生物标志物检测的制作方法

生物标志物检测
1.本发明涉及生物标志物的检测，并且特别地但不排他地涉及用于检测生物标志物以诊断各种病症例如癌症的方法、组合物和试剂盒。特别地，本发明涉及检测作为用于检测癌症，例如食管-胃癌或转移癌的诊断和预后标志物的化合物。
2.食管腺癌是最常见的五种癌症之一并且在西方人群中发病率上升最快。英国是全球食管腺癌发病率最高的国家。胃癌是全球癌症死亡的第三大原因。英国的食管癌和胃癌的五年生存率仍然很差(分别为13％和18％)，是欧洲最差的。改进癌症存活率的关键是早期诊断。然而，症状是非特异性的并且通常与良性疾病共享。当症状变为癌症特异性时，该疾病通常处于预后不良的晚期。癌症负担和对具有非特异性症状的患者进行不必要的调查导致大量成本。因此，迫切需要对具有非特异性胃肠道症状的患者进行非侵入性测试，以便有效地对患者进行分类以进行内窥镜检查和其他诊断方式。
3.先前的研究表明食管-胃癌和挥发性有机化合物(voc)之间存在关联，并且其诊断方法是呼出气测试。使用气相色谱质谱(gc-ms)的研究人员表明存在特定于特定癌症的呼吸挥发性有机化合物(voc)谱[4]。gc-ms是用于voc识别的很好技术，但它本质上是半定量的，除非采用稳健的校准曲线，并且因此其研究结果被不同研究小组复制的能力是有限的。此外，对于每个样品存在大量的分析时间，这自然不适用于高通量分析。直接注射质谱，例如选择离子流管质谱(sift-ms)和飞行质谱的质子转移反应时间(ptr-tof-ms)具有定量和允许实时分析的优势[5,6]。
[0004]
需要一种可靠的非侵入性诊断测试来识别患有癌症(例如食管-胃癌)的患者。识别患有癌症的那些患者的诊断方法将给患者带来巨大利益并将提高早期治疗和改善预后的可能性。
[0005]
本发明人先前已经开发一种基于检测呼出气中的特征化合物，例如挥发性有机化合物(voc)的非侵入性癌症检测方法。本发明人现在开发导致改进的准确性和更快速的测试的新方法和组合物，通过施用优化浓度的口服刺激食品(例如饮料、胶囊或固体食品)来实现，其瞬时诱导或“刺激”癌症以产生大量独特的特征化合物(例如voc)，并且因此改进测试性能和诊断和/或预后准确性。这将使具有非特异性症状但具有食管-胃癌高风险的患者能够更早地被识别并转诊以进行进一步的调查和治疗。
[0006]
因此，在本发明的第一方面，提供一种用于诊断患有癌症或具有癌症的易感性的受试者，或用于提供受试者病症的预后的方法，该方法包括：
[0007]
(i)在来自测试受试者的身体样品中检测由存在于先前施用到受试者的组合物中的至少一种糖和/或至少一种氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的代谢产生的特征化合物的浓度，其中所述糖以大于20,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，氨基酸或其前体以至少500mg/ml的浓度存在于组合物中，并且多元醇以大于25,000mg/100ml的浓度存在于组合物中；和
[0008]
(ii)将该浓度与未患癌症的个体中的特征化合物的浓度的参考值比较，
[0009]
其中所述特征化合物的浓度与参考相比增加或降低，表明受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或提供受试者病症的负面预后。
[0010]
检测步骤(i)可以包括从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟或至多5分钟检测特征化合物。检测步骤(i)可以包括从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物小于30分钟、小于25分钟、小于20分钟、小于15分钟、小于10分钟或小于5分钟检测特征化合物。优选地，当组合物包含至少一种先前施用到测试受试者的糖时，进行检测步骤。
[0011]
检测步骤(i)还可以包括从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物30至60分钟，更优选地从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物30至55分钟，或30至50分钟，或30至45分钟，或30至40分钟，或35至60分钟，或35至55分钟，或35至50分钟，或35至45分钟或35至40分钟检测特征化合物。优选地，检测步骤(i)还包括从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物35至45分钟检测第二特征化合物。优选地，当组合物包含至少一种氨基酸和/或至少一种多元醇时，进行这种检测步骤。
[0012]
因此，优选地，检测步骤(i)包括：
[0013]
a)从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟或至多5分钟、小于30分钟、小于25分钟、小于20分钟、小于15分钟、小于10分钟或小于5分钟检测特征化合物；和
[0014]
b)从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物30至60分钟，更优选地从施用包含至少一种糖和/或氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物30至55分钟，或30至50分钟，或30至45分钟，或30至40分钟，或35至60分钟，或35至55分钟，或35至50分钟，或35至45分钟，或35至40分钟检测特征化合物。
[0015]
优选地，特征化合物的浓度与参考相比增加，表明受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或提供受试者病症的负面预后。优选地，特征化合物的浓度增加为与参考相比时，特征化合物的浓度增加至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。
[0016]
优选地，糖以至少20,000mg/100ml，至少20,500mg/100ml，至少21,000mg/100ml，至少25,000mg/100ml，至少50,000mg/100ml或至少75,000mg/100ml的浓度存在。优选地，糖以约25,000g/100ml的浓度存在。优选地，糖以大于20,000mg/100ml、大于20,500mg/100ml、大于21,000mg/100ml、大于25,000mg/100ml、大于50,000mg/100ml或大于75,000mg/100ml的浓度存在。
[0017]
优选地，组合物包含糖，优选浓度在约20,000mg/100ml和10,0000mg/100ml之间，更优选地在25,000mg/100ml和75,000mg/100ml之间。
[0018]
技术人员会理解，术语糖可以指单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖或糖醇。糖可以选自：d-葡萄糖、d-蔗糖、d-乳糖、d-果糖、d-甘露糖、d-古洛糖、d-半乳糖、d-木糖、d-阿拉伯糖、d-来苏糖、d-核糖、d-阿洛糖、d-阿卓糖、d-塔糖、d-艾杜糖、l-阿拉伯糖、l-鼠李糖、l-木酮糖、二糖、三寡糖和多聚糖、山梨糖醇、c4、c7和》c8单糖、山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇。
[0019]
优选地，糖是葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖或乳糖。更优选地，糖是葡萄糖、甘露糖或乳糖。最优选地，糖是葡萄糖或乳糖。
[0020]
因此，优选地，组合物包含葡萄糖，并且优选地，组合物中存在的葡萄糖浓度为至少25,000mg/100ml。更优选地，糖是葡萄糖并且以为至少25,000mg/100ml的浓度存在，并且从施用包含葡萄糖的组合物至多10分钟检测到特征化合物。
[0021]
施用到受试者的组合物可以包含柠檬酸。这可以代替糖或作为糖的补充。优选地，柠檬酸与糖结合使用。优选地，糖是葡萄糖。因此，优选地，组合物包含柠檬酸和葡萄糖。
[0022]
优选地，柠檬酸以至少1,000mg/100ml、至少1,100mg/100ml、至少1,200mg/100ml、至少1,300mg/100ml或至少1,400mg/100ml的浓度存在于组合物中。优选地，柠檬酸以约1,400mg/100ml的浓度存在。
[0023]
因此，优选地，该组合物包含葡萄糖和柠檬酸，并且优选地，组合物中存在的葡萄糖浓度为至少25,000mg/100ml，并且该组合物中存在的柠檬酸浓度为至少1,400mg/100ml。更优选地，该组合物包含以至少25,000mg/100ml的浓度存在于该组合物中的葡萄糖和以至少1,400mg/ml的浓度存在于该组合物中的柠檬酸，并且从施用包含葡萄糖和柠檬酸的组合物至多10分钟检测到该特征化合物。
[0024]
在另一个实施方案中，组合物优选包含氨基酸，优选浓度为至少500mg/100ml，至少1000mg/100ml，至少2000mg/100ml，至少3000mg/100ml，至少4000mg/100ml，至少5000mg/100ml，或至少6000mg/100ml。
[0025]
优选地，所述组合物包含氨基酸，优选浓度为大于500mg/100ml，大于1000mg/100ml，大于2000mg/100ml，大于3000mg/100ml，大于4000mg/100ml，大于5000mg/100ml，或大于6000mg/100ml。
[0026]
优选地，氨基酸以500mg/100ml至10,000mg/100ml，500mg/100ml至6000mg/100ml，500mg/100ml至5000mg/100ml，500mg/100ml至4000mg/100ml，500mg/100ml至3000mg/100ml，500mg/100ml至2500mg/100ml，500mg/100ml至2000mg/100ml，1000mg/100ml至10000mg/100ml，1500mg/100ml至10000mg/100ml，2000mg/100ml至10000mg/100ml，2500mg/100ml至10000mg/100ml，3000mg/100ml至10000mg/100ml，4000mg/100ml至10000mg/100ml，5000mg/100ml至10000mg/100ml，6000mg/100ml至10000mg/100ml，1000mg/100ml至5000mg/100ml，1000mg/100ml至3000mg/100ml，1000mg/100ml至2500mg/100ml，1000mg/100ml至2000mg/100ml，1500mg/100ml至10000mg/100ml，1500mg/100ml至5000mg/100ml，1500mg/100ml至3000mg/100ml，1500mg/100ml至2500mg/100ml，或1500mg/100ml至2000mg/100ml的浓度存在于组合物中。
[0027]
优选地，组合物中存在的氨基酸浓度为约2000mg/ml。
[0028]
氨基酸可以选自：酪氨酸、谷氨酸、谷氨酸酯(glutamate)、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸和组氨酸。
[0029]
优选地，当氨基酸为谷氨酸时，氨基酸的浓度为至少5,000mg/100ml，至少5,100ml/100ml，至少5,200mg/100ml，至少5,300mg/100ml，至少5,400mg/100ml，至少5,500mg/100ml，至少6000mg/100ml，大于5,000ml/100ml，大于5,100mg/100ml，大于5,200mg/100ml，大于5,300mg/100ml，大于5,400mg/100ml，大于5,500mg/100ml，或大于6,000mg/100ml。优选地，当氨基酸为谷氨酸时，氨基酸的浓度为1,800mg/100ml至2,200mg/100ml，1,900mg/100ml至2,100mg/100ml。优选地，当氨基酸为谷氨酸时，氨基酸的浓度为1,900mg/100ml、2,000mg/100ml、2,100mg/100ml、2,200mg/100ml或2,300mg/100ml。优选地，当氨基
酸为谷氨酸时，氨基酸的浓度为2,100mg/ml。然而，在一种实施方案中，氨基酸不是谷氨酸。
[0030]
最优选地，氨基酸是酪氨酸。
[0031]
因此，优选地，组合物包含酪氨酸并且优选地酪氨酸以至少2,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。更优选地，氨基酸是酪氨酸并且以至少2,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，并且从施用包含酪氨酸的组合物35至45分钟检测到特征化合物。
[0032]
施用到受试者的组合物可以包含氨基酸前体。这可以代替或补充氨基酸和/或糖。优选地，氨基酸前体是苯丙氨酸。优选地，氨基酸前体与其各自的氨基酸组合使用。因此，优选地，组合物包含酪氨酸和苯丙氨酸。
[0033]
优选地，氨基酸前体以至少500mg/100ml，至少1000mg/100ml，至少2000mg/100ml，至少3000mg/100ml至少4000mg/100ml或至少5000mg/100ml的浓度存在于组合物中。优选地，氨基酸前体以至少500mg/100ml，至少1000mg/100ml，至少2000mg/100ml，至少3000mg/100ml至少4000mg/100ml或至少5000mg/100ml的浓度存在于组合物中。优选地，氨基酸前体以500mg/100ml至10000mg/100ml，500mg/100ml至5000mg/100ml，500mg/100ml至4000mg/100ml，500mg/100ml至3000mg/100ml，500mg/100ml至2500mg/100ml，500mg/100ml至2000mg/100ml，1000mg/100ml至10000mg/100ml，1500mg/100ml至10000mg/100ml，2000mg/100ml至10000mg/100ml，2500mg/100ml至10000mg/100ml，3000mg/100ml至10000mg/100ml，1000mg/100ml至5000mg/100ml，1000mg/100ml至3000mg/100ml，1000mg/100ml至2500mg/100ml，1000mg/100ml至2000mg/100ml，1500mg/100ml至10000mg/100ml，1500mg/100ml至5000mg/100ml，1500mg/100ml至3000mg/100ml，1500mg/100ml至2500mg/100ml，或1500mg/100ml至2000mg/100ml的浓度存在于组合物中。
[0034]
优选地，氨基酸前体是苯丙氨酸。优选地，苯丙氨酸以3000mg/100ml的浓度存在。
[0035]
优选地，该组合物包含苯丙氨酸和酪氨酸。
[0036]
在一个实施方案中，该组合物包含酪氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸。优选地，酪氨酸以至少2,000mg/100ml的浓度存在，苯丙氨酸以至少3,000mg/100ml的浓度存在，并且谷氨酸以至少2,100mg/100ml的浓度存在。
[0037]
优选地，多元醇以大于25,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。优选地，多元醇以大于26,000mg/100ml，大于27,000mg/100ml，大于28,000mg/100ml，或大于29,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。优选地，多元醇以大于30,000mg/100ml，大于35,000mg/100ml，大于40,000mg/ml，大于45,000mg/100ml，大于50,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。优选地，多元醇以至少30,000mg/100ml，至少35,000mg/100ml，至少40,000mg/ml，至少45,000mg/100ml，至少50,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。
[0038]
优选地，多元醇以50,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。最优选地，多元醇以23,000mg/100ml至27,000mg/100ml，或24,000mg/100ml至26,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。
[0039]
优选地，多元醇是甘油。优选地，甘油以大于30,000g/ml，更优选50,000g/100ml的浓度存在于组合物中。最优选地，甘油以23,000mg/100ml至27,000mg/100ml，或24,000mg/100ml至26,000mg/100ml的浓度存在于组合物中。
[0040]
在一个实施方案中，至少一种糖和/或至少一种氨基酸或其前体，和/或至少一种多元醇被癌症相关的微生物代谢。
[0041]
应当理解，“预后”可能涉及确定已被诊断患有癌症的受试者的治疗结果。预后可能涉及预测受试者中的癌症进展或改善的速度和/或持续时间、存活概率和/或各种治疗方案的功效。因此，不良预后可能表明癌症进展、存活概率低和治疗方案的功效降低。良好的预后可能表明癌症的改善、存活概率高和治疗方案的功效增加。
[0042]
癌症相关的微生物可以是细菌。应当理解，肠道中存在的微生物和细菌形成所谓的“微生物组”。因此，将至少一种底物代谢成特征化合物的癌症相关的微生物优选地形成微生物组的一部分，所述特征化合物在本发明的方法中被检测和/或分析以诊断癌症。
[0043]
癌症相关的微生物可以是链球菌、乳杆菌、韦永氏菌、普氏菌、奈瑟菌、嗜血杆菌、乳酸杆菌(l.coleohominis)、毛螺菌科、克雷伯菌、梭菌、丹毒杆菌或它们的任何组合。
[0044]
癌症相关的微生物可以是化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、嗜酸乳杆菌或其任何组合。
[0045]
癌症相关的微生物可能是大肠杆菌(e.coli)、奇异假单胞菌(p.mirabili)、洋葱芽孢杆菌(b.cepacia)、化脓性链球菌(s.pyogenes)、唾液链球菌(streptococcus salivarius)、内氏放线菌(actinomyces naeslundii)、发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)、咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus)、双酶梭菌(clostridium bifermentans)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、败血症梭菌(clostridium septicum)、产孢梭菌(clostridium sporogenes)、特氏梭菌(clostridium tertium)、迟缓真杆菌(eubacterium lentum)、真杆菌属(eubacterium sp.)、猿疱梭杆菌(fusobacterium simiae)、坏死梭杆菌(fusobacterium necrophorum)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、黑色消化球菌(peptococcus niger)、厌氧消化链球菌(peptostreptococcus anaerobius)、不解糖消化链球菌(peptostreptococcus asaccharolyticus)、普氏消化链球菌(peptostreptococcus prevotii)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)、奇异假单胞菌(p.mirabilis)、粪肠球菌(e.faecalis)、肺炎链球菌(s.pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(n.meningitides)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、毛状拟杆菌(bacteroides capillosus)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、化脓拟杆菌(bacteroides pyogenes)、艰难梭菌(clostridium difficile)、多枝梭菌(clostridium ramosum)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、诺卡氏菌属(nocardia sp.)、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)、丙酸杆菌(propionibacterium propionicum)或其任何组合。优选地，癌症相关的微生物是大肠杆菌、发酵乳杆菌、唾液链球菌、咽峡炎链球菌或肺炎克雷伯菌。在一个实施方案中，癌症是食管-胃结合部癌、胃癌、食管癌、食管鳞状细胞癌(escc)、食管腺癌(eac)。因此，在优选的实施方案中，诊断用于诊断食管-胃结合部癌、胃癌、食管癌、食管鳞状细胞癌(escc)或食管腺癌(eac)。最优选地，癌症是食管-胃癌，从而可以诊断或预测该病症。癌症可能是转移性的。
[0046]
优选地，癌症是胃癌、食管癌或转移癌。
[0047]
在一个实施方案中，癌症是胰腺癌或结肠直肠癌。因此，诊断或预后可以用于诊断或预后胰腺癌或结肠直肠癌。
[0048]
在第二方面，提供一种用于检测受试受试者中的特征化合物的方法，该方法包括：
[0049]
(i)向受试者提供包含至少一种形成特征化合物的根据第一方面的底物的组合
物；和
[0050]
(ii)检测来自受试者的身体样品中的特征化合物的浓度。
[0051]
优选地，根据第一方面执行检测步骤。
[0052]
在本发明的第三方面，提供一种组合物，所述组合物包含适于代谢成特征化合物的至少一种糖和/或至少一种氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇，其中所述糖以大于20,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，并且氨基酸以至少500mg/ml的浓度存在于组合物中，并且多元醇以大于25,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，用于诊断或预后，优选癌症的诊断或预后方法。
[0053]
优选地，组合物和癌症如第一方面中所定义。
[0054]
在第四方面，提供一种组合物，该组合物包含至少一种适合被癌症相关的微生物代谢成特征化合物的底物，用于在第一或第二方面的方法中使用。
[0055]
在第五方面，提供一种用于诊断患有癌症或具有癌症的易感性的受试者，或用于提供受试者病症的预后的试剂盒，该试剂盒包含：
[0056]
(a)包含至少一种如第一方面所定义的底物的组合物；
[0057]
(b)用于确定测试受试者样品中的特征化合物的浓度的装置；和
[0058]
(c)来自未患癌症的个体样品中的特征化合物的浓度的参考，
[0059]
其中该试剂盒用于鉴定来自测试受试者的身体样品中的特征化合物的浓度与参考相比增加或减少，从而表明该受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或提供受试者病症的负面预后。
[0060]
优选地，组合物和癌症如第一方面中所定义。
[0061]
第一和第二方面的方法可以包括向受试者施用或已经施用治疗剂或使受试者接受专门的饮食或进行化疗或放化疗，以预防、减少或延迟癌症的进展。
[0062]
因此，在第六方面，提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
[0063]
(i)向受试者提供包含至少一种如第一方面定义的底物的组合物；
[0064]
(ii)分析来自测试受试者的身体样品中的至少一种底物的代谢产生的特征化合物的浓度，并将该浓度与未患癌症的个体中的浓度特征化合物的参考比较，其中来自测试受试者的身体样品中的特征化合物的浓度与参考相比的增加或减少表明该受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或具有负面预后；和
[0065]
(iii)向受试者施用或已经施用治疗剂或使受试者接受专门的饮食或进行化疗或放化疗，其中治疗剂或专门的饮食或化疗或放化疗可预防、减少或延缓癌症的进展。
[0066]
优选地，组合物和癌症如第一方面中所定义。
[0067]
本发明的方法可用于监测相关癌症的治疗功效。例如，可切除的食管-胃癌的治疗可能包括新辅助化疗，或手术后放化疗和辅助化疗。极早期食管-胃癌的治疗可以包括内窥镜切除术。晚期食管-胃癌的治疗可以包括姑息性化疗。最近有证据表明癌症相关的微生物组增强肝脏转移(bullman等人，science，2017)。因此，本文所述的发明可用于监测针对癌症相关的微生物组的治疗反应。
[0068]
如果癌症是胰腺癌，则治疗可以包括化疗、具有或不具有手术的放化疗的施用。例如，如果癌症是结肠直肠癌，则治疗可以包括化疗、具有或不具有手术的放化疗或内窥镜切
除术的施用。
[0069]
在第七方面，提供一种用于确定用治疗剂或专门的饮食或化疗或放化疗治疗患有癌症的受试者的功效的方法，该方法包括：
[0070]
(i)向受试者提供包含至少一种根据第一方面的底物的组合物；和
[0071]
(ii)分析来自测试受试者的身体样品中的至少一种底物的代谢产生的特征化合物的浓度，并将该浓度与未患有癌症的个体中的特征化合物的浓度的参考比较，
[0072]
其中来自测试受试者的身体样品中的特征化合物的浓度与参考相比的增加或减少表明使用治疗剂或专门饮食或化疗或放化疗的治疗方案是有效的或无效的。
[0073]
优选地，组合物和癌症如第一方面中所定义。
[0074]
该组合物可以是包含上述成分中的任一种的现有的组合物、食品或饮料。优选地，组合物包含水。本发明的组合物被受试者摄取。该组合物可以是可以被消耗或吞咽的固体或流体。在一个实施方案中，该组合物可以是可咀嚼的，这导致底物的释放并将其带入肠道。在一个实施方案中，组合物可以是胶囊的形式，其被设计为在胃肠道的特定位置降解，从而提供至少一种底物的靶向释放。然而，该组合物优选是可以被吞咽并且可以被称为口服兴奋剂饮料(osd)的液体(即饮料)。
[0075]
优选地，从受试者采集样品，然后检测身体样品中的特征化合物。在一些实施方案中，测量特征化合物的浓度。
[0076]
特征化合物可以是能够指示微生物的存在或与微生物的存在相关的任何化合物。检测到的特征化合物可能是导致发酵特性的挥发性有机化合物(voc)，并且它们可以通过多种技术在身体样品中检测到。在一个实施方案中，这些化合物可以在它们溶解在其中的液体或半固体样品中检测到。然而，在一个优选的实施方案中，从气体或蒸气中检测化合物。例如，由于特征化合物是voc，它们可能从样品中散发出来或形成样品的一部分，并且因此可能以气态或蒸汽形式被检测到。
[0077]
这些特征化合物的浓度与参考相比增加或减少表明受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或提供受试者病症的负面预后。优选地，这些特征化合物的浓度与参考相比增加表明受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或提供受试者病症的负面预后。
[0078]
voc可以是短链脂肪酸、醛、醇或其任何组合。
[0079]
voc可以是c
1-c3醛、c
1-c3醇、c
2-c
10
烷烃，其中第一碳原子被＝o基团取代并且第二碳原子被-oh基团、c
1-c
20
烷烃、c
4-c
10
醇、c
1-c6羧酸、c
4-c
20
醛、任选被c
1-c6烷基取代的苯酚、c2醛、c3醛、c8醛、c9醛、c
10
醛、c
11
醛、任何上述的类似物或衍生物种，或它们的任何组合取代。
[0080]c1-c6羧酸可以选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸。c
1-c3醛可以选自甲醛、乙醛和丙醛。c
4-c
20
醛可以是c
4-c
10
醛。c
4-c
20
醛可以选自丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、十二醛、十三醛、十四醛、十五醛、十六醛、十七醛、十八醛、十九醛和二十烷醛。c
1-c
20
烷烃优选为c
4-c
16
烷烃，更优选为c
8-c
14
烷烃。c
1-c
20
烷烃可以是甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷和二十烷。苯酚可以是未被取代的。或者，苯酚可以在反式位置被c
1-c6烷基取代。苯酚可以被c
1-c3烷基取代。任选地被c
1-c6烷基取代的苯酚可以是苯酚、1-羟基-4-乙苯或对甲酚。
[0081]
优选地，挥发性有机化合物(voc)选自：乙酸、丁酸、己酸、戊酸、丙酸、乙醛、癸醛、
庚醛、己醛、壬醛、辛醛、戊醛、丁醛、丙醛、1-羟基-4-乙苯、癸烷、十二烷、对甲酚和苯酚或其任何组合。
[0082]
当底物是糖，优选葡萄糖时，特征化合物可以是乙酸、丁酸、戊酸、丙酸、己酸、乙醛、丙醛、丁醛、己醛、戊醛、癸醛、1-羟乙基苯和/或对甲酚。
[0083]
当底物是糖，优选葡萄糖时，乙酸、丁酸、戊酸、丙酸、乙醛、丁醛、己醛、戊醛、1-羟乙基苯和/或对甲酚的增加可能指示胃癌。优选地，当底物是葡萄糖并且特征化合物是丁酸时，特征化合物的浓度的增加是丁酸化合物浓度与参考相比增加至少300％并且指示胃癌。优选地，当底物是葡萄糖并且特征化合物是丙酸时，特征化合物的浓度增加是与参考相比丙酸化合物浓度增加至少100％并且指示胃癌。优选地，当底物是葡萄糖并且特征化合物是乙酸时，特征化合物的浓度的增加是与参考物相比乙酸化合物浓度增加至少200％并且指示胃癌。优选地，当底物是葡萄糖并且特征化合物是戊酸时，特征化合物的浓度增加是与参考物相比戊酸化合物的浓度的至少50％的增加并且指示胃癌。
[0084]
当底物是糖，优选葡萄糖时，乙酸、戊酸、丙酸、丁醛、丙醛和/或己酸的增加可能指示食管癌。优选地，当底物是葡萄糖并且特征化合物是丁酸、丙酸和/或乙酸时，特征化合物的浓度的增加是与参考物相比丁酸、丙酸和/或乙酸化合物的浓度的至少50％的增加并且指示食管癌。
[0085]
当底物是糖，优选葡萄糖，并与柠檬酸组合时，特征化合物丁酸、丙酸和/或丙醛的增加可能指示食管癌。
[0086]
当底物是糖，优选葡萄糖，并与柠檬酸组合时，特征化合物丁酸、丙酸和/或丙醛的增加可能指示胃癌。
[0087]
当底物是氨基酸或其前体时，特征化合物可以是丁醛、癸醛、庚醛、己醛、苯酚、癸烷、对甲酚、1-羟乙基苯和/或十二烷。优选地，当底物是氨基酸或其前体时，特征化合物的浓度的增加与参考相比至少增加10％、20％、30％、40％或50％。
[0088]
当底物是酪氨酸时，特征化合物可以是丁醛、癸醛、庚醛、己醛、苯酚、癸烷、对甲酚和/或十二烷。优选地，特征化合物是癸醛和/或十二烷。优选地，当底物是酪氨酸时，特征化合物的浓度增加与参考相比至少增加10％、20％、30％、40％或50％。
[0089]
当底物是酪氨酸时，癸醛的增加可能指示食管癌。
[0090]
当底物是酪氨酸时，十二烷的增加可能指示胃癌。
[0091]
当底物是苯丙氨酸时，特征化合物可以是十二烷、癸烷、苯酚、癸醛和/或十二烷。
[0092]
当底物是苯丙氨酸时，特征化合物癸醛、l-羟乙基苯、癸烷、十二烷、对甲酚和/或苯酚的增加可能指示食管癌。
[0093]
当底物是苯丙氨酸时，特征化合物羟乙基苯、癸烷、十二烷、对甲酚和/或苯酚的增加可能指示胃癌。
[0094]
当底物是谷氨酸时，特征化合物可以是丙醛、十二烷、苯酚和/或丁酸。
[0095]
当底物是谷氨酸时，特征化合物丙醛、十二烷、苯酚和/或丁酸的增加可能指示食管癌。
[0096]
当底物是谷氨酸时，特征化合物丙醛、十二烷、苯酚和/或丁酸的增加可能指示胃癌。
[0097]
当底物是多元醇，优选甘油时，特征化合物可以是丁酸、乙酸、己酸、戊酸、丙酸、丁
醛、己醛、戊醛和/或丙醛。
[0098]
当底物是多元醇，优选甘油时，特征化合物丁酸、乙酸、己酸、戊酸、丙酸、丁醛、己醛、戊醛和/或丙醛的增加可能指示食管癌。
[0099]
当底物是多元醇，优选甘油时，特征化合物丁酸、乙酸、己酸、戊酸、丙酸、丁醛、己醛、戊醛和/或丙醛的增加可能指示胃癌。
[0100]
优选地，样品是特征化合物存在或分泌到其中的任何身体样品。优选地，检测或诊断方法因此在体外进行。然而，预后方法可能在体内进行。例如，样品可以包括尿液、粪便、头发、汗液、唾液、血液或眼泪。在一种实施方案中，可以立即分析样品的特征化合物水平。或者，样品可以在低温下储存，例如在冰箱中或甚至在确定特征化合物的浓度之前冷冻。身体样品中的特征化合物的测量可以在整个样品或处理过的样品，例如全血或经处理的血液上进行。
[0101]
在一个实施方案中，样品可以是尿液样品。优选地，身体样品中的特征化合物的浓度从取自受试者的尿液样品体外测量。可以从尿液样品中散发的气体或蒸汽中检测到该化合物。应当理解，优选检测从尿液排出的气相中的化合物。
[0102]
还应当理解，“新鲜”身体样品可以在它们从受试者身上取出后立即进行分析。或者，样品可以冷冻和储存。然后可以对样品进行除霜并在以后进行分析。
[0103]
然而，最优选地，身体样品可以是来自测试受试者的呼吸样品。样品可以通过受试者通过嘴进行呼气来收集，优选地在鼻吸入后。优选地，样品包括受试者的肺泡空气。优选地，通过捕获呼气末呼吸在死腔空气上方收集肺泡空气。来自呼吸袋的voc然后优选地通过将呼吸穿过管而被预浓缩到热解吸管上。
[0104]
指示受试者中的癌症或具有癌症的易感性的特征化合物的浓度差异与参考相比可能增加或减少。应当理解，患有疾病的患者中的特征化合物的浓度高度取决于多种因素，例如疾病进展的程度以及受试者的年龄和性别。还应当理解，未患该疾病的个体中的特征化合物的参考浓度可能会在一定程度上波动，但平均而言，在给定的时间段内，该浓度趋于基本上恒定。此外，应当理解，一组患有疾病的个体中的特征化合物的浓度可能与另一组未患有该疾病的个体中的该化合物的浓度不同。然而，可以确定未患癌症的个体中的特征化合物的平均浓度，并且这被称为特征化合物的参考或“正常”浓度。正常浓度对应于上述参考值。
[0105]
在一个实施方案中，本发明的方法优选地包括确定呼吸中的化学物质的比率(即使用其中的其他组分作为参考)，然后将这些标志物与疾病比较以显示它们是升高或降低。
[0106]
特征化合物优选地是挥发性有机化合物(voc)，其提供特性，并且它可以通过多种技术在身体样品中或从身体样品中检测到。因此，可以使用气体分析仪检测这些化合物。用于检测特征化合物的合适检测器的实例优选包括电化学传感器、半导体金属氧化物传感器、石英晶体微天平传感器、光学染料传感器、荧光传感器、导电聚合物传感器、复合聚合物传感器或光谱法。
[0107]
发明人已经证明可以使用气相色谱、质谱、gcms或tof可靠地检测特征化合物。专用传感器可用于检测步骤。
[0108]
参考值可以通过分析统计学上显著数量的对照样品(即来自未患疾病的受试者的样品)来获得。因此，根据本发明第五方面的试剂盒的参考(ii)可以是对照样品(用于测
定)。
[0109]
该装置优选包括对应于特征化合物的阳性对照(最优选提供在容器中)。该装置优选包括阴性对照(优选提供在容器中)。在一个优选的实施方案中，该试剂盒可以包括参考、阳性对照和阴性对照。试剂盒还可以根据需要包含其他对照，例如“掺入(spike-in)”对照以提供浓度的参考，以及每个特征化合物或其类似物或衍生物的其他阳性对照。
[0110]
因此，发明人已经意识到参考标准(即对照)和增加/减少水平之间的特征化合物的浓度差异，可以用作生理标志物，暗示测试受试者中疾病的存在。应当理解，如果受试者的一种或多种特征化合物的浓度升高/降低，该浓度显著高于/低于参考中的该化合物的“正常”浓度，即对照值，那么与该化合物的浓度仅略高于/低于“正常”浓度的情况相比，他们将处于患有该疾病或更晚期的病症的更高风险。
[0111]
熟练的技术人员将了解如何测量统计学上显著数量的对照个体中的特征化合物的浓度，以及测试受试者中的化合物的浓度，并且然后使用这些各自的数字来确定测试受试者是否具有化合物浓度的统计学上显著的增加/降低，并因此推断该受试者是否患有该受试者已被筛选的疾病。
[0112]
第五方面的试剂盒可以包括用于从测试受试者获得样品的样品提取装置。样品提取装置可以包括针或注射器等。该试剂盒可以包括用于接收提取的样品的样品收集容器，该样品可以是液体、气体或半固体。该试剂盒还可以包括使用说明。
[0113]
另一方面，提供一种用于诊断患有癌症或具有癌症的易感性的受试者，或用于提供受试者病症的预后的方法，该方法包括：
[0114]
(i)在来自测试受试者的身体样品中检测由存在于先前施用到受试者的组合物中的至少一种糖和/或至少一种氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的代谢产生的特征化合物的浓度，其中糖以大于20,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，氨基酸或其前体以至少500mg/ml的浓度存在于组合物中，并且多元醇以大于30,000mg/100ml的浓度存在于组合物中；和
[0115]
(ii)将该浓度与未患癌症的个体中的特征化合物的浓度的参考比较，其中特征化合物的浓度与参考相比增加或减少表明受试者患有癌症，或具有癌症的易感性，或提供受试者病症的负面预后。
[0116]
另一方面，提供包含适于代谢成特征化合物的至少一种糖和/或至少一种氨基酸或其前体和/或至少一种多元醇的组合物，其中所述糖以大于20,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，并且氨基酸以至少500mg/ml的浓度存在于组合物中，并且多元醇以大于30,000mg/100ml的浓度存在于组合物中，用于诊断或预后，优选癌症的方法。
[0117]
在此描述的所有特征(包括任何随附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合与任何上述方面组合，除非组合中的至少一些这些特征和/或步骤是相互排斥的。
[0118]
为了更好地理解本发明，并显示如何实施本发明的实施方案，现在将通过示例的方式参考附图，其中：
[0119]
图1显示用于将来自钢制呼吸袋的voc浓缩到热解吸管上的装置和方法的实施方案；
[0120]
图2显示在不同剂量的呼出气中检测到的丁酸浓度(上图显示倍数变化；下图显示
浓度(ppbv)。在受试者1中消耗葡萄糖后5-10分钟，25-75g葡萄糖的最佳剂量反应；
[0121]
图3显示在不同剂量的呼出气中检测到的丁酸浓度。在受试者2中消耗葡萄糖后5-15分钟，25-75g葡萄糖的最佳剂量反应；
[0122]
图4显示在不同剂量的呼出气中检测到的丁酸浓度**仅完成5个剂量的2个剂量。在葡萄糖消耗后5-10分钟，25-50g葡萄糖的剂量反应相当。与受试者3中的25g葡萄糖相比，50g葡萄糖显示出大约两倍的变化；
[0123]
图5显示在不同剂量的呼出气中检测到的丁酸浓度。在受试者4中消耗葡萄糖后5-10分钟，10-75g葡萄糖的最佳剂量反应；
[0124]
图6显示75g葡萄糖呼出气中的挥发性丁酸浓度的受试者比较(n＝3)；
[0125]
图7显示50g葡萄糖呼出气中的挥发性丁酸浓度的受试者比较(n＝4)；
[0126]
图8显示25g葡萄糖呼出气中的挥发性丁酸浓度的受试者比较(n＝4)；
[0127]
图9显示10g葡萄糖呼出气中的挥发性丁酸浓度的受试者比较(n＝3)；
[0128]
图10a至10e显示在葡萄糖消耗后5-10分钟下所测试的挥发性短链脂肪酸(乙酸、丁酸、己酸、戊酸和丙酸)的数量最大增加；
[0129]
图11a至11i显示在5分钟(丁醛、癸醛、丙醛)和15分钟(戊醛)时，测试的挥发性醛的数量最大增加；
[0130]
图12a至12e显示在消耗葡萄糖5分钟后，测试的多种挥发性苯酚物质的呼出气浓度增加(1-羟基-4-乙苯、十二烷、对甲酚、苯酚)；
[0131]
图13a至13e显示在酪氨酸消耗后，所测试的挥发性短链脂肪酸没有表现出显著变化；
[0132]
图14a至14i显示在摄入酪氨酸后约30分钟，许多测试的挥发性醛(丁醛、癸醛、庚醛和己醛)表现出小幅增加；
[0133]
图15a至15e显示在消耗酪氨酸后35-45分钟，挥发性苯酚的呼出气浓度稍微增加(不包括1-羟基-4-乙苯)；
[0134]
图16显示在浓度为25g/100ml的四种不同糖的不同剂量下在呼出气中检测到的丁酸浓度；
[0135]
图17显示在呼出气中使用3g苯丙氨酸检测到的癸醛浓度。在苯丙氨酸消耗后15分钟观察到最佳反应；
[0136]
图18显示在呼出气中用3g苯丙氨酸检测到的十二烷浓度。在苯丙氨酸消耗后10分钟观察到最佳反应；
[0137]
图19显示在呼出气中用3g苯丙氨酸检测到的苯丙氨酸浓度。在用3g苯丙氨酸的苯丙氨酸消耗后60分钟观察到最佳反应；
[0138]
图20显示在呼出气中用3g苯丙氨酸检测到的癸烷浓度。在苯丙氨酸消耗后15分钟观察到最佳反应；
[0139]
图21a和b显示(a)癸醛(b)十二烷(c)苯酚和(d)癸烷的苯丙氨酸和酪氨酸消耗量之间的比较。与酪氨酸相比，苯丙氨酸表现出更高的voc反应，最显著的是癸醛和十二烷；
[0140]
图22显示呼出气中检测到的丙醛浓度。在谷氨酸消耗后5分钟观察到最佳反应；
[0141]
图23显示呼出气中检测到的十二烷浓度。在谷氨酸消耗后20分钟观察到最佳反应；
[0142]
图24显示呼出气中检测到的苯酚浓度。在苯丙氨酸消耗后35-45分钟观察到最佳反应；
[0143]
图25显示呼出气中检测到的丁酸浓度。在谷氨酸消耗后5分钟观察到最佳反应。这可能是在氨基酸转氨过程中产生酮酸的次要原因。酮酸在柠檬酸循环中用作糖酵解的中间体；
[0144]
图26显示受试者1在不同剂量的甘油的呼出气中检测到的丁酸浓度。在甘油消耗后45-55分钟50g甘油的最佳剂量反应；
[0145]
图27显示在受试者2中在不同剂量的甘油下在呼出气中检测到的丁酸浓度。在甘油消耗后45-55分钟50g甘油的最佳剂量反应；
[0146]
图28显示50g甘油的呼出气中的挥发性丁酸浓度的受试者比较；
[0147]
图29显示50g甘油的呼出气中的挥发性丁酸浓度的受试者比较；
[0148]
图30a至30e显示，在食管癌组中，在消耗25g甘油后45-60分钟，测试的挥发性短链脂肪酸(即乙酸、丁酸和丙酸)的数量最大增加；
[0149]
图31a至31i显示，对于食管癌组，在消耗25g甘油后40-55分钟，测试的挥发性醛的数量最大(己醛、丙醛、辛醛和戊醛)；
[0150]
图32a至32e显示，在消耗25g甘油后，三个患者组之间测试的许多挥发性苯酚的呼出气浓度没有变化；
[0151]
图33显示呼出气中检测到的癸醛浓度。食管胃癌组在消耗复合氨基酸饮料后30分钟观察到最佳反应；
[0152]
图34a至34e显示食管癌组在消耗氨基酸饮料后40分钟下对甲酚显著增加。苯酚和癸烷在癌症和非癌症组中均呈全面增长趋势；
[0153]
图35a至35e显示在消耗葡萄糖和柠檬酸组合后，对照组中的挥发性短链脂肪酸(即丁酸和丙酸)的浓度增加；和
[0154]
图36显示在消耗葡萄糖和柠檬酸组合后，对照组中的丙醛的浓度增加。
[0155]
材料和方法
[0156]
实施例1-葡萄糖剂量研究
[0157]
受试者
[0158]
四名健康受试者自愿参与并获得知情书面同意。
[0159]
剂量浓度
[0160]
四种剂量的底物由(i)食品和营养委员会推荐的每日摄入量和(ii)已经建立的葡萄糖耐量试验指导。葡萄糖耐量试验采用患者满意的溶解在100ml水中的可接受的75g葡萄糖。成人的每日最大推荐剂量为每天130g。[i]基于这些发现，发明人选择75g、50g、25g、10g的剂量，以比较剂量反应对葡萄糖浓度的影响。所有发现都与0g基线比较。
[0161]
呼吸取样
[0162]
短链脂肪酸的检测方法建立在选择离子流管质谱仪(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上。所有呼吸取样都在早上进行，并且受试者在呼吸取样之前至少保持清淡的流质饮食至少6小时。所有受试者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的葡萄糖，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5
分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0163]
sift-ms
[0164]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o 、no 和o2 )被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。数据以十亿分之几的浓度获得。
[0165]
糖
[0166]
比较4种不同的糖，每种25克的剂量。在最初的葡萄糖研究后选择25g，其中在25g和75g之间观察到类似的voc浓度。葡萄糖、乳糖和甘露糖遵循在消耗糖后10分钟最大增加的类似模式(图16)。乳糖是由葡萄糖和半乳糖二者组成的二糖，不希望受任何特定理论的束缚，预计将遵循与葡萄糖类似的模式。类似地，甘露糖是单糖，也已知是葡萄糖的异构体，并且不希望受任何特定理论的束缚，认为甘露糖通过相同的糖酵解途径代谢。
[0167]
葡萄糖
[0168]
患者选择
[0169]
所有患者在2019年2月至2019年5月从圣玛丽医院招募。从三个队列中招募患者；食管癌(n＝6)、胃癌(n＝6)和年龄匹配的健康对照(n＝6)。所有参与者都获得知情的书面同意。被诊断为食管胃腺癌的患者范围从治愈途径上的早期疾病到转移性姑息性疾病。年龄匹配的健康对照包括患有良性上消化道疾病(反流、运动障碍)的患者或健康的无症状对照。整理人口统计学和临床信息。
[0170]
呼吸取样
[0171]
用于检测4类挥发性化合物短链脂肪酸、醇、醛和苯酚-烷烃的方法在选择离子流管-质谱(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上建立。所有的呼吸取样都在早上进行，并且患者在呼吸取样之前至少要保持清淡的流质饮食至少6小时。所有患者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，接着消耗溶解在100ml温水中的25g葡萄糖，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0172]
sift-ms
[0173]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o 、no 和o2 )被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。
[0174]
统计分析
[0175]
数据以十亿分之几的浓度获得。使用spss统计软件(v25，armonk ny；ibm corp)对三组进行单变量kruskal wallis分析。进行mann whitney u检验以确定食管癌和胃癌与对照组之间的差异。p值《0.05被认为具有统计学意义。
[0176]
实施例2-酪氨酸
[0177]
患者选择
[0178]
所有患者在2019年2月至2019年5月从圣玛丽医院招募。从三个队列中招募患者；
食管癌(n＝6)、胃癌(n＝6)和年龄匹配的健康对照(n＝6)。所有参与者都获得知情的书面同意。诊断为食管胃腺癌的患者范围从治愈途径上的早期疾病到转移性姑息性疾病。年龄匹配的健康对照包括患有良性上消化道疾病(反流、运动障碍)的患者或健康的无症状对照。整理人口统计学和临床信息。
[0179]
呼吸取样
[0180]
用于检测4类挥发性化合物短链脂肪酸、醇、醛和苯酚-烷烃的方法在选择离子流管-质谱(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上建立。所有呼吸取样均在早上进行，并且患者在呼吸取样之前保持清淡流质饮食至少6小时。所有患者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的2克酪氨酸，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0181]
sift-ms
[0182]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o 、no 和o2 )被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。
[0183]
统计分析
[0184]
数据以十亿分之几的浓度获得。使用spss统计软件(v25，armonk ny；ibm corp)对三组进行单变量kruskal wallis分析。进行mann whitney u检验以确定食管癌和胃癌与对照组之间的差异。p值《0.05被认为具有统计学意义。
[0185]
实施例3-苯丙氨酸
[0186]
受试者：一名健康受试者
[0187]
剂量浓度：由食品和营养委员会建议的每日推荐摄入量为成人每天100mg/kg，最大剂量为3g。[l]对于本研究选择单剂量3g。
[0188]
呼吸取样
[0189]
用于检测短链脂肪酸、醛和苯酚烷烃的方法建立在选择离子流管-质谱法(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上。所有的呼吸取样都在早上至少6小时的清流饮食后进行。呼气使用一次性吸嘴直接进入sift-ms的入口。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的苯丙氨酸，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0190]
sift-ms
[0191]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o 、no 和o2 )被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。数据以十亿分之几的浓度获得。
[0192]
实施例4-谷氨酸
[0193]
受试者：一名健康受试者。
[0194]
剂量浓度
[0195]
由食品和营养委员会建议的每日推荐摄入量为成人每天30mg/kg。[1]为平均70kg的成年人选择2.1g的单次最大剂量。
[0196]
呼吸取样
[0197]
用于检测短链脂肪酸、醛和苯酚烷烃的方法建立在选择离子流管-质谱法(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上。所有的呼吸取样都在早上至少6小时的清流饮食后进行。呼气使用一次性吸嘴直接进入sift-ms的入口。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的谷氨酸，然后漱口水冲洗3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0198]
sift-ms
[0199]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o 、no 和o2 )被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。数据以十亿分之几的浓度获得。
[0200]
实施例5-甘油剂量
[0201]
受试者
[0202]
两名健康受试者自愿参与并获得知情书面同意。
[0203]
剂量浓度
[0204]
两种剂量的底物由(i)食品和营养委员会推荐的每日摄入量和(ii)初始葡萄糖方法开发研究指导。成人的每日最大推荐剂量为276mg/kg，然而，没有报告更高剂量的危害。[1]建议一个平均70kg的人至多摄入19g甘油。基于这些发现，我们选择50g、25g、10g的剂量来比较剂量反应对葡萄糖浓度的影响。所有发现都与0g基线比较。
[0205]
呼吸取样
[0206]
用于检测短链脂肪酸和醛的方法建立在选择离子流管-质谱法(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上。所有呼吸取样都在早上进行，并且受试者在呼吸取样之前至少保持清淡的流质饮食至少6小时。所有受试者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的甘油，然后用漱口水冲洗3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0207]
sift-ms
[0208]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o 、no 和o2 )被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。数据以十亿分之几的浓度获得。
[0209]
实施例6-甘油
[0210]
患者选择
[0211]
所有患者在2019年2月至2019年12月从圣玛丽医院招募。从三个队列中招募患者；
食管癌(n＝6)、胃癌(n＝6)和年龄匹配的健康对照(n＝6)。所有参与者都获得知情的书面同意。被诊断为食管胃腺癌的患者范围从治愈途径上的早期疾病到转移性姑息性疾病。年龄匹配的健康对照包括患有良性上消化道疾病(反流、运动障碍)的患者或健康的无症状对照。整理人口统计学和临床信息。
[0212]
呼吸取样
[0213]
用于检测4类挥发性化合物短链脂肪酸、醇、醛和苯酚-烷烃的方法在选择离子流管-质谱(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上建立。所有呼吸取样都在早上进行，并且患者在呼吸取样之前至少保持清淡的流质饮食至少6小时。所有患者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的25g甘油，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0214]
sift-ms
[0215]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o

、no

和o
2
)被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。
[0216]
统计分析
[0217]
数据以十亿分之几的浓度获得。使用spss统计软件(v25，armonk ny；ibm corp)对三组进行单变量kruskal wallis分析。进行mann whitney u检验以确定食管癌和胃癌与对照组之间的差异。p值《0.05被认为具有统计学意义。
[0218]
实施例7-组合的氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸)
[0219]
患者选择
[0220]
所有患者在2019年2月至2019年12月从圣玛丽医院招募。从三个队列中招募患者；食管癌(n＝6)、胃癌(n＝i)和年龄匹配的健康对照(n＝6)。所有参与者都获得知情的书面同意。被诊断为食管胃腺癌的患者范围从治愈途径上的早期疾病到转移性姑息性疾病。年龄匹配的健康对照包括患有良性上消化道疾病(反流、运动障碍)的患者或健康的无症状对照。整理人口统计学和临床信息。
[0221]
呼吸取样
[0222]
用于检测4类挥发性化合物短链脂肪酸、醇、醛和苯酚-烷烃的方法在选择离子流管-质谱(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上建立。所有呼吸取样均在早上进行，并且患者在呼吸取样之前保持清淡的流质饮食至少6小时。所有患者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的2g酪氨酸、3g苯丙氨酸和2.1g谷氨酸，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多60分钟(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60min)。
[0223]
sift-ms
[0224]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o

、no

和o
2
)被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与
前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。
[0225]
统计分析
[0226]
数据以十亿分之几的浓度获得。使用spss统计软件(v25，armonk ny；ibm corp)对癌症和非癌症进行mann whitney u分析。p值《0.05被认为具有统计学意义。
[0227]
实施例8-组合的葡萄糖和柠檬酸
[0228]
患者选择
[0229]
所有患者在2019年2月至2019年12月从圣玛丽医院招募。招募12名健康对照以形成两个队列来消耗；葡萄糖(n＝6)，和组合的葡萄糖和柠檬酸(n＝6)。所有参与者都获得知情的书面同意。年龄匹配的健康对照包括患有良性上消化道疾病(反流、运动障碍)或健康无症状对照的患者。
[0230]
呼吸取样
[0231]
用于检测4类挥发性化合物短链脂肪酸、醇、醛和苯酚-烷烃的方法在选择离子流管-质谱(sift-ms voiceultra 200；syft technologies，anatune，uk)上建立。所有呼吸取样均在早上进行，并且患者在呼吸取样前保持清淡的流质饮食至少6小时。所有患者都使用一次性咬嘴直接呼气到sift-ms的入口中。对每种方法进行基线呼气测试，然后消耗溶解在100ml温水中的25g葡萄糖和1.4g柠檬酸，然后用漱口水漱口3次以净化口腔。在60秒内对3个呼出气样品进行直接取样，所有四种方法以5分钟的间隔连续进行至多30分钟(0，5，10，15，20，25，30min)。
[0232]
sift-ms
[0233]
sift-ms允许使用化学电离实时量化和识别呼出气中的voc。前体离子(h3o

、no

和o
2
)被排放到四极杆质量过滤器中，并被惰性氦气沿流管携带。呼吸被注射到流量管中以与前体离子反应以产生产物离子，这些产物离子随后根据质荷比(m/z)分离。sift-ms接受每日自动验证循环，以在10-30℃的温度下操作。
[0234]
统计分析
[0235]
数据以十亿分之几的浓度获得。使用spss统计软件(v25，armonk ny；ibm corp)对癌症和非癌症进行mann whitney u分析。p值《0.05被认为具有统计学意义。
[0236]
结果
[0237]
实施例1-葡萄糖剂量研究
[0238]
挥发性有机化合物分析
[0239]
表1在5-15分钟下在所有受试者的呼气中检测到的短链脂肪酸的中值浓度。
[0240][0241][0242]
葡萄糖浓度的增加与呼出气中检测到的挥发性脂肪酸浓度的增加呈正相关。丁酸和丙酸在葡萄糖消耗的5-15分钟内表现出最大反应，随后值下降。通过糖酵解途径的快速葡萄糖降解产生在呼出气中检测到的挥发性终产物。发明人的先前工作已经证明在消耗葡萄糖后漱口可消除源自口腔的潜在voc反应。丁酸和戊酸显示出10g和50g葡萄糖之间增加1倍的差异。这些化合物用于指导涉及患有食管-胃癌的患者的初步临床研究的推荐葡萄糖剂量。为了在足够的剂量反应和对患者可接受的饮料之间获得平衡，发明人选择溶解在100ml温水中的25g剂量。本研究的下一步将评估诊断为og癌症的患者与年龄匹配的健康对照相比的voc反应，以观察细胞代谢活动和voc反应的任何差异。
[0243]
表2参与者的人口统计学和临床信息。
[0244][0245][0246]
*中值
[0247]
表3.通过选择离子流管质谱分析的挥发性有机化合物的详细信息
[0248][0249][0250]
葡萄糖
[0251]
挥发性有机化合物分析
[0252]
短链脂肪酸
[0253]
表4挥发性短链脂肪酸(乙酸、丁酸、戊酸、丙酸)在葡萄糖消耗后5-10分钟最大增加
[0254][0255]
表5比较(i)对照与胃癌组和(ii)对照与食管癌组的mann whitney u检验；p《0.05被认为具有统计学意义(以粗体突出显示)
[0256][0257]
讨论
[0258]
呼出气中的三种化学类别的voc在诊断为食管-胃(og)癌症的患者中表现出显著
差异。来自短链脂肪酸(scfa)(n＝4)、醛(n＝6)和苯酚(n＝3)组的总共13种化合物在葡萄糖消耗后显示出浓度增加。
[0259]
挥发性scfa表现出呼吸浓度的最大变化；即丁酸和丙酸。在消耗后10分钟内达到最佳浓度，表明葡萄糖快速降解。葡萄糖，一种单糖，进入糖酵解途径产生在呼吸中检测到的代谢终产物。与基线值相比，在30分钟下检测到更高浓度的戊酸。这些结果表明，通过口腔底物通过操纵与og癌症相关的已知voc的内在代谢途径可以增强呼吸voc。在检测到的所有显著voc中，胃癌表现出比食管癌更强的反应。胃癌组的scfa(乙酸、丁酸、戊酸和丙酸)显示出显著的倍数变化，与食管癌组(乙酸和戊酸)具有两个显著性重叠。
[0260]
类似地，醛例如戊醛和丙醛遵循与scfa的类似反应模式，在5-10分钟下浓度最佳增加。剩余的醛在癌症组中显示出持续增加的水平，九个中有四个具有更高的基线值。在胃癌患者中，乙醛、丁醛、己醛和戊醛显示出自基线的倍数变化显著增加。食管癌患者仅使用丁醛和丙醛就显示出这种效果。相反，对于壬醛和辛醛，两组表现出在对照组中的显著增加倍数，这需要进一步探索。这些结果与本发明人发表的将挥发性丁酸、丁醛和癸醛与og癌症相关联的先前工作一致。[1]对于研究的持续时间，剩余的醛和苯酚烷烃(十二烷除外)在癌症组中的浓度持续增加。发明人小组先前的工作表明苯酚是og癌症中潜在的呼吸生物标志物。[2]
[0261]
来自苯酚家族的癸烷在两个癌症组中都显示出更高的基线浓度。需要进一步探索葡萄糖消耗后对照组的倍数增加。对甲酚观察到类似的反应模式，但仅在胃癌组中观察到倍数增加，这是一项新发现。这可能反映与胃中葡萄糖的汇集相比，葡萄糖被食管肿瘤的短暂传递。
[0262]
目前，nice指南建议对表现出提示og癌的“红旗”症状的患者在2周内进行上消化道内镜检查。[3]然而，该疾病的阴险性质表示大多数人出现非特异性症状，延迟诊断并转化为较差的总生存结果。无创呼气测试将充当分类工具以对具有非特异性上消化道症状的患者进行分层。og癌症的早期检测的呼吸生物标志物的鉴定具有为患者提供治愈性治疗并影响总生存结果的潜在性。该研究评估处于疾病早期和晚期阶段的患者。
[0263]
在临床实践中，可以使用以下方式收集呼出气：
[0264]-与热解吸管联接以促进样品储存和运输的呼气取样设备。
[0265]-如本研究所示，使用质谱法例如sift的直接取样。
[0266]-用于具有大反应的voc，例如乙酸、丁酸、戊酸和丙酸的专用传感器。
[0267]
关键点
[0268]
葡萄糖消耗激活与肿瘤微生物组或增加的肿瘤细胞的活性相关的代谢途径。这通过以下方式检测：
[0269]
·
scfa(乙酸、丁酸、戊酸和丙酸)的显著倍数增加；在胃癌中观察到比食管癌组中观察到的更多。
[0270]
·
醛显著增加；在胃癌组中乙醛、丁醛、己醛和戊醛。在食管癌中观察到丁醛和丙醛的增加。
[0271]
·
对于两个癌症组观察到基线浓度增加的癸烷和对甲酚的新发现。仅在胃癌中显示对甲酚倍数的增加。
[0272]
在摄入葡萄糖后，每隔两个间隔收集呼气样品以确定最佳浓度的voc；早期为5-10
分钟，晚期为30分钟。
[0273]
实施例2-酪氨酸
[0274]
表6参与者的人口统计学和临床信息。
[0275][0276][0277]
*中值
[0278]
表7通过选择离子流管质谱法分析的挥发性有机化合物的详细信息
[0279][0280]
挥发性有机化合物分析
[0281]
短链脂肪酸
[0282]
表8：挥发性短链脂肪酸在酪氨酸消耗后没有表现出显著变化。
[0283][0284]
*kruskal wallis分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0285]
醛
[0286]
表9挥发性醛(丁醛、癸醛、庚醛和己醛)在摄入酪氨酸后约30分钟显示出小幅增加。
[0287][0288]
*kruskal wallis分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0289]
苯酚
[0290]
表10挥发性苯酚表明在消耗酪氨酸后35-45分钟呼出气浓度稍微增加(不包括1-羟基-4-乙苯)。
[0291][0292]
*kruskal wallis分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0293]
表11：比较(i)对照与胃癌组和(ii)对照与食管癌组的mann whitney u检验；p《0.05被认为具有统计学意义(突出显示的粗体)。
[0294]
*对照组中显著增加。
[0295][0296]
讨论
[0297]
在消耗酪氨酸后30分钟，检测到浓度稍高的两种化学类别的挥发性化合物(苯酚和醛)。总共8种化合物表现出在食管癌组中的浓度小幅增加。潜在的生物学和机械途径表明酪氨酸，一种芳香族氨基酸，通过胃肠道细菌引发的酶促反应代谢为苯酚化合物。
[0298]
在酪氨酸消耗后35-45分钟检测到最佳浓度的挥发性酚化合物，尽管与报告的基线值相比小幅增加。苯酚和癸烷在各组之间显示出类似的增加模式，而在食管癌组中检测到的对甲酚和十二烷浓度略高。挥发性醛，即丁醛、癸醛、庚醛和己醛在食管癌组表现出与对照相比更高浓度(倍数变化1.46相比于1.32)。对照组中所有化合物的总体基线浓度明显更高。
[0299]
癸醛表现出在食管癌组中唯一显著的倍数增加，这被发明人先前工作支持，表明og癌症患者中醛(丁醛、癸醛)和苯酚的基线值显著更高。[1，2]缺乏与发明者先前的基线浓度发现的证实可能归因于获得食管癌和胃癌组分别产生的结果以及需要进一步探索的患者数量少。然而，选择的挥发性化合物通过癌症中的倍数变化显示对酪氨酸的总体更高的反应，尽管并不显著。
[0300]
来自癌症队列的短链脂肪酸浓度不受酪氨酸的影响。
[0301]
这些结果表明经由莽草酸途径作用的口腔代谢底物有可能增加呼吸voc。在研究的下一阶段，除了酪氨酸外，发明人打算使用苯丙氨酸，酪氨酸的前体作为组合饮料。不希望受任何特定理论的束缚，发明人提出在摄入后30-45分钟测量呼吸voc浓度以检测加入氨基酸的任何潜在变化。
[0302]
关键点：
[0303]
·
来自醛家族的癸醛在食管癌组中显示出在摄入酪氨酸后显著增加的倍数。
[0304]
·
醛和苯酚化合物与基线值相比显示略高的倍数变化，尽管并不显著。
[0305]
·
需要进一步探索对照组中明显更高的基线醛和苯酚值。
[0306]
·
在酪氨酸消耗后35-45分钟检测到最佳浓度的挥发性酚化合物。
[0307]
实施例3-苯丙氨酸
[0308]
结果和讨论
[0309]
苯丙氨酸是一种必需氨基酸，是其他氨基酸例如酪氨酸的已知前体。预计经由莽草酸途径的代谢会产生挥发性苯酚化合物。在苯丙氨酸消耗后，苯酚家族的三种化合物(十二烷、癸烷和苯酚)的浓度增加(图18至20)。十二烷和癸烷在消耗后10-15分钟显示最大增加(分别增加3.2和1.8倍)。苯酚在60分钟下增加2.7倍。与没有明显影响的酪氨酸相比，癸醛和十二烷对苯丙氨酸的反应升高(图21)。苯酚产生类似的最终结果，而癸烷在苯丙氨酸摄入后显示出略高的值。
[0310]
实施例4-谷氨酸
[0311]
结果和讨论
[0312]
来自醛和苯酚家族的三种化合物表明，在消耗谷氨酸后voc浓度增加(图22至25)。丙醛在5分钟下显示出3.5的倍数变化的最大浓度升高。十二烷和苯酚分别在20和45分钟下增加2倍。谷氨酸是一种经由莽草酸途径代谢的非必需氨基酸，产生苯酚家族的挥发性化合物。谷氨酸参与降解过程中的氨基转移过程。产生的酮酸用作柠檬酸循环中的关键中间体用于进一步的细胞代谢。这可以解释在消耗谷氨酸后5分钟内观察到丁酸稍微增加。
[0313]
不希望受任何特定理论的束缚，本发明人相信，与其他测试的氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸组合，可以产生增强的voc反应，特别是与已经跨组鉴定的一致化合物(十二烷、苯酚)一起。
[0314]
实施例5-甘油剂量
[0315]
结果
[0316]
受试者
[0317]
招募两名平均年龄为32岁的受试者；1个女性和1个男性。没有发现明显的合并症。
[0318]
挥发性有机化合物分析
[0319]
表12：在45-55分钟下在每个受试者的呼气中检测到的短链脂肪酸浓度。
[0320][0321]
讨论
[0322]
甘油浓度增加表示在呼出气内检测到的挥发性脂肪酸的产量增加。25g甘油的挥发性脂肪酸浓度与基线值相当。在摄入甘油30分钟后丁酸浓度升高，在45-55分钟检测到最大浓度。甘油是在脂质中发现的多元醇化合物并且经由糖酵解途径通过(i)直接进入该途径或(ii)通过糖异生转化为葡萄糖进行代谢。葡萄糖研究表明在葡萄糖消耗后5-10分钟检测到最大的脂肪酸，并且因此预计在甘油摄入后的反应延迟，因为在进入循环之前可能需要进一步的酶促反应。与健康的年龄匹配的对照相比，发明人建议使用50g的剂量来在被诊断有og癌症的患者的呼吸内引发脂肪酸voc反应。
[0323]
实施例6-甘油
[0324]
结果
[0325]
患者
[0326]
招募18名患者(每组中n＝6；食管癌、胃癌、健康对照)。包括的所有癌症均经组织学证实为腺癌。
[0327]
表13参与者的人口统计学和临床信息
[0328][0329]
*中值
[0330]
挥发性有机化合物分析
[0331]
短链脂肪酸
[0332]
表14挥发性短链脂肪酸(乙酸、丁酸、丙酸)在甘油消耗后60min最大增加。
[0333][0334]
*kruskal wallis分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0335]
醛
[0336]
表15食管癌组的挥发性醛在40-55分钟之间最大增加(己醛、辛醛、戊醛、丙醛)。
[0337][0338]
*kruskal wallis分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0339]
苯酚
[0340]
表16挥发性苯酚表明三个患者组之间的呼出气浓度没有变化。
[0341][0342][0343]
*kruskal wallis分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0344]
表17比较(i)对照组与胃癌组和(ii)对照组与食管癌组的mann whitney u检验；p《0.05被认为具有统计学意义
[0345][0346]
讨论
[0347]
呼出气中的三种化学类别的voc已证明在诊断为食管-胃(og)癌的患者中显著增加。甘油是在脂质中发现的多元醇化合物并且经由糖酵解途径通过(i)直接进入该途径或(ii)通过糖异生转化为葡萄糖进行代谢。葡萄糖研究表明在葡萄糖消耗后5-10分钟检测到最大脂肪酸，并且因此预计在甘油摄入后升高的反应可能会进一步延迟，因为在进入循环之前可能需要酶促反应。
[0348]
与假设一致，我们观察到在甘油消耗后45-60分钟短链脂肪酸(scfa)和醛水平升高，如图30a至30e所示。scfa，即乙酸、丁酸和丙酸，与胃癌组相比(分别增加1.09、1.43、1.46倍)在食管癌组中显著增加(分别增加1.5、2.02、1.75倍)。在60分钟下达到最佳浓度，在45分钟后观察到逐渐增加。
[0349]
同样，发现选择的醛在食管癌组中大量增加(图31a至31i)。己醛和丙醛显示最大的增加，在40-55分钟下增加1.7倍。辛醛以1.58倍变化增加并且戊醛以1.27倍变化增加。胃癌组在55分钟下显示仅戊醛增加1.46倍。剩余的醛不受影响。
[0350]
许多测试的许多挥发性苯酚表现出在消耗甘油后在三个患者组之间的呼出气浓度没有显著变化(图32a至32e)。
[0351]
在食管癌组中，甘油消耗独特地增加目标voc。这可能是由于涂覆在食管上的液体粘度较高，从而允许更多的短暂通过。底物和肿瘤之间的接触时间的增加可以解释所产生的较高voc水平。
[0352]
关键点：
[0353]
甘油消耗激活与肿瘤微生物组或肿瘤细胞活性增加相关的糖酵解代谢途径。这是通过以下方式检测：
[0354]
·
scfa(乙酸、丁酸和丙酸)倍数显著增加；在食管癌组中观察到的比胃癌组中观察到的更多。
[0355]
·
在食管癌中醛(己醛、辛醛、戊醛和丙醛)显著增加。在胃癌中观察到戊醛增加。
[0356]
实施例7-组合的氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸)
[0357]
结果
[0358]
患者
[0359]
招募13名患者(食管癌n＝6，胃癌n＝1，健康对照n＝6)。包括的所有癌症均经组织学证实为腺癌。
[0360]
表18参与者的人口统计学和临床信息。
[0361][0362]
*中值
[0363]
挥发性有机化合物分析
[0364]
短链脂肪酸
[0365]
表19在氨基酸消耗后挥发性短链脂肪酸没有改变。
[0366]
[0367]
*mann whitney u分析p《0.05被认为具有统计学意义醛
[0368]
表20挥发性癸醛表明在消耗组合的氨基酸饮料后30分钟下食管胃癌组增加。
[0369][0370]
*mann whitney u分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0371]
苯酚-烷烃
[0372]
表21挥发性苯酚表明在癌症组和非癌症组之间呼出气浓度中对甲酚的增加。苯酚浓度的增加在两组之间具有可比性。
[0373][0374]
*mann whitney u分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0375]
讨论
[0376]
如图33和34a至34e所示，在消耗三种组合氨基酸后，两种化学类别，醛和苯酚-烷烃，表明挥发性有机化合物水平增加。相比之下，当单独施用酪氨酸时，食管癌组中只有癸醛略有升高。
[0377]
癸醛，一种醛，表现出用这种组合氨基酸饮料后检测水平的更显著增加(图33)。在癌症组中观察到增加1.41倍(基线＝0.69ppbv，30分钟＝0.83ppbv)，而在对照组中增加1.05倍。最大浓度出现在消耗营养饮料后30分钟。
[0378]
苯酚-烷烃是该营养组的主要目标。已经详细描述被酪氨酸苯酚裂解酶代谢酪氨酸以产生苯酚的途径。最近，saito等人描绘涉及被酪氨酸裂解酶代谢以产生对甲酚的途径。这种代谢途径已在细菌而非人体细胞内得到证实[4]。在消耗氨基酸饮料后40分钟，对甲酚从基线水平0.93ppbv显著增加到1.25ppbv，增加1.37倍。在对照组中没有观察到变化。苯酚在癌症组(增加1.79倍)和非癌症组(增加1.83倍)中均显示全面增加，在两者之间没有显著差异。癸烷也在30分钟下增加，癌症组增加1.44倍。
[0379]
在剩余的醛和短链脂肪酸组中不存在显著变化。需要进一步工作以解释癸醛的增加。
[0380]
关键点：
[0381]
组合的氨基酸的消耗可能激活与细菌相关的代谢途径。这通过以下方式检测：
[0382]
·
癸醛(醛)显著增加。
[0383]
·
苯酚(酶酪氨酸苯酚裂解酶)全面增加，在癌症和非癌症组之间没有差异。
[0384]
·
可能由使用酪氨酸裂解酶的酶促代谢产生的对甲酚显著增加的新发现。
[0385]
实施例8-组合的葡萄糖和柠檬酸
[0386]
表22参与者的人口统计学和临床信息。
[0387][0388]
*中值
[0389]
挥发性有机化合物分析
[0390]
短链脂肪酸
[0391]
表23在对照组2(葡萄糖 柠檬酸)中检测到挥发性短链脂肪酸(丁酸和丙酸)的浓度增加。
[0392][0393]
*mann whitney u分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0394]
醛
[0395]
表24挥发性癸醛表现出在消耗组合的氨基酸饮料后30分钟下食管胃癌组增加。
[0396][0397]
*mann whitney u分析p《0.05被认为具有统计学意义
[0398]
讨论
[0399]
如图35a至35e和36中所示，两种化学类别，短链脂肪酸(scfa)和醛，在消耗葡萄糖和柠檬酸后表现出挥发性有机化合物水平增加。实施例1的结果表现出在单独消耗葡萄糖的5-10分钟内这些组的显著增加。该假说指出，葡萄糖经由发生在人类细胞和细菌细胞中的糖酵解途径代谢。糖酵解途径进入柠檬酸循环，因此，目标是评估加入柠檬酸后voc的进一步增加。
[0400]
丁酸表现出从单独使用葡萄糖的2.72倍到加入柠檬酸的5.36倍(图35b)的最大增加。在饮用该饮料的5-10内达到最大浓度。丙酸也表现出在加入柠檬酸后增加1.96倍(图35e)。scfa组的其余部分没有观察到显著变化。
[0401]
丙醛似乎是在10-15分钟内柠檬酸组增加1.29倍的仅有的醛，尽管变化很小(图36)。在醛组的其余部分中没有观察到显著变化。
[0402]
在两个对照组中已经显示voc的明显变化，柠檬酸作为区分因素。我们假设这些营养素可以进料到糖酵解和柠檬酸的内在代谢途径。
[0403]
关键点：
[0404]
组合的葡萄糖和柠檬酸的消耗激活与细胞代谢相关的已知代谢途径。这通过以下
方式检测：
[0405]
·
在饮用营养饮料后5-10分钟内挥发性短链脂肪酸(丁酸和丙酸)显著增加。
[0406]
·
丙醛在10-15分钟内显著增加。
[0407]
下一步将包括招募食管-胃癌患者以评估呼吸voc对额外营养底物的反应。
[0408]
参考文献
[0409]
1.markar，s.r.，et al.，assessment of a noninvasive exhaled breath test for the diagnosis of oesophagogastric cancer.jama oncol，2018.4(7):p.970-976.
[0410]
2.kumar k，h.j.，abbassi-ghadi n，mackenzie ha，veselkov ka，hoare jm，lovat lb，spanel p，smith d and hanna gb，mass spectrometric analysis of exhaled breath for the identification of volatile organic compound biomarkers in esophageal and gastric adenocarcinoma.annals of surgery，2015.262(6):p.981-990.
[0411]
3.excellence，n.i.o.c.，gastrointestinal tract(upper)cancers-recognition and referral.2016.
[0412]
4.saito y，sato t，nomoto k，tsuji h.identification of phenol-and p-cresol-producing intestinal bacteria by using media supplemented with tyrosine and its metabolites.fems microbiol ecol.2018.94(9)。