一种检测TIGIT抗体和PVRIG抗体的协同生物学活性的方法与流程

一种检测tigit抗体和pvrig抗体的协同生物学活性的方法
技术领域
1.本发明涉及生物药物活性检测领域，特别涉及tigit抗体和pvrig抗体的功能活性的协同作用检测方法的建立及实施。


背景技术：

2.在肿瘤微环境中，肿瘤抗原的持续刺激能够引起t细胞耗竭，即t细胞失活的状态，共抑制分子诸如pd-1、lag-3、tim-3以及tigit的表达会上调。目前，靶向这些免疫检查点抑制剂的治疗方法正广泛用于肿瘤的治疗中。
3.t细胞免疫球蛋白和itim结构域(tigit)和脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域(pvrig，又被称为cd112r)是表达于细胞耗竭t细胞和nk表面的两个共抑制免疫检查点蛋白，在逆转细胞耗竭和增强nk细胞活化中起着重要的作用。tigit和pvrig同属于nectin和nectin样家族，家族成员还包括dnam-1(又名cd226)和cd96。tigit的主要配体为pvr(又名cd155)，同时也会结合pvrl2(又名cd112)、cd111、cd113和cd114，这些配体主要表达于抗原递呈细胞和多种肿瘤细胞的表面。pvrig的配体pvrl2(又名cd112)同样表达于抗原递呈细胞和多种肿瘤细胞的表面。tigit或pvrig与其配体结合后引起t细胞和nk细胞活化的抑制。cd155和pvrl2同时也是cd226的配体，后者可以激活t细胞和nk细胞。与cd226相比，tigit/cd155和pvrig/pvrl2之间具有更高的亲和力，所以在正常情况下，cd155和pvrl2主要通过结合tigit和pvrig从而抑制nk和t细胞的活化。通过靶向tigit或pvrig的单克隆抗体阻断共抑制信号通路，恢复t细胞和nk细胞的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果，具有很好的临床应用前景。
4.目前应用于免疫检查点抑制剂的抗体药物活性的传统检测方法具有许多缺点。例如，基于蛋白水平或细胞水平的竞争实验，可以通过受体和配体之间的结合检测抗体的阻断能力。这种方法虽适用于大规模筛选，但其主要缺点是并不能检测受体下游的信号通路的变化，并不能真正反映抗体的活性。例如，利用新鲜分离的外周血单个核细胞(pbmc)检测免疫检查点抑制剂对细胞增殖以及细胞因子分泌的影响。这种分析方法的主要缺点是实验材料难以获得，而且分离pbmc的实验操作复杂，实验周期至少需要3到5天，时间成本和人力成本较高。更重要的是，由于不同献血者之间pbmc的差异，实验结果很容易产生较大的差异，影响实验人员对结果的判断。
5.目前基于报告基因方法检测免疫检查点抑制剂的抗体药物活性越来越广泛的应用于该领域药物的发现过程中，tigit和pvrig抗体的报告基因系统也已用于单独靶点的抗体发现过程中，但是目前并没有一种可靠且稳定的检测二者协同作用的报告基因系统。
6.因此，需要针对tigit和pvrig阻断性抗体开发更有效检测二者协同作用的活性检测方法。目前同时阻断tigit和pvrig通路并没有一种很好的检测其协同生物学活性的方法。因此，提供一种可靠且稳定的方法来检测tigit和pvrig单克隆抗体的协同作用是很有必要的。近些年，报告基因方法由于其高效的实验过程及准确的实验结果已被细胞生物学广泛使用以研究基因表达及其它与基因表达相关的细胞学事件。萤火虫荧光素酶是一个
61kda的单体蛋白，以atp
·
mg2 为共同底物催化荧光素的氧化反应。在形成氧化荧光素过程中，通过电子转移将化学能转化为光能，具有检测速度快、灵敏度高、稳定性好、线性范围广等优点。
7.tigit和pvrig分别与其配体结合后抑制t细胞活化的方式类似，因此可以采用相同的下游信号通路。利用荧光素酶报告基因方法所构建的细胞模型，建立抗tigit和pvrig单克隆抗体的生物活性协同作用的测定方法，从而对其进行评价，可以作为此类药物早期研发过程中的一种有效措施。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于，解决上述现有技术的不足，提供一种抗tigit和抗pvrig单克隆抗体联用的生物学活性检测方法。本方法基于荧光素酶报告基因法，通过对tigit/cd155和pvrig/pvrl2信号通路的分析，建立一种抗tigit和pvrig抗体的生物学活性检测方法，可以用于检测二者的协同作用或双特异性抗体的活性。
9.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
10.一种检测抗tigit抗体和抗pvrig抗体联合应用的生物学活性的方法，包括以下步骤：取jurkat效应细胞和ht1080人工抗原递呈细胞与待测样品混合后共孵育，通过荧光素酶报告基因法检测抗tigit抗体和抗pvrig抗体的协同生物学活性，所述待测样品为抗tigit单克隆抗体和抗pvrig单克隆抗体。
11.进一步的，jurkat效应细胞的构建方法包括如下步骤：
12.步骤1：用含有nfat-re-luc2p荧光素酶报告基因的质粒转染jurkat细胞，培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞密度不超过2
×
106个/ml。待细胞生长稳定之后挑取荧光素酶信号阳性的单克隆细胞系扩大培养。
13.步骤2：将人tigit全长基因片段插入到psbbi-rb表达载体中，转染步骤1获得的jurkat细胞系，培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞密度不超过2
×
106个/ml。待细胞生长稳定之后挑取tigit阳性的单克隆细胞系扩大培养。
14.步骤3：将人pvrig全长基因片段插入到慢病毒表达载体，并与plp1、plp2和plp/vsvg三质粒混合转染293ft细胞，从而包装成慢病毒颗粒。
15.步骤4：用步骤3获得的慢病毒感染步骤2获得的tigit-nfat-re-luc2p荧光素酶报告基因细胞，培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞密度不超过2
×
106个/ml。
16.步骤5：待细胞生长稳定后，通过磁珠筛选的方法富集pvrig阳性的细胞进行扩大培养，命名为jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞。
17.进一步的，所述ht1080人工抗原递呈细胞的构建方法包括如下步骤：
18.步骤1：将编码okt3 scfv序列的基因片段插入到psb表达质粒中，转染ht1080细胞，培养于10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞汇合度不超过80％。
19.步骤2：待细胞生长状态稳定后，挑取okt3 scfv阳性的单克隆细胞，命名为ht1080-okt3-scfv-a10细胞。
20.进一步的，抗tigit单克隆抗体和抗pvrig单克隆抗体与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞的结合能力的测定方法包括如下步骤：
21.步骤1：jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞与一系列浓度梯度的抗tigit bmk(从100nm开始，5倍稀释至0.001nm)或抗pvrig bmk(从100nm开始，5倍稀释至0.001nm)在4℃孵育1小时。
22.步骤2：洗涤细胞后加入荧光标记的山羊抗人抗体检测抗tigit bmk或抗pvrig bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞的结合。
23.步骤3：荧光强度测定：细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测。
24.步骤4：数据处理：细胞的平均荧光强度用flowjo软件进行分析。
25.进一步的，所述一种检测抗tigit抗体和抗pvrig抗体联合应用的生物学活性的方法包括如下步骤：
26.步骤1：取对数生长期的ht1080-okt3-scfv-a10细胞，消化、离心，调整细胞密度为2
×
105个/ml，接种100μl细胞悬液于96孔板(greiner-655090)每孔中，并于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。
27.步骤2：第二天，用rpmi-1640完全培养基配制不同浓度的待测抗体，从100nm开始，5倍稀释至0.0013nm。同时，取对数生长期的jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞，离心，调整细胞密度为8
×
105个/ml。将含有ht1080-okt3-scfv-a10细胞的96孔板培养上清弃掉，每孔加入50μl jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞悬液和50μl稀释好的抗体溶液，每个条件平行设置两个复孔，于37℃、5％co2培养箱中培养孵育5～6小时。
28.步骤3：提前将发光底物取出置于室温。待样品孵育结束后，将96孔板取出置于室温放置10分钟。每孔加入50μl发光底物，室温避光孵育3～5分钟。
29.步骤4：以不加抗体的空白对照组读值为基础，将其它所有读值与空白对照组平均值作比较，比值用倍比变化表示。
30.较佳的，所述发光底物为on-glo荧光素酶。
31.较佳的，过表达人tigit和pvrig蛋白以及nfat反应元件荧光素酶报告基因(nfat-re-luc2p)的jurkat效应细胞和过表达抗cd3抗体scfv结构域(okt3-scfv)的ht1080人工抗原递呈细胞由上海药明生物技术有限公司生物新药研发服务业务部构建。
32.本发明的优点是：
33.1.本发明通过将人tigit和pvrig全长基因片段与nfat-re-luc2p基因片段共同转染jurkat细胞，实现了tigit和pvrig蛋白以及荧光素酶蛋白的共同表达。同时，通过构建人工抗原递呈细胞避免了在实验体系中需要额外加入抗cd3抗体的问题，从而使实验体系更简单，而且t细胞的激活情况更接近于天然状态。
34.2.本发明提供了一种抗tigit和抗pvrig抗体协同生物学活性的检测方法。本发明基于荧光素酶报告基因的方法，通过对tigit/cd155和pvrig/pvrl2信号通路的分析，建立了一种抗tigit和抗pvrig抗体协同生物学活性的检测方法，可以用于体外证明同时阻断tigit和pvrig两条信号通路对于t细胞的活化具有协同作用。本方法的准确度和精确度较高，而且特异性较强，可用于检测抗tigit和抗pvrig单克隆抗体联合应用或双特异性抗体的生物学活性，以实现对这两个靶点协同作用的生物学机制的探索。
附图说明
35.图1为jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞表达tigit的水平。
36.图2为jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞表达pvrig的水平。
37.图3为ht1080-okt3-scfv-a10细胞表达cd155的水平。
38.图4为ht1080-okt3-scfv-a10细胞表达pvrl2的水平。
39.图5为抗tigit bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞结合能力的拟合曲线。
40.图6为抗pvrig bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞结合能力的拟合曲线。
41.图7为tigit/cd155和pvrig/pvrl2阻断活性检测系统的示意图。
42.图8为抗tigit抗体和抗pvrig抗体的联合阻断活性检测(相对光单位)结果。
43.图9为抗tigit抗体和抗pvrig抗体的联合阻断活性检测(倍比变化)结果。
44.图10为抗tigit抗体阻断cd155与细胞表面tigit结合的检测结果。
45.图11为抗pvrig抗体阻断pvrl2与pvrig结合的检测结果。
具体实施方式
46.实施例1工程细胞的构建
47.过表达人tigit和pvrig蛋白以及nfat反应元件荧光素酶报告基因(nfat-re-luc2p)的jurkat细胞池jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p效应细胞由上海药明生物技术有限公司生物新药研发服务业务部生物部构建。通过将人tigit和pvrig全长基因以及携带有nfat-re-luc2p的载体转染或包装成慢病毒感染jurkat细胞，细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞密度不超过2
×
106个/ml。待细胞生长稳定后，通过磁珠筛选的方法富集细胞获得tigit和pvrig阳性，且携带有nfat反应元件荧光素酶报告基因的细胞池。
48.过表达抗cd3抗体scfv结构域(okt3-scfv)的人工抗原递呈细胞ht1080-okt3-scfv-a10由上海药明生物技术有限公司生物新药研发服务业务部生物部构建。通过将编码okt3 scfv序列的基因片段插入到psb表达质粒中，转染ht1080细胞，培养于10％胎牛血清的rpmi-1640完全培养基中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，细胞汇合度不超过80％。待细胞生长状态稳定后，挑取okt3 scfv阳性的单克隆细胞。
49.jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞表达tigit的情况如图1所示，表达pvrig的情况如图2所示。ht1080-okt3-scfv-a10细胞表达cd155的情况如图3所示，表达pvrl2的情况如图4所示。注：图中黑色曲线代表空白细胞，灰色区域代表荧光标记的相应抗体或通过荧光标记二抗检测相应抗体与对应细胞共孵育后的染色结果。
50.实施例2抗体的获得
51.抗人tigit抗体抗tigit bmk和抗人pvrig抗体抗pvrig bmk由上海药明生物技术有限公司生物新药研发服务业务部蛋白科学部构建、表达并纯化。抗tigit bmk的全长序列根据genentech公司专利wo2021154761中已经披露的seq id no:33和seq id no:34的序列合成。抗pvrig bmk的全长序列根据compugen公司专利us20180244774中已经披露的克隆号为cha.7.518.1的序列合成。人igg1和igg4同型对照抗体human igg1和human igg4的可变
区序列由上海药明生物技术有限公司生物新药研发服务业务部杂交瘤部发现，全长抗体由蛋白科学部进行构建、表达并纯化。通过流式细胞术方法检测抗体与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞的结合。jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞与一系列浓度梯度的抗tigit bmk(从100nm开始，5倍稀释至0.001nm)或抗pvrig bmk(从100nm开始，5倍稀释至0.001nm)在4℃孵育1小时。洗涤细胞后加入荧光标记的山羊抗人fc抗体检测抗tigit bmk或抗pvrig bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞的结合。细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测，并用flowjo软件进行分析。
52.抗tigit阳性抗体抗tigit bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞的结合检测结果如图5所示。抗pvrig阳性抗体抗pvrig bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞的结合检测结果如图6所示。抗体抗tigit bmk和抗pvrig bmk与jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞具有很强的结合能力，且结合作用具有剂量依赖性。
53.实施例3tigit和pvrig阻断抗体协同生物学活性的检测
54.取对数生长期的ht1080-okt3-scfv-a10细胞，消化、离心，调整细胞密度为2
×
105个/ml，接种100μl细胞悬液于96孔板(greiner-655090)每孔中，并于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。
55.第二天，用rpmi-1640完全培养基配制不同浓度的待测抗体，从100nm开始，5倍稀释至0.0013nm。同时，取对数生长期的jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞，离心，调整细胞密度为8
×
105个/ml。将含有ht1080-okt3-scfv-a10细胞的96孔板培养上清弃掉，每孔加入50μl jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞悬液和50μl稀释好的抗体溶液，每个条件平行设置两个复孔，于37℃、5％co2培养箱中培养孵育5～6小时。
56.提前将one-glo荧光素酶发光底物取出置于室温。待样品孵育结束后，将96孔板取出置于室温放置10分钟。每孔加入50μl发光底物，室温避光平衡3～5分钟。使用envision多功能酶标仪读取每孔的荧光强度，以相对光单位表示。以不加抗体的空白对照组读值为基础，将其它所有读值与空白对照组平均值作比较，比值用倍比变化表示。
57.应用报告基因方法评估tigit抗体和pvrig抗体联合应用的阻断活性的示意图如图7所示。人工抗原递呈细胞与效应细胞相互作用，通过okt3-scfv结合效应细胞表面的cd3和t细胞复合物从而激活效应细胞，而cd155与tigit结合，pvrl2与pvrig结合启动共抑制信号。抗tigit抗体和抗pvrig抗体分别结合效应细胞表面的tigit和pvrig，阻断其配体的结合，并促进配体与共刺激受体cd226的结合，从而恢复效应细胞的活化状态，报告信号增强。
58.抗tigit抗体和抗pvrig抗体的联合应用的阻断活性检测结果如图8和图9所示。在抗tigit抗体和抗pvrig抗体存在的条件下，jurkat-tigit-pvrig-nfat-re-luc2p细胞与ht1080-okt3-scfv-a10细胞共培养。单独使用抗tigit抗体和抗pvrig抗体显示出了对效应细胞的活化作用，且二者联合应用具有协同作用，进一步增强效应细胞的活化，而且这种作用具有剂量依赖性，而同型对照抗体则没有任何作用。
59.实施例4抗tigit抗体阻断tigit/cd155的结合
60.表达tigit的工程细胞与一系列浓度梯度的抗tigit抗体(从100nm开始，3倍稀释至0.046nm)和恒定浓度的含小鼠fc标签的cd155蛋白(终浓度为2μg/ml)混合，4℃孵育1小时。洗涤细胞后加入荧光标记的山羊抗小鼠fc抗体检测cd155与tigit工程细胞的结合。细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测，并用flowjo软件进行分析。
61.抗tigit抗体阻断cd155与tigit结合的检测结果如图10所示。抗tigit抗体能够阻断cd155与tigit的结合，且具有浓度依赖性，而同型对照抗体则没有阻断作用。
62.实施例5抗pvrig抗体阻断pvrig/pvrl2的结合
63.将含his标签的pvrig蛋白用包被于96孔高吸附酶标板中，4℃孵育过夜。次日，封闭酶标板后，每孔加入不同浓度的抗pvrig抗体(从5nm开始，3倍稀释至0.0003nm)与恒定浓度的含小鼠fc标签的pvrl2蛋白(终浓度为10μg/ml)，室温孵育1小时。之后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠fc抗体。室温孵育0.5小时后，每孔加入tmb显色液进行显色。
64.抗pvrig抗体阻断pvrl2与pvrig结合的检测结果如图11所示。抗pvrig抗体能够阻断pvrl2与pvrig的结合，且具有浓度依赖性，而同型对照抗体则没有阻断作用。