25μl的aps和2.5μl的temed，混匀后加入胶槽中。等待10-20分钟分离胶彻底凝固后配置上层浓缩胶：依次吸取1ml浓缩胶a液和b液，再依次加入10μl的aps和2μl的temed，混匀后小心加到分离胶上面，然后插上梳子。15分钟胶凝固后，即可上样。蛋白上样量为15-30μg，在110v恒压的条件下电泳20分钟，待看到蛋白样压成一条线并处于浓缩胶与分离胶的边界处时，将电压调至220v再跑30分钟。然后用湿转法将胶上的蛋白转到pvdf膜上，设置程序为恒流220ma，运行时间120分钟(此时整个电泳槽需要浸没在冰水混合液中)。然后将膜放置于5％脱脂牛奶中(用tbst溶解，有蛋白的一面朝上)进行封闭，于室温摇床上孵育30分钟。再用tbst洗涤膜3次，每次置于摇床上晃动5分钟。接着即可进行抗体与膜的孵育：将一抗按照说明书上的稀释比(1:1000)溶于5％脱脂牛奶中；然后与膜一起孵育，放置于室温摇床上孵育2小时或4℃孵育过夜。孵育结束后用tbst洗膜3次，同样每次5分钟。然后将加有二抗的5％脱脂牛奶与膜一起孵育(二抗上偶联有hrp，其稀释比例为1:5000)，在室温摇床上孵育1小时。接着仍用tbst洗膜3次，每次5分钟。最后即可进行显影，向膜上加入显影混合液，设置曝光时间检测显影信号。
37.1.4腺相关病毒aav-aven的构建
38.腺相关病毒aav-aven是委托汉恒生物科技有限公司构建的，根据aven基因的序列设计pcr扩增引物，引物序列如下所示：
39.aav-m-aven-n-f：cttaatacgactcactataggctagcgccaccatgcaggctgagcg；
40.aav-m-aven-n-r：tcgtcatccttgtagtcaagcttggtggaaatcatgctgtccagccag；
41.引入酶切位点nhei，扩增后克隆至腺病毒系统穿梭载体pshuttle-cmv，得到含有aven基因的穿梭质粒，将携带aven基因的穿梭质粒，与携带rep和cap蛋白的编码基因的paav-rc质粒，以及替代腺相关病毒所依赖的腺病毒的phelper质粒共转染工具细胞aav-293后，收集病毒及纯化，可以得到携带有外源插入基因的aav病毒颗粒，经滴度检测，所得腺相关病毒aav-aven的病毒滴度为1.8
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vectorgenome(v.g.)/ml。
42.1.5c57bl/6小鼠尾静脉注射腺相关病毒aav-aven(100μl/只)，aav-nc(阴性腺相关病毒对照，注射剂量100μl/只)三周后，c57bl/6小鼠分为四组，对照组(aav-nc)与过表达组(aav-aven)，分别再构建心肌梗死模型，sham组只穿线不结扎。
43.手术后7天，小鼠心脏超声检测心功能，免疫荧光与western blot检测aven基因过表达情况，western blot检测凋亡相关蛋白bax、bcl2、心衰标志物anp和bnp在不同处理组小鼠中的表达量。
44.2、实验结果：
45.(1)首先通过公共数据库分析aven基因在心梗病人心脏组织中的表达水平，结果表明aven的蛋白水平是明显下调的，如图1a所示。在小鼠心肌梗死模型中，心梗7天组的小
鼠心肌aven蛋白水平明显下调，如图1b所示。
46.(2)通过注射aav9-aven与aav9-nc，构建心脏特异过表达aven的小鼠，免疫印迹实验提示过表达成功，如图2a所示。通过检测凋亡促进因子bax以及凋亡抑制因子bcl2的表达水平，结果显示，过表达aven能减轻mi所致的心肌细胞凋亡，如图2b所示；此外，通过检测心衰标志物bnp的表达水平，结果显示注射aav9-aven减少心衰标志物bnp的表达，如图2c所示。
47.(3)小鼠心脏超声的结果显示，aven过表达可以改善mi引起的心功能恶化，如图3a所示，aven过表达可以提高心衰小鼠的射血分数(ef％)、缩短分数(fs％)、降低左心室收缩末内径(lveds)与左心室舒张末内径(lvedd)，如图3b所示，aven过表达还可以提高心衰小鼠的心重/体重(hw/bw)与肺重/体重(lw/bw)，如图3c所示，以上结果表明，aven过表达显著改善心梗后心功能。
48.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。