肾损伤的预防剂或者治疗剂的制作方法

1.本发明涉及一种肾损伤的预防剂或者治疗剂。


背景技术：

2.肾损伤是一种死亡率较高并且预后不良的疾病。例如，在作为重病的急性肾损伤(acute kidney injury：aki)中，死亡率超过50％。
3.若从急性肾损伤向慢性肾损伤转化(aki to ckd transition)，则一部分的该患者需要接受透析。因从急性肾损伤向慢性肾损伤转化而需要透析的患者的数量已然达到在日本国内的透析患者数量的大约1/4(大约8万人)。
4.已经进行了关于从急性肾损伤向慢性肾损伤转化的机理的研究，据报道，肾细胞的细胞周期不从g2期进入到m期而停止是使得从急性肾损伤向慢性肾损伤转化的机理之一(参照非专利文献1)。
5.另外，肾损伤能够被分类成很多种，作为肾损伤的例子，可举出：从急性肾损伤到慢性肾损伤的转化、钙调磷酸酶抑制剂肾病、糖尿病性肾病、肾硬化症，以及伴随肾移植的肾损伤等缺血或氧化应激或肾间质的纤维化引起的肾损伤。
6.在上述状况下，肾损伤的预防剂和治疗剂的开发受到关注。关于伴随心脏手术的急性肾损伤，目前已经开发了通过p53的抑制剂(qpi-1002)来处置患者的方法，关于该方法，目前已经实施了第三期临床试验。
7.现有技术文献
8.非专利文献
9.非专利文献1：liyang et al.,“epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury”nature medicine,vol.16,no.5,may 2010,p535-543


技术实现要素：

10.发明要解决的问题
11.但是，使用如上述那样的p53的抑制剂的技术，具有例如使得致癌风险增加等诸多副作用。因此，需要开发出肾损伤的新的预防剂或者治疗剂。
12.本发明的一个方案的目的在于，提供一种肾损伤的新的预防剂或者治疗剂。
13.用于解决问题的手段
14.为了解决上述问题，本发明的一个方式所涉及的肾损伤的预防剂或者治疗剂，含有硫氧还蛋白诱导剂作为有效成分。
15.在本发明的一个方式所涉及的肾损伤的预防剂或者治疗剂中，上述硫氧还蛋白诱导剂是萝卜硫素、叔丁基氢醌、或者其衍生物或盐。
16.在本发明的一个方式所涉及的肾损伤的预防剂或者治疗剂中，上述肾损伤是初期的慢性肾损伤。
17.发明效果
18.根据本发明的一个方式，能够提供一种肾损伤的新的预防剂或者治疗剂。
附图说明
19.图1是表示本发明的实施例所涉及的硫氧还蛋白诱导剂所具有的硫氧还蛋白的mrna的表达增强效果的图。
20.图2是表示本发明的实施例所涉及的硫氧还蛋白诱导剂所具有的硫氧还蛋白的蛋白质的表达增强效果的图。
21.图3是表示在本发明的实施例中，通过强制表达硫氧还蛋白所导致的从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化抑制效果的图像。
22.图4是表示本发明的实施例所涉及的硫氧还蛋白诱导剂所具有的肾间质的纤维化抑制效果的图像。
23.图5是表示本发明的实施例所涉及的硫氧还蛋白诱导剂所具有的ctgf的mrna和tgf-β的mrna的表达抑制效果的图。
24.图6是表示本发明的实施例所涉及的硫氧还蛋白诱导剂所具有的抑制血液中的血清肌酐的浓度上升的效果的图。
25.图7是表示本发明的实施例所涉及的硫氧还蛋白诱导剂所具有的从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化抑制效果，具体而言，磷酸化组蛋白h3蛋白质浓度上升的抑制效果的图。
具体实施方式
26.以下将对本发明的一个实施方式进行说明，但本发明不限于此。本发明并不限定于以下说明的各结构，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，适当组合不同的实施方式及实施例中分别公开的技术手段而得到的实施方式及实施例也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的全部文献在本说明书中作为参考文献而被援引。在本说明书中，在将数值范围记载为“a～b”的情况下，该记载意味着“a以上b以下”。
27.【1.肾损伤的预防剂或者治疗剂】
28.本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或者治疗剂含有硫氧还蛋白诱导剂作为有效成分。
29.作为上述肾损伤的具体例，能够举出：急性肾损伤(例如，发病后的急性肾损伤)以及慢性肾损伤。慢性肾损伤优选为初期的慢性肾损伤。作为初期的慢性肾损伤的具体例，能够举出：例如，从急性肾损伤到慢性肾损伤的转化、急性肾损伤、钙调磷酸酶抑制剂肾病、糖尿病性肾病、肾硬化症，以及伴随肾移植的肾损伤等缺血或氧化应激或肾间质的纤维化引起的肾损伤。
30.在本说明书中，“预防剂”是指带来预防效果的药剂。上述预防效果是指以下所例示的效果，但并不限定于此。
31.(a)与并未给药预防剂的情况相比，防止了肾损伤所涉及的一个以上症状的发病或者降低了发病风险。
32.(b)与并未给药预防剂的情况相比，防止了肾损伤所涉及的一个以上症状的复发或者降低了复发的风险。
33.(c)与并未给药预防剂的情况相比，防止了肾损伤所涉及的一个以上症状的征兆或者降低了产生征兆的风险。
34.在本说明书中，“治疗剂”是指带来治疗效果的药剂。上述治疗效果是指以下所例示的效果，但并不限定于此。
35.(d)与并未给药治疗剂的情况相比，降低了肾损伤所涉及的一个以上症状的严重程度。
36.(e)与并未给药治疗剂的情况相比，防止了肾损伤所涉及的一个以上症状的严重程度的增加或症状的发展。
37.(f)与并未给药治疗剂的情况相比，降低了肾损伤所涉及的一个以上症状的严重程度的增加速度或症状的发展速度。
38.更具体而言，本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂可以是(g)急性肾损伤的预防剂或治疗剂，或(h)向慢性肾损伤转化的急性肾损伤(例如向慢性肾损伤转化前的急性肾损伤，或向慢性肾损伤转化中的急性肾损伤)的预防剂或治疗剂。
39.本实施方式的肾损伤的治疗剂含有硫氧还蛋白诱导剂作为有效成分。硫氧还蛋白诱导剂只要能够使硫氧还蛋白(thioredoxin：trx)蛋白质的量增加即可，并没有限定硫氧还蛋白诱导剂的作用机制。例如，硫氧还蛋白诱导剂可以使硫氧还蛋白mrna的转录量增加，也可以使硫氧还蛋白mrna的分解减少，也可以使硫氧还蛋白蛋白质的翻译量增加，也可以使硫氧还蛋白蛋白质的分解减少。
40.更具体而言，上述硫氧还蛋白诱导剂可以为以下物质：
41.(1)萝卜硫素(1-异硫氰基-4-(甲基亚硫酰基)丁烷)；
42.(2)叔丁基氢醌(2-(1,1-二甲基乙基)-1,4-苯二酚)；
43.(3)上述(1)～(2)的衍生物或盐。
44.在本说明书中，“衍生物”是指相对于特定的化合物，该化合物的分子内的一部分被其他官能团或其他原子取代而产生的化合物组。作为上述其他官能团的例子，可举出：烷基、烷氧基、烷硫基、芳基、芳氧基、芳硫基、芳烷基、芳基烷氧基、芳烷基硫基、芳基烯基、芳基炔基、烯丙基、氨基、取代氨基、甲硅烷基、取代甲硅烷基、甲硅烷氧基、取代甲硅烷氧基、芳基磺酰氧基、烷基磺酰氧基、硝基等。作为上述其他原子的例子，可举出：碳原子、氢原子、氧原子、氮原子、硫原子、磷原子、卤素原子等。
45.在本说明书中，“盐”只要是生理学上允许作为医药品向受试体给药的盐即可，并没有限定。作为盐的例子，可举出：碱金属盐(钾盐等)、碱土金属盐(钙盐、镁盐等)、铵盐、有机碱盐(三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐等)、有机酸盐(乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐等)、无机酸盐(盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)。
46.上述硫氧还蛋白诱导剂能够通过公知的方法来制造。当然，也可以使用市售的硫氧还蛋白诱导剂。
47.本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂也可以含有上述的有效成分(硫氧还蛋白诱导剂)以外的成分。有效成分以外的成分只要是药学上允许的成分即可，例如能够是缓冲剂、ph调节剂、等渗剂、防腐剂、抗氧化剂、高分子量聚合物、赋形剂、溶剂、稳定剂等。
48.作为上述缓冲剂的例子，可举出：磷酸或磷酸盐、硼酸或硼酸盐、柠檬酸或柠檬酸盐、醋酸或醋酸盐、碳酸或碳酸盐、酒石酸或酒石酸盐、ε-氨基己酸、氨基丁三醇等。作为上述磷酸盐，可举出：磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等。作为上述硼酸盐，可举出：硼砂、硼酸钠、硼酸钾等。作为上述柠檬酸盐，可举出：柠檬酸钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠等。作为上述醋酸盐，可举出：醋酸钠、醋酸钾等。作为上述碳酸盐，可举出：碳酸钠、碳酸氢钠等。作为上述酒石酸盐，可举出：酒石酸钠、酒石酸钾等。
49.作为上述ph调节剂的例子，可举出：盐酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾等。
50.作为上述等渗剂的例子，可举出：离子性等渗剂(氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等)、非离子性等渗剂(甘油、丙二醇、山梨糖醇、甘露糖醇等)。
51.作为上述防腐剂的例子，可举出：苯扎氯铵、苯扎溴铵、苄索氯铵、山梨酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇等。
52.作为上述抗氧化剂的例子，可举出：抗坏血酸、生育酚，二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、异抗坏血酸钠、没食子酸丙酯、亚硫酸钠等。
53.作为上述高分子量聚合物的例子，可举出：甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素、醋酸邻苯二甲酸酯纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧基乙烯基聚合物、聚乙二醇、去端肽胶原等。
54.作为上述赋形剂的例子，可举出：乳糖、白糖、d-甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、赤藓醇、淀粉、结晶纤维素等。
55.作为上述溶剂的例子，可举出：生理食盐水、醇等。
56.本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂中含有的有效成分的量没有特别限定。本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂中含有的有效成分的量，例如，相对于药剂的总重量，可以是0.001重量％～100重量％，也可以是0.01重量％～100重量％，也可以是0.1重量％～100重量％，也可以是0.1重量％～95重量％，也可以是0.1重量％～90重量％，也可以是0.1重量％～80重量％，也可以是0.1重量％～70重量％，也可以是0.1重量％～60重量％，也可以是0.1重量％～50重量％，也可以是0.1重量％～40重量％，也可以是0.1重量％～30重量％，也可以是0.1重量％～20重量％，也可以是0.1重量％～10重量％。
57.本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂中含有的有效成分以外的成分的量没有特别限定。本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂中含有的有效成分以外的成分的量，例如，相对于药剂的总重量，可以是0重量％～99.999重量％，也可以是0重量％～99.99重量％，也可以是0重量％～99.9重量％，也可以是5重量％～99.9重量％，也可以是10重量％～99.9重量％，也可以是20重量％～99.9重量％，也可以是30重量％～99.9重量％，也可以是40重量％～99.9重量％，也可以是50重量％～99.9重量％，也可以是60重量％～99.9重量％，也可以是70重量％～99.9重量％，也可以是80重量％～99.9重量％，也可以是90重量％～99.9重量％。
58.本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂的给药对象没有特别
限定，可以是人，也可以是非人动物(例如家畜、宠物以及实验动物)。作为非人动物的例子，可举出：牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、小鼠和大鼠等。
59.本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂可以通过任意的给药途径向给药对象给药。作为给药途径的例子，可举出：经口给药、非经口给药、经皮给药、经粘膜给药、经静脉给药、经筋注射给药、经皮下注射给药等。因此，本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂的剂型能够是内服药、外用药或注射剂等。
60.在给药本发明的一个实施方式所涉及的肾损伤的预防剂或治疗剂的情况下，只要能够得到所希望的效果，则对给药间隔没有限制。上述给药间隔例如能够为：1小时1次、6小时1次、12小时1次、1天1次、1周1次、2周1次、3周1次、1个月1次、2个月1次、3个月1次、4个月1次、5个月1次、6个月1次或1年1次。
61.【2.其他】
62.《1》一种肾损伤的预防方法或治疗方法，其具有向被试体(例如，人或非人动物)给药含有硫氧还蛋白诱导剂作为有效成分的肾损伤的预防剂或治疗剂的工序。
63.《2》根据《1》所述的肾损伤的预防方法或治疗方法，上述硫氧还蛋白诱导剂是萝卜硫素、叔丁基氢醌、或者其衍生物或盐。
64.《3》根据《1》或《2》所述的肾损伤的预防方法或治疗方法，上述肾损伤是初期的慢性肾损伤(例如，从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化、钙调磷酸酶抑制剂肾病、糖尿病性肾病、肾硬化症，以及伴随肾移植的肾损伤等缺血或氧化应激或肾间质的纤维化引起的肾损伤)。
65.《4》一种用于制备肾损伤的预防剂或治疗剂的硫氧还蛋白诱导剂的用途。
66.《5》根据《4》所述的用途，上述硫氧还蛋白是萝卜硫素、叔丁基氢醌、或者其衍生物或盐。
67.《6》根据《4》或《5》所述的用途实施例，上述肾损伤是初期的慢性肾损伤(例如，从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化、钙调磷酸酶抑制剂肾病、糖尿病性肾病、肾硬化症，以及伴随肾移植的肾损伤等缺血或氧化应激或肾间质的纤维化引起的肾损伤)。
68.实施例
69.【1.基于硫氧还蛋白诱导剂的硫氧还蛋白的表达诱导】
70.在公知的培养基中，在培养板上培养小鼠肾小管细胞。在小鼠肾小管细胞以规定的细胞密度覆盖培养板的底面的时刻，向培养基中加入溶解于dmso(dimethyl sulfoxide)中的硫氧还蛋白诱导剂(具体而言，以最终浓度成为0.125μm或0.25μm的方式加入萝卜硫素(sfn)，或者以最终浓度成为5μm或10μm的方式加入叔丁基氢醌(tbhq))。另外，作为对照试验，在小鼠近位肾小管细胞以规定的细胞密度覆盖培养板的底面的时刻，向培养基中加入与上述的试验等量的dmso。
71.将溶解在dmso中的硫氧还蛋白诱导剂或dmso添加到培养基后，将小鼠肾小管细胞在37℃下培养24小时，然后回收小鼠肾小管细胞。
72.使用toyobo公司制造的magextractor(注册商标)mfx-200从小鼠肾小管细胞中纯化total rna。接着，使用toyobo公司制造的revertraace(注册商标)qpcrrtkit使该total rna逆转录为cdna，使用后述的探针，对total rna中含有的硫氧还蛋白的mrna量和β-肌动蛋白的mrna量进行定量。
73.在硫氧还蛋白的mrna的定量中，使用sigma-ardrich公司制造的“sybrgreen probe for thioredoxin(trx)”作为探针。另一方面，在β-肌动蛋白的mrna量的定量中，使用sigma-ardrich公司制造的“sybrgreen probe forβ-actin”作为探针。
74.认为β-肌动蛋白的mrna量没有变化。因此，基于β-肌动蛋白的mrna量，对硫氧还蛋白的mrna量进行校正。
75.在图1中示出了试验结果。由图1可知，萝卜硫素和叔丁基氢醌均增强了硫氧还蛋白的mrna的表达。另外，硫氧还蛋白的mrna的表达增强效果依赖于萝卜硫素和叔丁基氢醌的量。
76.【2.基于硫氧还蛋白诱导剂的invivo中的硫氧还蛋白的表达诱导】
77.为了确认在invivo中的硫氧还蛋白诱导剂的效果，将给药了硫氧还蛋白诱导剂的小鼠体内的肾脏中的硫氧还蛋白的蛋白质定量化。此外，在该试验中，使用施加了缺血再灌注损伤的小鼠和未施加缺血再灌注损伤的小鼠。
78.通过在野生型的c57bl/6小鼠的肾动脉上夹上夹子30分钟后放开，对该小鼠施加缺血再灌注损伤。然后，经过能够最佳观察从急性肾损伤向慢性肾损伤转化的14天，引起从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化。经过14天期间，每天早晚在该小鼠的皮下注射硫氧还蛋白诱导剂(具体而言，萝卜硫素(sfn)30μg/1只/1天，或叔丁基氢醌(tbhq)1mg/1只/1天)。
79.另外，为了进行比较对照，使用不引起急性肾损伤的野生型的c57bl/6小鼠(不对肾动脉夹上夹子的小鼠)，经过14天期间，每天早晚在该小鼠的皮下注射硫氧还蛋白诱导剂(具体而言，萝卜硫素(sfn)30μg/1只/1天，或叔丁基氢醌(tbhq)1mg/1只/1天)。
80.另一方面，作为硫氧还蛋白诱导剂的对照,使用野生型的c57bl/6小鼠(对肾动脉夹上夹子的小鼠和不对肾动脉夹上夹子的小鼠)，经过14天期间，每天早晚在向该小鼠的皮下注射生理盐水(saline)。
81.经过14天后，从各小鼠采集肾脏、血液和尿。
82.为了研究硫氧还蛋白诱导剂对硫氧还蛋白的蛋白质的量的影响，通过免疫印迹法(westernblot法)分析肾脏的组织溶解液进行解析，用抗硫氧还蛋白抗体检测组织溶解液中所含有的硫氧还蛋白蛋白质。基于检测出的信号的强度，将硫氧还蛋白的蛋白质定量化。此外，使用β-肌动蛋白作为内源性的对照，通过用由抗硫氧还蛋白抗体检测出的信号强度除以由抗β-肌动蛋白抗体检测出的信号强度来进行数据的校正。
83.在图2中示出了试验结果。此外，在图2中，“non-aki”表示未施加缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果，“aki-to-ckd”表示施加了缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果。在注射了生理盐水的小鼠中，硫氧还蛋白蛋白质的表达量较少。另一方面，在注射了硫氧还蛋白诱导剂的小鼠中，与注射了生理盐水的小鼠相比，硫氧还蛋白蛋白质的表达量增加。
84.在将对施加了缺血再灌注损伤的小鼠注射硫氧还蛋白诱导剂的情况与对未施加缺血再灌注损伤的小鼠注射硫氧还蛋白诱导剂的情况进行比较时，相比于对未施加缺血再灌注损伤的小鼠注射硫氧还蛋白诱导剂的情况，对施加了缺血再灌注损伤的小鼠注射硫氧还蛋白诱导剂的情况的硫氧还蛋白蛋白质的表达量增加。
85.【3.在肾脏中强制表达硫氧还蛋白的转基因小鼠、肾损伤的发病抑制】
86.急性肾损伤发病后，进行从急性肾损伤向慢性肾损伤转化(aki to ckd transition)。此时，认为肾细胞的细胞周期不从g2期进入到m期而停止是从急性肾损伤向
慢性肾损伤转化的原因。已知在肾细胞的细胞周期不从g2期进入到m期而停止时，磷酸化的组蛋白h3的量增加。这表示磷酸化的组蛋白h3的量的增加作为用于检测从急性肾损伤向慢性肾损伤转化的标记物而发挥功能。
87.在本试验中，对于在肾脏中强制表达硫氧还蛋白的转基因(transgenic)小鼠而言，在人工施加使得急性肾损伤发病的处置时，确认是否发生从急性肾损伤向慢性肾损伤转化。
88.本试验中，使用论文“kasuno k,nakamura h,ono t,muso e,yodoi j.protective roles of thioredoxin,a redox-regulating protein,in renal ischemia/reperfusion injury.kidney int 64:1273-1282,2003”中记载的在肾脏中强制表达硫氧还蛋白的转基因小鼠(trx-tg)。另一方面，在对照试验中，使用了野生型的c57bl/6小鼠(wt)。
89.通过肾缺血再灌注损伤(renalischemia reperfusion injury)，能够制备急性肾损伤病模型小鼠。因此，对上述小鼠(trx-tg和wt)施加肾缺血再灌注损伤，由此实施用于使上述小鼠发生急性肾损伤的处置。
90.首先，通过在小鼠的肾动脉上夹上夹子30分钟后放开，引起缺血再灌注损伤。在引起缺血再灌注损伤后最能观察到从g2期到m期的停止的12小时后，从小鼠中取出肾脏，使用抗磷酸化组蛋白h3抗体对该肾脏进行染色。作为一次抗体的抗磷酸化组蛋白h3抗体，使用abcam公司生产的“anti-histonh3”，作为二次抗体，使用histo-fine simple stain。另外，染色法按照一般的免疫染色法。
91.若对免疫染色法的步骤进行说明，则如以下所述：
92.(1)脱蜡处理、脱二甲苯处理和水洗处理；
93.(2)3％过氧化氢水溶液处理(10分钟)，
94.(3)水洗处理，
95.(4)抗原活化(在范围强时5分钟和在范围弱时10分钟)，
96.(5)冷却处理和水洗处理，
97.(6)pbs清洗处理，
98.(7)封闭处理(5分钟)，
99.(8)一次抗体处理(使用稀释1000倍的一次抗体，在4℃下，一昼夜)，
100.(9)pbs清洗处理，
101.(10)二次抗体处理(30分钟)，
102.(11)pbs清洗处理，
103.(12)染色处理，
104.(13)脱水处理、透明处理和封入处理。
105.在图3中示出了试验结果。由图3可知，在肾脏中强制表达硫氧还蛋白的转基因小鼠中，与野生型的c57bl/6小鼠相比，磷酸化组蛋白h3的量较少。这表明，由于急性肾损伤的强制表达，肾细胞的细胞周期从g2期进入到m期，由此抑制了从急性肾损伤向慢性肾损伤转化。
106.【4.基于硫氧还蛋白诱导剂得给药得抑制肾损伤的发病】
107.通过在野生型的c57bl/6小鼠的肾动脉上夹上夹子30分钟后放开，对该小鼠施加缺血再灌注损伤。然后，经过能够最佳观察从急性肾损伤向慢性肾损伤转化的14天，引起从
急性肾损伤向慢性肾损伤的转化。经过14天期间，每天早晚在该小鼠的皮下注射硫氧还蛋白诱导剂(具体而言，萝卜硫素(sfn)30μg/1只/1天，或叔丁基氢醌(tbhq)1mg/1只/1天)。另一方面，作为对照试验，每天早晚在向该小鼠的皮下注射生理盐水(saline)。在施加缺血再灌注损伤14天后，从各小鼠采集肾脏、血液和尿。
108.使用采集的试料，如以下的《a》～《c》所示，对肾脏的纤维化和肾脏的功能进行试验。
109.《a.三色染色》
110.肾间质的纤维化被认为是从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化的原因之一。因此，使用采集的肾脏，按照三色染色，确认是否发生肾间质的纤维化。三色染色按照一般的方法进行。若对三色染色的步骤进行说明，则如以下所述：
111.(1)脱蜡处理、脱二甲苯处理和水洗处理，
112.(2)第一媒染剂处理(20分钟～30分钟)，
113.(3)水洗处理，
114.(4)weigert铁苏木素溶液处理(3分钟～20分钟)，
115.(5)水洗处理，
116.(6)着色用的水洗处理(10分钟)，
117.(7)第二媒染剂处理(30秒)，
118.(8)水洗处理(1分钟)，
119.(9)1％醋酸处理，
120.(10)0.75％橙黄g液处理(1分钟)，
121.(11)1％醋酸处理，
122.(12)masson染色液处理(20分钟～30分钟)，
123.(13)1％醋酸处理，
124.(14)2.5％磷钨酸液处理(15分钟～30分钟)，
125.(15)1％醋酸处理，
126.(16)苯胺蓝处理(3分钟～30分钟)，
127.(17)1％醋酸处理，
128.(18)脱水处理、透明处理和封入处理。
129.在图4中示出了试验结果。另外，在图4中，“nonaki”示出了未施加缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果，“aki-to-ckd”表示施加了缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果。另外，图像中，左侧是进行了三色染色的肾脏切片的图像，右侧是将上述图像以一定阈值仅将蓝色进行通道显示而得到的黑白图像。在注射了生理盐水的小鼠中，通过施加缺血再灌注损伤，14天后在肾脏的广大区域观察到肾间质的纤维化(图4中，三色染色的蓝色部分，即以一定阈值仅将蓝色进行通道显示而得到的黑白图像的黑色部分)。另一方面，在注射了硫氧还蛋白诱导剂的小鼠中，与注射了生理盐水的小鼠相比，在施加了缺血再灌注损伤时在14天后观察到肾间质的纤维化的区域(图4中，三色染色的蓝色部分，即以一定阈值仅将蓝色进行通道显示而得到的黑白图像的黑色部分)减少。
130.《b.ctgf(connective tissue growth factor)和tgf-β(transforming growth factor-β)的表达》
131.认为肾间质的纤维化由ctgf和tgf-β促进。因此，使用采集的肾脏，测定ctgf和tgf-β的mrna的表达量。
132.使用toyobo公司制造的magextractor(注册商标)mfx-200，从采集的肾脏中纯化total rna。接着，使用toyobo公司制造的revertraace(注册商标)qpcr rt kit，将该total rna逆转录为cdna，使用后述的探针，对total rna中所含的ctgf的mrna量，tgf-β的mrna量以及β-肌动蛋白的mrna量进行定量。
133.在ctgf的mrna的定量中，使用sigma-ardrich公司制造的“connective tissue growth factor(ctgf)”作为探针。另外，在tgf-β的mrna的定量中，使用该公司制造的“transforming growth factor-β(tgf-β)”作为探针。另一方面，在β-肌动蛋白的mrna量的定量中，使用sigma-ardrich公司制造的“sybrgreen probe forβ-actin”作为探针。另外，使用sfn和tbhq作为硫氧还蛋白诱导剂。
134.认为β-肌动蛋白的mrna量没有变化。因此，基于β-肌动蛋白的mrna量，对ctgf和tgf-β的mrna量进行了校正。
135.在图5中示出了试验结果。在图5中，“nonaki”表示未施加缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果，“aki”表示施加了缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果。在注射了生理盐水的小鼠中，通过施加缺血再灌注损伤，14天后的ctgf的mrna量增加。另一方面，在注射了硫氧还蛋白诱导剂的小鼠中，因施加缺血再灌注损伤而产生的14天后的ctgf的mrna量的增加被抑制。另外，在注射了生理盐水的小鼠中，通过施加缺血再灌注损伤，14天后的tgf-β的mrna量也增加。另一方面，在注射了硫氧还蛋白诱导剂的小鼠中，因施加缺血再灌注损伤而产生的14天后的tgf-β的mrna量的增加被抑制。
136.《c.血清肌酐的浓度》
137.肾脏的功能是否正常能够根据血液中含有的血清肌酐的浓度来进行判定。血清肌酐的浓度是慢性肾脏病的诊断标准。因此，使用采集的尿，测定血液中含有的血清肌酐的浓度。
138.血清肌酐的浓度使用toshiba tba-2000fr，按照公知的酶法进行测定。
139.在图6中示出了试验结果。另外，在图6中，“non-aki”表示未施加缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果，“aki-to-ckd”表示施加了缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果。在注射了生理盐水的小鼠中，通过施加缺血再灌注损伤，14天后的血液中含有的血清肌酐的浓度上升。另一方面，在注射了硫氧还蛋白诱导剂的小鼠中，与注射了生理盐水的小鼠相比，抑制了在施加缺血再灌注损伤时产生的14天后的血液中含有的血清肌酐的浓度上升。
140.《d.磷酸化组蛋白的浓度》
141.为了调查通过硫氧还蛋白诱导剂使得细胞周期从g2期进入到m期，而从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化是否被抑制，通过免疫印迹法分析肾脏的组织溶解液，用抗磷酸化组蛋白h3抗体检测组织溶解液中所含的磷酸化组蛋白h3蛋白质。基于检测出的信号的强度，将磷酸化组蛋白h3的蛋白质定量化。另外，使用β-肌动蛋白作为内源性的对照，用由抗磷酸化组蛋白h3抗体检测出的信号强度除以由抗β-肌动蛋白抗体检测出的信号强度，由此进行数据的校正。
142.在图7中示出了试验结果。另外，在图7中，“non-aki”表示未施加缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果，“aki-to-ckd”表示施加了缺血再灌注损伤的小鼠的试验结果。在注射
了生理盐水的小鼠中，通过施加缺血再灌注损伤，14天后的肾脏中含有的磷酸化组蛋白h3的浓度上升。另一方面，在注射生理盐水的小鼠诱导剂的小鼠中，与注射了生理盐水的小鼠相比，抑制了在施加缺血再灌注损伤时产生的14天后的肾脏中含有的磷酸化组蛋白h3的浓度上升。这表明，通过硫氧还蛋白诱导剂，肾细胞的细胞周期从g2期进进入到m期，由此抑制从急性肾损伤向慢性肾损伤的转化。
143.产业上的可利用性
144.本发明能够用于肾损伤的预防和治疗。