一种水凝胶组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种水凝胶组合物及其应用。


背景技术：

2.细菌感染是人类健康和医学界面临的最普遍和最具挑战性的疾病之一。随着技术的进步，开发具有防止外部污染和组织感染，促进组织再生的新型生物材料已成为研究的热点。水凝胶是一种具有三维网络结构的聚合物，在过去的20年里广泛应用于再生医学和生物医学应用。由于水凝胶不容易粘附于蛋白质和其他物质上，当它们暴露在血液、体液和人体组织中时，它们对人体表现出良好的生物相容性和无毒性。此外，水凝胶与天然组织的弹性和质地非常相似，可用作人体植入物以减少不良反应。因此，水凝胶不仅是一种很有前途的生物医学应用材料，如药物载体、组织支架和生物医学设备(软性隐形眼镜)，而且还可以防止进一步的组织损伤和细菌入侵。抗菌水凝胶具有促进组织再生和抗菌双重优点，可以满足生物材料的需要。传统的直接负载抗生素的抗菌水凝胶材料可能会产生抗生素耐药性，进而产生多重耐药微生物或“超级细菌”。因此，寻找新的抗菌策略势在必行。常规的抗菌敷料如纳米银敷料等，虽然有较好的抗菌性能，但因纳米银的存在，由于其较大的细胞毒性，不可避免的会给创面带来一定程度的损害。同时，纱布类的敷料，易粘附于伤口上，在伤口愈合后揭开时，容易对伤口造成二次伤害。


技术实现要素：

3.本发明在一方面提供一种水凝胶组合物，所述组合物包括：(1)第一组分，其中所述第一组分包括bmkn2多肽和醛基化普朗尼克；(2)第二组分，其中所述第二组分包括血根碱和氨基化透明质酸。本发明在天然复合基质上通过化学交联反应(席夫碱反应)制备稳定的水凝胶，其有良好的溶胀性能和生物相容性，在创面处缓慢释放抗菌物质bmkn2多肽和血根碱，起到长效抗菌的效果。
4.在一些实施方式中，bmkn2多肽是负载bmkn2多肽的聚多巴胺纳米颗粒(pda-bmkn2)。
5.在一些实施方式中，所述bmkn2多肽与所述聚多巴胺纳米颗粒质量比为bmkn2多肽：聚多巴胺纳米颗粒＝1:1～3。在一些实施方式中，所述bmkn2多肽与所述聚多巴胺纳米颗粒质量比为bmkn2多肽：聚多巴胺纳米颗粒＝1:2。
6.在一些实施方式中，所述普朗尼克为f127。
7.在一些实施方式中，所述bmkn2多肽与所述聚多巴胺纳米颗粒质量比为bmkn2多肽：聚多巴胺纳米颗粒＝1:2。在一些实施方式中，所述水凝胶醛基化普朗尼克与氨基化透明质酸的质量比为醛基化普朗尼克：氨基化透明质酸＝5:2、5:1或15:2。
8.本发明另一方面提供一种水凝胶，所述水凝胶由上述任一种水凝胶组合物的第一组分和第二组分反应后形成。本发明在天然复合基质上通过化学交联反应(席夫碱反应)制备稳定的水凝胶，其有良好的溶胀性能和生物相容性，在创面处缓慢释放抗菌物质bmkn2多
肽和血根碱，起到长效抗菌的效果。
9.在一些实施方式中，所述第一组分和第二组分在缓冲溶液中反应后形成。在一些实施方式中，第一混合液中所述bmkn2的浓度为200μg/ml。在一些实施方式中，第二混合液中所述血根碱多肽的浓度为1μg/ml。
10.在一些实施方式中，所述缓冲溶液为pbs。
11.在一些实施方式中，在所述反应后所述血根碱的浓度为0.5μg/ml。在一些实施方式中，在所述反应后所述bmkn2多肽的浓度为100μg/ml。
12.本发明再一方面提供一种敷料，所述敷料所述水凝胶由上述任一种水凝胶组合物的第一组分和第二组分反应后形成。本发明在天然复合基质上通过化学交联反应(席夫碱反应)制备稳定的水凝胶，其有良好的溶胀性能和生物相容性，在创面处缓慢释放抗菌物质bmkn2多肽和血根碱，起到长效抗菌的效果。
13.在一些实施方式中，所述敷料用于开放性感染创面。
14.本发明再一方面提供上述任一种水凝胶组合物或上述任一种水凝胶在制备具有抗微生物作用的止血辅助物中的应用。本发明在天然复合基质上通过化学交联反应(席夫碱反应)制备稳定的水凝胶，其有良好的溶胀性能和生物相容性，在创面处缓慢释放抗菌物质bmkn2多肽和血根碱，起到长效抗菌的效果。
15.在一些实施方式中，所述微生物为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中的至少一种。
16.本发明再一方面提供上述任一种水凝胶的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中，得到第一混合液；(2)将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中，得到第二混合液；将所述第一混合液和第二混合液混合，得到水凝胶。
17.在一些实施方式中，所述第一混合液与第二混合液的体积为1:1。在一些实施方式中，第一混合液中所述血根碱的浓度为1μg/ml。在一些实施方式中，第二混合液中所述bmkn2多肽的浓度为200μg/ml。
18.本发明在天然复合基质上通过化学交联反应(席夫碱反应)制备稳定的水凝胶，其有良好的溶胀性能和生物相容性，在创面处缓慢释放抗菌物质bmkn2多肽和血根碱，起到长效抗菌的效果。
附图说明
19.图1.实施例2中10％f127-cho/2％aha水凝胶成胶前后外观图。
20.图2.pda-bmkn2电子透射电镜图。
21.图3.不同配比f127-cho/aha水凝胶的溶胀性能。
22.图4.f127-cho/aha水凝胶在有无溶菌酶条件下的体外降解性能。
23.图5.血根碱、pda-bmkn2的体外释放曲线。
具体实施方式
24.bmkn2多肽
25.bmkn2多肽(序列为figaiarllskif)是存在于蝎毒液中的一种抗菌肽，其被报道对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌具有有效的抗菌性能，这为治疗细菌感染开辟了一条潜在的新途径。然而，大部分抗菌肽是水溶性的，在没有其它载体存在的情况下很快就会水解并失
效。
26.血根碱
27.血根碱是一种菲异喹啉类生物碱，分子量为367.8，具有良好的抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物学作用。此外，血根素还具有广谱生物活性，对大肠杆菌、假单胞菌等具有良好的抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用。
28.实施例1.
29.醛基化普朗尼克(f127-cho)的制备：称取12g的普朗尼克f127(～0.001mol)，将其加入到250ml烧瓶中，加入30ml甲苯共沸干燥，干燥完毕，旋蒸除去大部分甲苯。向烧瓶中加入50ml无水二氯甲烷和2.78ml三乙胺(～0.02mol)，溶解完毕，将烧瓶冷却至0℃，在搅拌下于30min内缓慢滴加10ml对甲基苯磺酰氯(3.82g，0.02mol)的二氯甲烷溶液，然后在室温下反应24h。反应完毕，加入100ml水，用25ml
×
5的二氯甲烷萃取。有机层再分别用1m的盐酸溶液及饱和食盐水洗涤(25ml
×
5次)，收集有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩后用冷乙醚沉淀，40℃真空干燥箱中干燥，得到普朗尼克对甲苯磺酸酯。取上述反应得到的普朗尼克对甲苯磺酸酯(12g，～0.001mol)溶于60ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，称取1.22g对羟基苯甲醛(0.01mol)及1.38g无水碳酸钾(0.01mol)加入到上述溶液中。将混合物在80℃条件下搅拌反应3天，然后冷却至室温，加入50ml水，用25ml
×
5的二氯甲烷萃取，收集有机层，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩后用冷乙醚沉淀，最终醛基化的产物在40℃真空干燥箱中干燥，即为f127-cho。
30.氨基化透明质酸(aha)的制备：称取透明质酸钠(ha)0.5g，乙二酸二酰肼(adh)5g,将其溶于100ml去离子水中，搅拌均匀。称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(edc)0.8g，1-羟基苯并三唑水合物(hobt)0.7g，将其溶于二甲亚砜/水(v/v＝1:1，各5ml)混合液中，将混合液滴加至上述溶液中，用稀盐酸调节ph至5.0，室温反应1天。反应结束，用透析袋(kw＝12000)于去离子水中透析，产物冻干，产物于4℃环境中保存。
31.载bmkn2聚多巴胺纳米粒(pda-bmkn2)的制备：1.pda(聚多巴胺)纳米颗粒的制备：室温下量取90ml去离子水、40ml乙醇、2ml氨水，搅拌混匀30min，快速称取0.5g盐酸多巴胺，将其溶于10ml水中，将其缓慢滴加到以上混合溶液中，溶液由无色变为淡黄色，后再变为黑色，反应4h后，滴加稀盐酸将溶液ph调至6.5左右。反应结束后，将溶液在4℃条件下，14000r/min离心收集沉淀，将沉淀用水清洗三次后，再用去离子水分散，4000r/min离心除去大分子的pda，上层溶液冻干，制得pda纳米颗粒。2.pda-bmkn2抗菌纳米颗粒的制备：称取bmkn2抗菌肽(购买自上海楚肽生物科技有限公司)10mg、edc 10mg溶于5ml ph 5.5的pbs缓冲液中，室温搅拌15min，然后称取nhs15mg，加入到上述溶液中，再添加10ml ph 7.4的pbs缓冲液，搅拌15min后，将称取好的20mg pda溶于10ml水/dmso(v/v＝3:1)的混合溶液后缓慢滴加至之前的溶液中，冰浴条件下反应4小时后，将反应液用kw＝2000da的透析袋透析4h，冻干，得到pda-bmkn2，4℃条件下保存。
32.实施例2.
33.f127-cho/aha水凝胶制备：称取0.2g根据实施例1制备的aha，将其溶于5ml pbs中，配制成浓度为0.04g/ml的初始溶液，同理，称取一定量的根据实施例1制备的f127-cho，将其溶于pbs中，配制成浓度为0.1g/ml的溶液，将配制好的aha溶液与f127-cho溶液按体积比1:1混合均匀后，将其倒入至48孔板中，等待3min后即可得到5％f127-cho/2％aha的凝
胶。
34.称取0.2g根据实施例1制备的aha，将其溶于5ml pbs中，配制成浓度为0.04g/ml的初始溶液，同理，称取一定量的根据实施例1制备的f127-cho，将其溶于pbs中，配制成浓度为0.2g/ml的溶液，将配制好的aha溶液与f127-cho溶液按体积比1:1混合均匀后，将其倒入至48孔板中，等待3min后，即得10％f127-cho/2％aha组水凝胶。
35.称取0.2g根据实施例1制备的aha，将其溶于5ml pbs中，配制成浓度为0.04g/ml的初始溶液，同理，称取一定量的根据实施例1制备的f127-cho，将其溶于pbs中，配制成浓度为0.3g/ml的溶液，将配制好的aha溶液与f127-cho溶液按体积比1:1混合均匀后，将其倒入至48孔板中，等待3min后，即得15％f127-cho/2％aha组水凝胶。
36.实施例3.
37.f127-cho/aha/pda-bmkn2水凝胶制备：称取一定量的pda-bmkn2分散于上述实施例2中配制的f127-cho溶液中，将f127-cho溶液与aha溶液按体积比1:1混合均匀后，将其倒入至48孔板中，待其凝固后得到10％f127-cho/2％aha/血根碱/pda-bmkn2水凝胶，其中pda-bmkn2在水凝胶中的浓度为100μg/ml。
38.实施例4.
39.f127-cho/aha/血根碱水凝胶制备：称取一定量的血根碱溶于配制好的的4％aha溶液中，将f127-cho溶液与aha溶液按体积比1:1混合均匀后，将其倒入至48孔板中，待其凝固后得到10％f127-cho/2％aha/血根碱水凝胶，其中血根碱在水凝胶中的最终浓度为0.5μg/ml。
40.实施例5.
41.f127-cho/aha/血根碱/pda-bmkn2水凝胶制备：称取一定量的pda-bmkn2分散于上述实施例2中配制的f127-cho溶液中，称取一定量的血根碱溶于配制的4％aha溶液中，将f127-cho溶液与aha溶液按体积比1:1混合均匀后，将其倒入至48孔板中，等待3min后即可成胶，得到10％f127-cho/2％aha/血根碱/pda-bmkn2水凝胶，其中pda-bmkn2在水凝胶中的浓度为100μg/ml，血根碱在水凝胶中的最终浓度为0.5μg/ml。
42.实施例6.凝胶性能测试
43.1、透射电镜(tem)测试
44.称取1mg pda-bmkn2(根据实施例1制备)，将其分散于1ml水中，用0.45um滤膜过滤，滤液滴在铜网的碳支持膜上，空气中自然干燥后，置于高分辨透射电镜中观察纳米粒子的总体形貌。图2为实施例1中制备的pda-bmkn2的电子透射电镜图，从图中看出，所制备的pda-bmkn2分散性较好，粒径较为均一，粒径大小在200nm左右。
45.2、溶胀率测试
46.用天平称量水凝胶的重量，记为w0，将水凝胶置于pbs(ph＝7.4)溶液中，在特定的时间点，用润湿的滤纸(润湿不易损伤凝胶)迅速拭去水凝胶表面水分，立即称重w
t
。每个样品平行做三次实验，求其平均值，样品溶胀率按照公式(4-1)计算：
47.xr＝(w
t
－w0)/w0×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀ
公式(4-1)
48.其中，w0为水凝胶的重量；w
t
为吸水后水凝胶的重量；xr为水凝胶的溶胀率。
49.图3为实施例2中制备的5％f127-cho/2％aha、10％f127-cho/2％aha、10％f127-cho/2％aha三组水凝胶的体外溶胀性能测试结果，从图中看出，三组水凝胶都具有良好的
溶胀率，随着f127-cho浓度的增加，水凝胶的溶胀率有所降低，这是因为f127-cho为低浓度时，aha中还剩有多余氨基，随着f127-cho浓度增加，aha多余氨基被反应完，使得水凝胶交联度增加，促使水凝胶溶胀率降低。
50.3、体外降解实验
51.将实施例2中制备的部分水凝胶冷冻干燥后称取质量，记为w0，再将初始的水凝胶分别浸泡在pbs溶液(ph＝7.4)及含1000u/ml溶菌酶的pbs溶液(ph＝7.4)中，置于恒温摇床(37℃，70rpm)。在测量的时间点，取出水凝胶，用超纯水洗涤后冻干，将其冷冻干燥，干燥后准确称取质量，记(w
t
)。采用公式(4-2)计算出水凝胶的重量损失，记为x：
52.x＝{1－[(w
t
－w0)/w0]}
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
公式(4-2)
[0053]
图3为实施例2中制备的10％f127-cho/2％aha组水凝胶分别在有无溶菌酶条件下的体外降解实验测试结果，从图中看出，不加溶菌酶时，水凝胶在9天后完全降解，添加了溶菌酶后，水凝胶降解速度有所增加，在8天后完全降解。
[0054]
4、血根碱、pda-bmkn2的体外释放曲线
[0055]
(1)标准曲线
[0056]
精密称取抗菌肽bmkn2 1mg溶于1ml pbs溶液中，配置成1mg/ml浓度的母液，将1液进行一系列稀释，配置成50μg/ml、40μg/ml、30μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml的溶液，取上述溶液各0.5ml于石英比色皿中，用紫外分光光度计测量其在204.5nm吸光度值，绘制标准曲线；精密称取血根碱1mg溶于1ml pbs溶液中，配置成1mg/ml浓度的母液，将母进行一系列稀释，配置成25μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml的溶液，取上述溶液各0.5ml于石英比色皿中，用紫外分光光度计测量其在276nm吸光度值，绘制标准曲线
[0057]
(2)水凝胶体外药物释放测试
[0058]
分别将装载bmkn2 200μg、血根碱200μg的水凝胶加入到10ml pbs溶液中，放置在37℃恒温摇床中，在特定的时间点取出1ml溶液后加入1ml新的pbs以保持10ml pbs溶液体积不变，使用紫外分光光度计测定取出溶液中药物的浓度，对载药水凝胶的释放行为进行连续7天测定，根据标准曲线测定bmkn2和血根碱的释放量，绘制累积释放曲线。
[0059]
图5为载bmkn2和载血根碱水凝胶的累计释放释放曲线。药物释放第1天，血根碱释放率约为59％，bmkn2抗菌肽释放率约为47％，相对于血根碱来说，因为bmkn2抗菌肽与pda分子相连接，释放过程比血根碱要慢。两种药物基本上到了第4天就不再释放了，血根碱总释放率约为68％，bmkn2抗菌肽总释放率约为65％，两者都未释放完全，应该是部分药物被随时间增加失活所致。
[0060]
5、体外抗菌试验
[0061]
用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌评价水凝胶的抗菌性能。将抗菌试验中的细菌od值调整为0.1。将水凝胶样品与细菌悬液在37℃的生化培养箱中共培养，12h后，对共混菌液进行od值测量。将100μl的菌悬液稀释后接种在lb琼脂平板上。37℃培养24h后计数可培养菌落数，用公式(4-3)
[0062]
ar(％)＝(n
c-ns)/nc
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
公式(4-3)
[0063]
计算抗菌率(ar)，其中nc为对照样品的平均菌落数，ns为水凝胶样品的平均细菌菌落数。
[0064]
表1：不同水凝胶的体外抗菌测试结果
[0065][0066]
表1为实施例2(即10％f127-cho/2％aha)、3、4和5中所制备的水凝胶的体外抗菌测试结果，从表中看出，不添加pda-bmkn2及血根碱的水凝胶抗菌率为负值，这可能是纯水凝胶材料为细菌提供了营养物质的缘故，单独添加pda-bmkn2及血根碱的水凝胶均具有一定的抗菌性能，但抗菌率不高，而当两者同时添加时，抗菌率达到90％以上，这一结果表明，pda-bmkn2及血根碱的联用能够较好地起到抗菌的效果。
[0067]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。