用氮化硅使氧化锆增韧型氧化铝表面官能化的方法与流程

1.本公开涉及用氮化硅表面官能化生物医学植入物的方法。更具体地，本公开涉及使用用氮化硅进行表面官能化的氧化锆增韧型氧化铝植入物促进骨生成。


背景技术：

2.在骨形成期间，由分泌多种糖蛋白、遗传标志物和骨唾液蛋白的细胞合成有机基质(即，主要是i型胶原蛋白)。细胞磷灰石矿化的有利环境依赖于因成骨细胞碱性磷酸酶(alp)、焦磷酸酶活性和骨钙蛋白产生所致的细胞外液的局部过饱和。alp通过裂解磷酸基团增加磷酸盐浓度；焦磷酸酶降解抑制磷酸裂解的焦磷酸盐；并且骨钙蛋白结合钙。因此，设计用于促进组织/植入物界面处骨形成的骨科植入物的表面化学是重要的考虑因素。虽然陶瓷材料被认为是具有生物惰性的，但陶瓷材料实际上可以刺激或抑制成骨细胞活性。例如，已知氮化硅(si3n4)由于材料的表面化学而加速骨修复。硅酸和活性氮物种(rns)在si3n4表面上的释放增强了骨肉瘤和间充质细胞的成骨活性。对取回的si3n4人颈椎融合植入物的分析已经证实将结合硅和氮结合到天然羟基磷灰石的晶格中。数据还显示，si3n4表面的水解释放出有利于骨形成的si和rns离子，而氧化铝(al2o3)表面反而导致al
3
和活性氧物种(ros)的洗脱。al
3
离子通过减缓羟基磷灰石晶体形成和改变钙从骨细胞的流入和流出来抑制矿化。此外，ros的形成导致细胞中的氧化应激，伴随所述细胞的正常抗氧化系统的显著扰动。体内和体外的数据显示，al
3
和ros诱导的氧化应激激活了细胞凋亡信号传导途径。ros引起对细胞蛋白、脂质和dna的损害。ros靶向钙及其胞内受体钙调蛋白的重要调节途径。最终，这会导致成骨细胞凋亡。由于这些性质，基于氧化铝的骨科植入物限于低磨损应用，如假体髋关节的轴承。
3.因此，需要替代性生物陶瓷或经表面官能化的生物陶瓷来减少或消除al
3
和ros的洗脱，同时促进骨生成。


技术实现要素：

4.一方面，本公开涵盖一种使生物医学植入物的表面官能化的方法。所述方法可以包含：提供所述生物医学植入物；将激光引导到所述生物医学植入物的表面以产生等距图案化孔的网格；以及用包括生物玻璃和氮化硅的粉末混合物填充所述图案化孔。所述氮化硅可以以约5mol.％到约10mol.％存在于所述粉末混合物中。在一些方面，所述生物医学植入物由氧化锆增韧型氧化铝制成并且用氮化硅进行表面官能化。在一些实施例中，所述氮化硅是α-si3n4。在一些方面，所述生物医学植入物由氧化锆增韧型氧化铝制成并且用氮化硅进行表面官能化。一方面，所述图案化孔是延伸到所述植入物的所述表面的二维特征，并且所述图案化孔中的每个图案化孔的横截面面积可以为约0.2mm2，其中间隙为约1.0mm。在一些实施例中，所述图案化孔可以是4
×
4网格。所述生物玻璃可以包含45wt.％sio2、24.5wt.％cao、24.5wt.％na2o和6wt.％p2o5。在一些实施例中，所述粉末混合物可以包含5.5wt.％到约10.7wt.％氮化硅。在另外的特征中，所述粉末混合物可以包括5.5wt.％到约
10.7wt.％氮化硅。另外，填充所述图案化孔的方法可以包含将所述粉末混合物压制到所述生物医学植入物表面上；以及去除多余的粉末混合物。在又另一方面，所述方法包含通过以下形成所述粉末混合物：在氮气气氛下，使所述生物玻璃和所述氮化硅的粉末混合物在铂坩埚中均质化和熔融。在另一个实施例中，所述激光可以是波长为1064nm的nd：yag激光，并且其中所述激光的聚焦距离可以为约250nm，标称最大功率可以为约17kw，爆发能量可以为约70焦耳，所施加电势为约160-500v和/或放电时间可以为约1-20毫秒。
5.本文中进一步提供了一种使生物医学植入物的表面官能化的方法，所述方法包含：提供所述生物医学植入物；在所述生物医学植入物的水湿表面上施加氮化硅粉末层；在所述氮化硅层上脉冲激光以烧结所述氮化硅；以及重复脉冲步骤，直到经烧结的氮化硅层的厚度为约10μm到约20μm。在一个实施例中，所述生物医学植入物包括氧化锆增韧型氧化铝，并且所述氮化硅是β-si3n4，并且所述氮化硅可以与6wt.％氧化钇和4wt.％氧化铝混合。在一些实施例中，所述激光可以是波长为1064nm的nd:yag激光，并且其中所述激光的标称最大功率可以为约17kw，最大脉冲能量为约70焦耳，电压为约400v，光斑大小为约2μm和/或脉冲时间为约4毫秒。
6.此处还提供了使用用氮化硅进行表面官能化的氧化锆增韧型氧化铝植入物促进骨生成的方法。一方面，与不具有所述氮化硅粉末混合物的植入物相比，所述生物医学植入物上的成骨细胞增殖增加。另一方面，与在所述粉末混合物中不具有氮化硅的植入物相比，所述生物医学植入物上的成骨细胞增殖增加。在一些实施例中，表面官能化生物医学植入物上的生物组织的面积覆盖率和比体积比未经涂覆的植入物的生物组织的面积覆盖率和比体积高200％。在另一个实施例中，与不具有所述氮化硅粉末混合物的植入物相比，所述生物医学植入物上的矿化组织增加。一方面，与不具有所述氮化硅粉末混合物的植入物相比，所述生物医学植入物上的矿物质羟基磷灰石可能增加。
7.下面更全面地描述了本发明的其它方面和迭代。
附图说明
8.并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图展示了本发明的若干实施例，并且与本说明书一起用于解释本发明的原理。
9.图1a是zta基质上的表面激光图案化以及用和si3n4的粉末混合物填充图案化孔的示意图；图1b是根据图1a中描绘的过程在对孔进行激光挖掘期间zta样品横截面的示意图；图1c示出了使用自动3d添加激光烧结程序沉积微米厚的si3n4层；并且图1d示出了根据图1c中描绘的过程si3n4涂层/激光相互作用的横截面。
10.图2a是使用光学显微镜在zta表面上的激光钻孔的高放大率图像；图2b是使用激光形貌在zta表面上的激光钻孔的高放大率图像；图2c是在填充有粉末之后的孔的光学图像；并且图2d是在填充由粉末之后的孔的激光图像。
11.图3a是在zta表面上图案化的直径为500μm的孔的4
×
4网格的光学显微照片；图3b是在zta表面上图案化的直径为500μm的孔的4
×
4网格的激光显微照片；图3c是孔形态的三维激光显微镜表征；图3d是在填充有粉末之后的孔网格的光学图像；并且图3e是在填充有粉末之后的孔网格的激光图像。
12.图4a示出了原始zta表面上的荧光显微镜结果；图4b示出了图案化zta上的荧光显微镜结果；图4c示出了填充有粉末混合物的图案化zta表面上的荧光显微镜结果；图4d示出了填充有wt.％si3n4粉末混合物的图案化zta的荧光显微镜结果，图4e示出了填充有wt.％si3n4粉末混合物的图案化zta的荧光显微镜结果。将样品暴露于saos-2细胞1周。
13.图5示出了成骨细胞在不同基质上生长的生物组织的面积覆盖率和比体积的定量激光显微镜数据。
14.图6a示出了未图案化、图案化和图案化/填充的zta样品(标签中的样品规格)上的ftir表征的结果；图6b是来自ftir光谱的磷灰石与有机基质信号之间的强度比率随着zta基质类型变化的图。
15.图7a是跨涂覆区域与未经涂覆区域之间的界面的部分si3n4涂覆的zta表面的顶表面上拍摄的光学显微照片；图7b是跨涂覆区域与未经涂覆区域之间的界面的部分si3n4涂覆的zta表面的顶表面上拍摄的激光显微照片；图7c示出了在zta未涂覆侧面上收集的拉曼光谱；图7d示出了在si3n4涂覆的侧面上收集的拉曼光谱7c。
16.图8a是在生物环境中体外暴露于saos-2成骨细胞1周之后，图7a所示的相同区域的sem图像；图8b是在生物环境中体外暴露于saos-2成骨细胞1周之后，在图7a所示的相同区域中收集的si的eds图；图8c是在生物环境中体外暴露于saos-2成骨细胞1周之后，在图7a所示的相同区域中收集的al的can eds图；图8d是在生物环境中体外暴露于saos-2成骨细胞1周之后，在图7a所示的相同区域中收集的ca的eds图。
17.图9a是由成骨细胞在zta表面的si3n4涂覆的侧面上生长的骨组织的大岛状物的光学显微照片；图9b是由成骨细胞在zta表面的si3n4涂覆的侧面上生长的骨组织的大岛状物的激光显微照片；图9c是同一岛状骨组织的三维激光显微镜视图；图9d是在si3n4涂覆区域与zta未涂覆区域(包含矿物质磷灰石的(po4)
3-谱带)之间的界面附近收集的平均ftir光谱。
18.图10示出了在si3n4基质与增殖性人成骨细胞之间的基于rns和基于硅烷醇的化学相互作用(左侧)以及在zta与凋亡成骨细胞之间的基于ros和基于铝烷醇的化学相互作用(右侧)的示意图。被al
3
离子改性的羟基磷灰石的化学式中的方框代表ca空位。
具体实施方式
19.下面详细讨论本公开的各个实施例。虽然讨论了具体实施方案，但是应当理解，这仅仅是出于说明的目的进行的。相关领域的技术人员将认识到，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以使用其它组件和配置。因此，以下描述和附图是说明性的并且不应被解释为限制性的。描述了许多具体细节以提供对本公开的透彻理解。然而，在某些情况下，未对公知的或常规的细节进行描述，以避免混模糊描述。在本公开中对一个实施例或实施例的引用可以是对相同实施例或任何实施例的引用；并且，此类引用意指实施例中的至少一个实施例。
20.对“一个实施例(one embodiment)”或“实施例(an embodiment)”的引用意味着结合所述实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本公开的至少一个实施例中。在本说明
书中各个地方出现的短语“在一个实施例中”不一定全部指代同一个实施例，也不是与其它实施例相互排斥的单独实施例或替代性实施例。此外，描述了可以由一些实施例但不由其它实施例展现的各种特征。
21.在本公开的上下文内以及在使用每个术语的具体上下文中，本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。对于在本文所讨论的术语中的任何一个或多个术语，可以使用替代性语言和同义词，并且不管术语是否在本文详细说明或讨论，都不应加以特殊意义。在一些情况下，提供某些术语的同义词。对一个或多个同义词的详述并不排斥其它同义词的使用。本说明书中任何地方使用的实例(包含本文所讨论的任何术语的实例)仅是说明性的并且不旨在进一步限制本公开或任何示例术语的范围和含义。同样地，本公开不限于在本说明书中给出的各个实施例。
22.本公开的另外特征和优点将在随后的描述中阐述并且在某种程度上将根据描述而变得明显或者可以通过实践本文公开的原理来进行了解。本公开的特征和优点可以借助于所附权利要求中特别指出的仪器和组合来实现和获得。本公开的这些和其它特征将根据以下描述和所附权利要求而变得更为充分地显而易见或者可以通过实践本文所阐述的原理来进行了解。
23.活性细胞骨架蛋白允许成骨细胞维持其结构完整性并且促进其附着在合成表面上。有机基质(即，主要是i型胶原)的合成需要分泌多种糖蛋白、遗传标志物和骨唾液蛋白的细胞来铺设预矿化骨基质并促进其矿化。成骨细胞在合成骨组织中同时利用的多种功能遵守微妙的平衡，这些平衡进而受到环境条件的强烈影响。细胞对磷灰石矿化的有利环境还应有利于细胞外液的局部过饱和。过饱和胞外环境是由于成骨细胞碱性磷酸酶(alp)、焦磷酸酶活性和骨钙蛋白产生的同时增加而形成的，从而局部地提高磷酸盐和钙浓度。alp通过裂解磷酸基团增加磷酸盐浓度；焦磷酸酶降解抑制磷酸裂解的焦磷酸盐；并且骨钙蛋白结合钙。在生物环境中细胞所暴露于的合成基质的表面化学在调节细胞功能和骨生成方面至关重要。来自基质表面的离子洗脱动力学可以极大地影响细胞的alp活性和骨钙蛋白产生。因此，基质化学可以被定制成抵消骨吸收病理学并且促进组织/植入物界面处的骨形成。
24.如上所述，包含氧化铝的生物陶瓷植入物导致al
3
和ros的洗脱。从生物化学的视角来看，铝通过防止磷酸钙晶体的生长来干扰骨样钙化。铝在与骨矿化前缘的界面处的定位显示al
3
离子充当钙化的物理-化学抑制剂。al
3
阳离子可以取代磷灰石结构中的ca
2
。然而，其的存在“锁定”结构，并且通过减缓羟基磷灰石晶体形成的速率抑制进一步的矿化，同时还改变钙从骨细胞的流入和流出。图10示出了在氧化锆增韧型氧化铝(zta)表面(富含al2o3)与凋亡的成骨细胞之间的相互作用。在图的对应上部部分中清楚地显示的控制水性环境中的细胞/zta-基质相互作用的非化学计量方程式(off-stoichiometry equation)指示al
3
离子的洗脱和羟基铝烷醇的形成。根据al改性磷灰石结构的所指示化学方程式，前者物种最终结合到骨组织的矿物质结构中。涉及电荷从al2o3簇转移到羟基、氧和质子基团的解离吸附代表最可能的事件，因为所述解离吸附比分子吸附在能量方面更有利，在所述分子吸附中h2o将其电荷给予al2o3簇。在生物分子细胞/基质界面处ros的随之发生的(外源性)发展可能不可逆地损害蛋白质和核酸，并且引起膜脂质过氧化，从而最终导致细胞凋亡。因此，细胞/基质界面的上述化学环境可能导致为什么在非官能化zta表面上未观察到
细胞增殖和显著的骨生成抑制。
25.氮化硅(si3n4)具有加速骨修复的独特的表面化学。硅酸和活性氮物种(rns)从si3n4表面的释放可以在细胞分化的初始阶段和随后的磷灰石沉积期间增强骨肉瘤和间充质细胞的成骨活性。元素硅和氮两者可以通过成骨细胞沉积到天然羟基磷灰石的晶格中。这些外来元素可能刺激祖细胞分化和成骨细胞活性，这可能最终导致加速的骨向内生长。
26.本文中提供了氮化硅表面官能化的生物医学植入物、用氮化硅(si3n4)使生物医学植入物的表面官能化的方法和使用经表面官能化的生物医学植入物促进骨生成的方法。表面官能化的方法包含(i)表面激光图案化以及用生物玻璃和si3n4的粉末混合物连续填充图案化孔；以及(ii)使用自动3d添加激光烧结程序沉积微米厚的si3n4层。这两种程序均旨在将氧化物zta陶瓷的不利的al
3
/ros表面化学转化成有利的si
4
/rns表面化学，同时保持其整体机械性质不变。另外，氮化硅具有独特的表面化学，所述表面化学具有生物相容性并且提供了许多生物医学应用，所述生物医学应用包含并发的骨生成、骨诱导、骨传导和抑菌。用于两种表面官能化方法的zta材料的成骨性质是在体外测试的，并且通过比较在表面官能化前后获得的结果而与表面化学相关，如以下实例所示。
27.生物医学植入物可以是可操作的，以在接触或靠近骨的区域中植入患者体内。生物医学植入物的非限制性实例包含椎间脊柱植入物、骨螺钉、脊柱笼、矫形板、线和其它固定装置、脊柱、髋、膝、肩、踝和趾骨中的关节装置、用于面部或其它重建整形外科手术的植入物、中耳植入物、牙科装置等。
28.生物医学植入物或生物医学植入物的一部分可以由生物相容性材料制成，所述生物相容性材料可操作以植入患者体内，持续延长的时间段。在一些实例中，生物医学植入物可以由如氧化铝、氧化锆、氧化锆增韧型氧化铝(zta)等氧化物陶瓷材料形成。在至少一个实例中，生物医学植入物可以是由zta形成的块状或整体植入物。然而，因为氧化物陶瓷表面不应长时间直接暴露于骼组织，所以生物医学植入物的表面可以使用激光和氮化硅进一步官能化。
29.在实施例中，生物医学植入物的表面官能化可以包含：提供生物医学植入物；将激光引导到生物医学植入物的表面以产生多个图案化孔；以及用生物玻璃和氮化硅的粉末混合物填充图案化孔。
30.可以将激光引导到生物医学植入物的表面以产生等距图案化孔的网格。图案化孔可以具有基本上圆柱形形状和/或圆形、椭圆形、正方形或矩形横截面，或具有延伸到生物医学植入物的表面中的任何其它二维特征。在各个实例中，图案化孔各自的直径或大小可以为至少约100μm、至少约200μm、至少约300μm、至少约400μm、至少约500μm、至少约600μm、至少约700μm、至少约800μm或至少约900μm。在至少一个实例中，图案化孔各自的直径为约500μm。在其它实例中，图案化孔的横截面面积可以为约0.01mm2、约0.1mm2、约0.2mm2、约0.3mm2、约0.4mm2、约0.5mm2或约0.6mm2。图案化孔可以是有规律地间隔开的，使得所述图案化孔的间隙为约0.5mm、约1.0mm、约1.5mm或约2mm。在至少一个实例中，图案化孔的间隙为约1mm。图案化孔可以进一步形成网格。在一些实例中，图案化孔位于4
×
4网格中。
31.在一些实例中，激光可以是nd:yag激光。所述激光的波长可以为1064nm，聚焦距离可以为约250mm，标称最大功率可以为约17kw，爆发能量可以为约70j，所施加电势可以为约160-500v和/或放电时间可以为约1-20毫秒。
32.可以用生物玻璃和氮化硅的粉末混合物填充图案化孔。为了形成粉末混合物，可以首先在氮气气氛下，使生物玻璃和氮化硅的粉末在铂坩埚中均质化和熔融。然后，在将经骤冷的混合物压碎成细粉末以形成粉末混合物之前，可以将经熔融的混合物骤冷。填充图案化孔可以包含将粉末混合物压制到生物医学植入物表面上；以及去除多余的粉末混合物。
33.在至少一些实例中，生物玻璃由45wt.％sio2、24.5wt.％cao、24.5wt.％na2o和6wt.％p2o5构成。在一些实例中，氮化硅是α-si3n4。
34.在一些实例中，氮化硅以约5mol.％、约6mol.％、约7mol.％、约8mol.％、约9mol.％或约10mol.％存在于粉末混合物中。可替代地，粉末混合物可以包含至少约5wt.％、至少约5.5wt.％、至少约6wt.％、至少约6.5wt.％、至少约7wt.％、至少约7.5wt.％、至少约8wt.％、至少约8.5wt.％、至少约9wt.％、至少约9.5wt.％、至少约10wt.％、至少约10.5wt.％或至少约11wt.％氮化硅。
35.在另一个实施例中，生物医学植入物的表面官能化可以包含：提供生物医学植入物；在生物医学植入物的水湿表面上施加氮化硅粉末层；在氮化硅层上脉冲激光以烧结氮化硅；以及重复所述施加步骤和脉冲步骤，直到经烧结的氮化硅层具有期望厚度。
36.在此实施例中，氮化硅是β-si3n4。在一些实例中，氮化硅与约6wt.％氧化钇和约4wt.％氧化铝混合。
37.在各个实例中，在表面上烧结的氮化硅的期望厚度可以为约10μm、约15μm或约20μm。
38.在一些实例中，激光是nd:yag激光。所述激光的波长可以为1064nm，标称最大功率可以为约17kw，最大脉冲能量可以为约70j，电压可以为约400v，光斑大小可以为约2μm和/或脉冲时间可以为约4毫秒。
39.本文中进一步提供了一种促进骨生成的方法。所述方法可以包含使具有氮化硅表面官能化的生物医学植入物与组织接触。在一些实例中，组织是骨组织。
40.在一些实例中，与不具有生物玻璃/氮化硅粉末混合物的植入物相比，生物医学植入物上的成骨细胞增殖可能增加。在其它实例中，与在粉末混合物中不具有氮化硅的植入物相比，生物医学植入物上的成骨细胞增殖可能增加。在一些实例中，经表面官能化的生物医学植入物上的生物组织的面积覆盖率和比体积可以比未经涂覆的植入物的生物组织的面积覆盖率和比体积高至少200％、至少225％或至少250％。
41.在另外的实例中，与不具有氮化硅粉末混合物的植入物相比，所述生物医学植入物上的矿化组织增加。在至少一个实例中，与不具有氮化硅粉末混合物的植入物相比，生物医学植入物上的矿物质羟基磷灰石增加。
42.令人惊讶的是，zta的不良成骨行为可以通过本文所述的表面官能化方法来校正。激光图案化和激光涂覆代表能够限制氧化物表面与骨组织之间直接接触的缺点的两种不同的制造方法。不受任何特定理论的限制，si3n4粉末混合物可以刺激成骨细胞合成高质量骨组织，前者有利于骨基质的矿化并且后者增强细胞增殖和骨基质的形成。图10的左侧示出了si3n4与高活性成骨细胞之间的相互作用的示意图。所述图的对应上部部分明确地示出了控制水性环境中的细胞/si3n
4-基质相互作用的非化学计量方程式的级联。si3n4水解后的表面动力学表明nh
4
/nh3离子的洗脱和羟基硅烷醇的形成。自由电子的可用性通过与其
scicorporation,rolla,mo,usa))来填充图案化孔。的以wt.％为单位的组合物如下：45％sio2、24.5％cao、24.5％na2o和6％p2o5。将粉末与5或10mol.％nm大小的α-si3n4粉末(sn-e10，日本宇部市的宇部有限公司(ube co.,ube city,japan))混合。在氮气气氛下，使与5和10mol.％(对应于5.51wt.％和10.69wt.％)的α-si3n4的粉末混合物在铂坩埚中均质化和熔融。在骤冷之后，将熔体压碎成细粉末。使用纯的和具有5和10wt.％si3n4的混合物来填充不同zta样品的孔(对于每种类型的填料，n＝6)。图1a示出了图案化和粉末供给程序的示意图。图1b描绘了在通过脉冲激光束在zta表面挖掘圆柱形孔期间的样品横截面。
52.激光烧结程序
53.用于激光烧结zta基质上的si3n4涂层的起始粉末由与6wt.％氧化钇(y2o3，c级，德国慕尼黑的世泰科公司(h.c.starck,munich,germany))和4wt.％氧化铝(al2o3，sa8-dbm，北卡罗来纳州夏洛特市的baikowski/malakoff公司(baikowski/malakoff,charlotte,north carolina))混合的β-si3n4(美国犹他州盐湖城的sintx有限公司(sintxco.,salt lake city,ut,usa))组成。工作站和nd:yag激光与上述的工作站和激光相同。将连续的si3n4粉末层置于zta样品的水湿表面上，并且重复地冲击脉冲激光以烧结/致密涂层。用于实现si3n4涂层致密化的条件如下：激光波长：1064nm，最大脉冲能量：70焦耳，峰值功率：17kw，电压范围400v，脉冲时间：4毫秒以及光斑大小：2μm。设备在恒定的氮气流通量下运行，以便限制si3n4分解和氧化。重复这个操作，直到在zta基质的整个表面上获得厚度为t＝15
±
5μm的均匀si3n4涂层。图1c描绘述了整体激光烧结程序的示意图。图1d以横截面示出了在来自粉末床的si3n4涂层的烧结/致密化期间的样品/激光相互作用。
54.实例2：表面特征方法
55.用能够获得具有深度选择性的高分辨率光学图像的共聚焦扫描激光显微镜(激光显微镜3d和轮廓测量,基恩士(keyence),vkx200系列,大阪,日本)来表征在用粉末混合物填充前后纹理化zta表面的表面形态。使用20x放大率收集所有图像。使用扫描电子显微镜(sem)和能量分散x射线光谱法(eds)(jsm-700 1f，日本东京的日本电子光学实验室(jeol,tokyo,japan))来获得si3n4涂覆的基质的高分辨率图像和化学组成图。
56.ftir光谱是使用高灵敏度光谱仪(光谱100ft-ir spotlight400，美国马塞诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(perkin-elmer inc.,waltham,ma,usa))获得的。这个设备的光谱分辨率是0.4cm-1
。由八个独立测量结果计算出每种基质的平均ftir光谱。使用“r”对原始数据进行预处理，所述预处理包含原始光谱的基线减法、平滑、归一化和拟合。
57.实例3：细胞培养和生物测试
58.将saos-2人骨肉瘤细胞在补充有10％胎牛血清的4.5g/l葡萄糖dmem(d-葡萄糖、l-谷氨酰胺、酚红和丙酮酸钠；日本京都的半井株式会社(nacalai tesque,kyoto,japan))中进行培养和温育。然后，将细胞在37℃下在皮氏培养皿中增殖24小时。在将最终细胞浓度调节为5
×
105个细胞/毫升之后，将经培养的细胞沉积在先前通过暴露于uv光进行灭菌的si3n4涂覆的基质和未经涂覆的zta基质(每种类型，n＝3)的表面上。通过将细胞接种在成骨培养基(补充有50μg/ml抗坏血酸、10mmβ-磷酸甘油酯、100mm氢化可的松和约10％胎牛小牛
血清的dmem)中，并且然后将样品在37℃下温育7天，进行骨传导性测试。在温育一周期间，将培养基更换两次。
59.细胞免疫染色是通过用4％多聚甲醛固定saos-2细胞15分钟，并且然后在室温下用以下一级抗体温育样品30分钟来进行的：小鼠抗人gla骨钙蛋白(日本草津市的宝生物工程株式会社(takarabio,kusatsu-shi,japan))和兔抗人骨桥蛋白(稀释度＝1:500)(日本群马前桥市的免疫生物实验室有限公司(ibl,maebashi-shi,gunma,japan))。将细胞与荧光缀合的抗体以及山羊抗小鼠抗体fitc缀合(美国德克萨斯州蒙哥马利市的bethyl实验室(bethyl laboratories,montgomery,tx,usa))和山羊抗兔抗体pe缀合和(1:200)(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa))的次级抗体一起温育。将细胞核用hoechst33342(1:100)(日本熊本市的同仁化学研究所(dojindo,kumamoto-shi,japan))进行染色。在荧光显微镜(bzx710；日本大阪的基恩士)下观察经染色的样品。用3d激光共聚焦显微镜(ols4000-sat；
60.日本东京的奥林巴斯光学有限公司(olympus co.,tokyo,japan))获得共聚焦扫描激光显微镜图像，以评估在暴露于基质一周后由saos-2细胞产生的骨组织每单位面积的体积量。还通过使用自动软件在荧光显微照片上进行直接像素计数来估计沉积的骨组织中骨钙蛋白和骨桥蛋白的量。
61.通过计算其平均值
±
一个标准偏差来分析与骨生成相关的数据。使用斯图登氏t测试(student's t-test)来检测数据之间的统计学上显著的差异，p值《0.01被认为是统计学上显著的，并且在图中用星号标记。
62.实例4：激光图案化和填充的zta表面
63.图2a和2b分别示出了通过光学显微镜和激光形貌获得的zta表面上的激光钻孔的高放大率图像。在用粉末填充之后的孔的类似图像分别示出于图2c和2d中。初步校准定位了用于图案化zta表面的最佳条件。如图2a-2d所示，脉冲激光钻孔产生具有规则圆形形状且具有相对清晰轮廓的孔。然而，应当注意，zta在激光束下部分熔融，并且熔化材料从孔中喷射，从而在孔边界附近产生一些粗糙化。然后对孔进行连续的粉末填充。激光图案化孔的填充是通过首先将粉末混合物压制到zta表面上并且然后使用尖锐的刀片手工地去除多余材料来完成的。粉末混合物吸附到孔的内壁。在本研究中，选择直径为500μm的图案化孔。这种孔隙度范围被认为对于细胞粘附、增殖和成骨细胞活性的刺激是最佳的。图3a和3b分别示出了通过光学和激光扫描显微镜成像的在zta表面上图案化的直径为500μm的孔的4
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4网格。孔的形态的深度表征示出于图3c中。后一种表征揭示了孔的规则圆柱形形状，其中与孔直径相当的深度处具有底表面的不规则形态。示出了孔的粉末填充的光学显微镜和激光显微镜的结果分别在图3d和3f中给出。这些后者的观察结果显示，孔完全填充有粉末混合物。
64.图4a-4e示出了在暴露于saos-2细胞1周后来自(图4a)原始的zta表面、(图4b)图案化zta表面、(图4c)仅填充有粉末的图案化zta表面、(图4d)填充有wt.％si3n4粉末混合物的图案化zta表面和(图4e)填充有wt.％si3n4粉末混合物的图案化zta表面的荧光显微镜的结果。在图4a-4e的每个部分的上部、中部和底部图像
中通过荧光显微镜对细胞核(蓝色)、骨桥蛋白(红色)和骨钙蛋白(绿色)进行标记。在暴露于saos-2细胞1周之后，原始的zta基质(图4a)显示无细胞增殖并且仅存在微弱的骨钙蛋白和骨桥蛋白的信号，这表明对成骨细胞的生物活性反应有限。类似地，图案化且未填充的zta样品(图4b)显示在孔内和平坦区域上无细胞增殖和非常微弱的骨钙蛋白/骨桥蛋白信号。然而，对于填充有的图案化zta表面，记录细胞增殖和骨钙蛋白/骨桥蛋白的改善(图4c)。在填充有混合物的图案化zta表面上，记录极大增强的细胞增殖(蓝色信号)和骨桥蛋白(红色信号)；粉末混合物中si3n4分数越高，蓝色和红色荧光信号越强(参见图4d和4e)。此外，绿色骨钙蛋白荧光(所述绿色骨钙蛋白荧光代表矿化组织区域)在这些孔填充有混合物时显示出来自填充的孔以及还来自zta表面的未图案化区域的清晰信号。图5总结了通过激光显微镜获得的成骨细胞在不同基质上生长的生物组织的面积覆盖率和比体积方面的定量数据。两个数据集都是通过排除孔区域来计算的，以提高比较不同样品的准确性，因为这些强荧光区域难以评估。在用混合物图案化的zta上的生物组织的面积覆盖率和比体积比未图案化的zta的生物组织的面积覆盖率和比体积高约200％和约250％。在仅填充有和不同的混合物的图案化zta样品之间在孔区域外没有统计学上显著的差异。然而，图4a-4e中的荧光图像清楚地显示，当填充孔的粉末混合物包含一部分si3n4粉末时，来自图案化zta表面的绿色荧光信号强烈增加。这些数据证实，激光图案化策略极大地刺激了细胞增殖和生物组织产生。应当注意，填料的添加还刺激了生物反应。然而，增加粉末混合物中si3n4的存在增强了成骨细胞增殖(参见图4c和4d)，并且实现了骨质量方面的重要功能。图6a示出了对未图案化、图案化和图案化/填充的zta样品全集的ftir表征的结果。从光谱中提取了两个主要结果：(i)仅添加填料导致在约1000cm-1
的光谱区域中的信号强度显著增加，这代表矿物质羟基磷灰石；以及(ii)将一部分si3n4添加到填料中导致在约1500cm-1
处信号的相对强度增加，所述信号与酰胺相关并且代表骨组织的生物基质。与图4a-4e中的荧光数据及其在图5中的定量一致，在原始或图案化zta表面上未检测到矿化组织。图6b给出了ftir光谱中磷灰石和有机基质信号之间的强度比率随着zta基质类型变化的图。在图案化孔中仅添加填料导致矿物质羟基磷灰石谱带的强度明显增加。然而，在填料混合物中添加10wt.％分数的si3n4使得zta的ftir无机/有机谱带比率处于与记录用于健康骨组织相同的范围内。
65.实例5：si3n4涂覆的zta表面的激光烧结
66.图7a和7b分别示出了跨涂覆区域与未经涂覆区域之间的界面的部分si3n4涂覆的zta表面的顶表面上拍摄的光学显微照片和激光显微照片(分别是显微照片的左侧和右侧)。图7b的三维视图显示，si3n4涂层的平均厚度为约t＝15
±
5μm。图7c和图7d部分的拉曼光谱分别取自zta未经涂覆的侧面和si3n4涂覆的侧面。在图7c中，zta光谱由属于四方晶和单斜晶氧化锆多晶型物(分别标记为t和m)的许多谱带和来自氧化铝相的一个谱带(在约397cm-1
处；标记为a)构成。相反地，在si3n4涂覆的区域中，拉曼光谱仅在低频下呈现si-n骨架三重态并且在约510cm-1
处呈现si-si振动谱带。后一拉曼谱带证实自由硅簇的
存在是si3n4结构在激光烧结期间的部分分解的产物。
67.图8a-8d示出了在生物环境中体外暴露于saos-2成骨细胞1周之后，对图7a和7b中的相同区域进行的sem/eds分析。图8a中的sem显微照片的主要特征是仅在显微照片的左侧(即，涂覆有si3n4的部分)存在高覆盖率的骨磷灰石。对si、al和ca的eds分析(分别在图8b、8c和8d中)揭示，在激光烧结期间，涂覆区域中富含si的区域并且al元素没有扩散传输到涂层中(如图8c所示，在涂覆/未经涂覆的界面附近的涂覆区域中非常弱的al污染被认为是由激光加工期间产生的熔融残余物引起的)。富含si的区域的存在对应于来自骨羟基磷灰石的ca的存在。由成骨细胞在zta表面的si3n4涂覆的侧面上生长的骨组织的大岛状物的光学显微照片和激光显微照片分别示出于图9a和9b中。图9c中的三维激光显微镜视图揭示了骨结构高度达到涂覆结构平面上方约100μm的细节。在si3n4涂覆区域与zta未涂覆区域之间的界面附近收集的平均ftir光谱(图9d)揭示，前一区域中的矿物质磷灰石的(po4)
3-谱带的强度比后一区域的强度高四倍。总之，eds、激光显微镜与ftir数据之间的一致性证实了si3n4涂层对于增强zta陶瓷相对于人成骨细胞的成骨性能的积极作用。
68.虽然已经描述了若干个实施例，但本领域的技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可以使用各种修改、替代性构造和等同物。另外，为了避免不必要地模糊本发明，没有描述许多公知的过程和元件。因此，以上描述不应被视为限制本发明的范围。
69.本领域的技术人员将理解，目前公开的实施例通过举例而非限制的方式进行教导。因此，以上描述中包含的或附图中示出的内容应当被解释为说明性的而不应在限制性意义上进行解释。以下权利要求旨在涵盖本文所述的所有一般特征和特定特征以及在语言上可以被说成落入其间的对本发明方法和系统的范围的所有陈述。