用于牙科组织和/或其他组织再生的负载补体活性片段的三维生物材料

1.本发明涉及组织修复和再生领域，特别是牙科组织的修复和再生。本发明提供了一种三维生物材料，其包含包封至少一个分散在其中的补体活性片段的颗粒。本发明还涉及制造所述生物材料的方法。本发明的生物材料可有利地用于牙髓、牙本质、牙龈、牙周组织的再生，以及骨组织的再生。


背景技术：

2.牙科疾病，包括龋齿和牙周病在内，都是口腔健康的主要问题。因此，开发可靠且价格合理的牙科疾病治疗策略是一个积极研究的领域。
3.在口腔健康领域以及其他医学领域，能够使组织再生而不仅是恢复它们的治疗策略正在全面发展。特别地，进行研究以提供牙髓、牙本质、骨或牙龈组织的再生方法。
4.组织再生需要三个主要的要素：干细胞、支架和激活信号。
5.即使大多数组织在小病变的情况下具有重要的再生能力，但当病变达到临界大小时，组织再生受到限制。在这种情况下，有必要刺激新血管的形成和干细胞的募集。
6.胶原存在于牙髓、牙本质和骨组织中，在血管生成过程和骨再生中起着至关重要的作用。然而，诱导骨再生是缓慢的过程。
7.几项研究表明，在受损组织中提供干细胞能够刺激其再生。然而，干细胞治疗具有许多缺点，例如相关成本，还有技术和实际问题。
8.已经证明，属于先天免疫的补体系统参与再生的生理过程。补体系统的激活导致生物活性片段的产生。已经特别证明，补体的这种生物活性片段，例如c5a的释放诱导了牙髓祖细胞的募集，这在再生过程的启动中是必不可少的(chmilewsky f.等人,j.dent.res.,2013,92(6),pp.532-539)。还证明了这些片段诱导间充质干细胞的迁移，而间充质干细胞的活化对骨再生至关重要(ignatius a等人,j.trauma.,2011,71,pp.952-960)。因此，如果补体的生物活性片段被整合材料中，它可能会吸引骨干细胞和髓干细胞以及表达这些补体片段受体的所有其他干细胞。
9.wo2013/098331公开了补体蛋白c3a/c4a、生长因子、细胞因子、抗菌/抗病毒因子的组合；干细胞刺激因子和趋化因子用于治疗需要组织修复和再生的疾病。wo2013/098331指出，所公开的组合可以与生物材料如胶原组合使用，并且可以浸渍支架，从而产生修复材料，用于治疗龋齿和牙髓炎症。然而，这种在支架内的使用没有详细说明或举例说明，并且在wo2013/098331中没有任何证据表明补体蛋白c3a/c4a可以在这种支架中保持稳定，也没有证据表明它可以从支架中特别是以其活性形式有效释放。此外，没有显示这种材料是否可以提供持续的超时效果。
10.本发明旨在提供一种能够诱导和加速组织再生，特别是牙本质-牙髓组织再生的生物材料。选择补体活性片段作为生物活性成分以诱导干细胞的募集以启动再生。困难在于提供具有生物相容性和/或可再吸收的基质的生物材料，该基质适合于使细胞进展，适合
于包括补体活性片段并以活性形式持续释放。
11.补体活性片段，如c5a，具有复杂的三维结构。例如，c5a是约11kda、74个氨基酸的糖蛋白，其具有四个由肽环连接的反平行α螺旋，由三个关键的二硫键稳定(manthey等人，int.j.biochem.cell biol.,2009,41,2114-2117)。三维结构的完整性对于保证补体活性片段的生物学功能至关重要。当补体活性片段的三维结构受到影响时，它便失去了其生物学功能。
12.此外，补体活性片段，例如c5a，具有依赖于温度条件的稳定性。例如，制造商建议将c5a储存在-20℃至-70℃的低温下，并确保在-20℃至-70℃储存时3个月的重构后的稳定性(即在水溶液中)，但如果储存在2℃至8℃，则只有1个月。
13.鉴于补体活性片段的敏感性，它们在生物材料中的处理和掺入可能是至关重要的，并且可能由于三维结构损伤而导致非活性形式的释放，或由于降解而导致部分掺入的补体活性片段松散。此外，即使三维结构不受掺入生物材料的影响，并且如果制造条件不导致热降解，则以活性形式释放补体活性片段的效率是不可预见的。
14.本发明的生物材料是一种三维生物材料，其中分散的颗粒包封补体成分、补体活性片段或其组合。如下文所证明的，本发明的生物材料能够控制释放补体成分或补体活性片段，尽管它们在三维基质中处于中间包封和分散状态，但仍具有保留的活性。
15.牙髓祖细胞的募集特别受补体活性片段c5a梯度的引导。因此，为了加速牙本质-牙髓再生，提议提供根据本发明的包含c5a作为补体活性片段的生物材料，其(1)释放c5a以形成从损伤部位到祖细胞的c5a梯度和(2)其中三维基质适合于促进细胞进展。
16.本发明的生物材料具有能够使牙髓体积完全再生的优点。它可以避免牙髓体积的显著减少，这与之前直接盖髓或牙髓切断术过程中使用的材料相反。这是特别有利的，因为在继发龋的情况下，牙髓体积的减少会导致牙髓再生能力的降低。


技术实现要素：

17.因此，本发明涉及一种生物材料，其包含：
[0018]-由至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成的三维基质，和
[0019]-包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒；所述颗粒分散在三维基质中。
[0020]
根据一个实施方案，生物相容性和/或可再吸收的聚合物选自多糖、蛋白质及其任何组合或共聚物；优选地选自胶原、壳聚糖、海藻酸盐及其任何组合或共聚物；更优选胶原。
[0021]
根据一个实施方案，包封颗粒为聚合物微球。优选地，微球的聚合物选自生物相容性和/或可生物降解的聚酯；优选地选自聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸(pga)、聚羟基丁酸酯(phb)、聚3-羟基戊酸酯、聚丁二酸乙二醇酯(pesu)、聚丁二酸丁二醇酯(pbsu)及其任何组合或共聚物；优选地，聚合物微球由聚(乳酸-co-乙醇酸)(plga)制成。
[0022]
根据一个实施方案，补体成分和补体活性片段选自补体成分c1、补体成分c2、补体成分c3、补体成分c4、补体成分c5、补体活性片段，例如c5a或c3a及其任何组合；优选补体成分c5或c3；更优选补体活性片段c5a或c3a。
[0023]
根据一个实施方案，生物材料包含包封补体活性片段c5a的plga微球，所述微球分散在胶原三维基质中。
[0024]
根据一个实施方案，生物材料还包含由三维基质制成的第二相，所述三维基质由
至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成，所述三维基质不含包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒。
[0025]
根据一个实施方案，生物材料的三维基质是多孔的。根据一个实施方案，生物材料的三维基质是水凝胶。
[0026]
本发明还涉及制造根据本发明的生物材料的方法，所述方法包括使包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒与至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物接触，以形成其中分散有颗粒的由至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成的三维基质。
[0027]
根据一个实施方案，包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒通过在水凝胶中浸渍而与生物相容性和/或可再吸收聚合物接触，所述水凝胶由生物相容性和/或可再吸收的聚合物形成。在这种情况下，方法还可以包括除去水的步骤。根据一个实施方案，包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒通过在水凝胶中浸渍而与生物相容性和/或可再吸收的聚合物接触，所述水凝胶通过将所述聚合物溶解在水溶液中然后均质化而制备。在这种情况下，方法还可以包括除去水以提供海绵形式的生物材料的步骤。
[0028]
本发明还涉及根据本发明的生物材料在组织修复和/或再生中的用途。在一个实施方案中，组织选自牙髓、牙本质、牙周组织和牙龈组织。在另一个实施方案中，组织是骨。
[0029]
定义
[0030]
在本发明中，以下术语有以下含义：
[0031]“生物相容性”是指在给定生物体中引起很少或不引起毒性反应的材料，和/或能够与特定细胞类型或组织整合的材料。
[0032]“生物材料”是指适合与生物系统和/或活组织相互作用的任何材料，优选用于医疗目的-治疗性(治疗、增强、修复或替代身体的组织功能)或诊断性材料。
[0033]“补体活性片段”是指存在于血浆中并在再生过程中发挥重要作用的活性补体分子。补体活性片段的实例是c5a。
[0034]“补体成分”是指存在于血浆中并且需要活化步骤才能起作用的补体分子。补体成分的实例是c5。
[0035]“共聚物”是指由至少两种不同的单体衍生而来的聚合物。共聚物可以是交替的、周期的、统计的、无规的或嵌段的共聚物。
[0036]“牙科组织”是指牙齿或牙齿直接环境的各种组织。例如，牙科组织是指牙髓、根髓、根尖周组织、牙周组织、牙骨质、牙本质、第三期牙本质、反应牙本质、修复牙本质、牙本质小管，或任何与包含成纤维细胞、成牙本质细胞、内皮细胞、免疫细胞，包括但不限于组织细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞或浆细胞的牙髓相关的组织。
[0037]“牙本质”是指身体的钙化组织，其与牙釉质、牙骨质和牙髓是牙齿的四大组成部分之一。牙本质通常被牙冠上的牙釉质和牙根上的牙骨质覆盖，并围绕整个牙髓。
[0038]“牙髓”是指牙齿内部的软的活组织，并且被限制在牙齿的牙冠区域和根管内。
[0039]“包封颗粒”是指内部包含一种或多于一种活性化合物的颗粒。
[0040]“水凝胶”是指由聚合物链的三维网络和填充其间空间的水组成的二元或多元体系。在一个实施方案中，可以通过将聚合物溶解在水溶液中然后均质化来制备水凝胶。
[0041]“微球”是指直径在微米范围内的小球形颗粒(通常为1μm至1000μm(1mm))。“聚合物微球”是指其中颗粒由聚合物制成的微球。
[0042]“单糖”是指多羟基醛或多羟基酮，其至少包含碳原子，并且它们是不可水解的。单糖的非限制性实例是丙糖(甘油醛、二羟基丙酮)；丁糖(赤藓糖、苏糖、赤藓酮糖)；戊糖(脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、核酮糖、木酮糖)；己糖(阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖)；脱氧己糖(岩藻糖、鼠李糖)；庚糖(景天庚酮糖、甘露庚酮糖)；壬糖(神经氨酸或唾液酸)。
[0043]“聚酯”是指一类在其主链中含有酯官能团的聚合物。聚酯的实例包括聚乳酸(pla)、聚乙醇酸(pga)和聚己内酯(pcl)。
[0044]“聚合物”是指由结构单元的重复形成的有机大分子。
[0045]“多糖”是指由通过糖苷键结合在一起的长链单糖单元组成的聚合碳水化合物分子；它可以是直链或带支链的。多糖的实例包括壳聚糖和海藻酸盐。
[0046]“多孔”是指在所述材料的表面和内部包含孔的材料。
[0047]“祖细胞”，例如干细胞是指能够通过有丝分裂细胞分裂自我更新并且还能够分化成特化细胞类型的相对未分化的细胞。如本领域公知的，干细胞包括胚胎干细胞，其是全能的，即能够分化成它们所衍生的生物体的所有细胞类型，以及成体干细胞，其是多能的，即能够分化成几乎所有的细胞类型，包括来自所有三个胚层的类型，多能的，即能够分化成密切相关的细胞家族的几种细胞类型，或单能的，即能够分化成仅一种类型的细胞，但通过有丝分裂的自我更新能力区别于非干细胞。
[0048]“蛋白质”是指由一种或多于一种肽或多肽以及任选的非多肽辅因子形成的功能实体。“肽”是指少于50个氨基酸通过肽键连接在一起的氨基酸直链聚合物；“多肽”是指至少50个氨基酸通过肽键连接在一起的直链聚合物。
[0049]“可再吸收”是指在生物环境中逐渐消失的材料。
[0050]“对象”是指哺乳动物，优选人。在本发明的意义上，对象可以是患者，即接受医疗关注、正在接受或已经接受医疗治疗或监测疾病发展的人。
[0051]“三维基质”，也可以称为三维支架或三维框架，是指三维的结构。例如，三维基质可以是凝胶的海绵形式。特别是在本发明中，三维基质为细胞的掺入提供了合适的微环境，使受损组织再生。
[0052]“组织再生”是指在增加组织质量的意义上，依靠待再生的组织的确切类型来再生组织，以及从与待产生的组织或细胞不同类型的组织或细胞开始产生新组织。例如，术语“牙科组织再生”是指由祖细胞如干细胞如牙髓干细胞产生新牙科组织的方法。
[0053]“组织修复”是指组织在损伤或感染后通过结缔组织的产生而愈合。例如，牙齿组织的修复包括使用牙髓覆盖材料，这些材料用于填充在除去蛀牙或由外伤引起的牙齿和牙髓中产生的空间。通过创伤愈合后产生瘢痕组织实现皮肤修复。
[0054]“治疗”是指治疗性治疗，其中目的是预防或减缓(减轻)目标病理状况或病症。需要治疗的人包括那些已经患这种疾病的人以及那些容易患这种疾病的人或那些需要预防这种疾病的人。如果在根据本发明的方法接受治疗量的生物材料后，患者显示出可观察和/或可测量的组织损伤减少或不存在；和/或在一定程度上缓解与组织损伤相关的一种或多于一种症状；以及改善生活质量问题，则对象或哺乳动物被成功地“治疗”了目标疾病。上述用于评估疾病的成功治疗和改善的参数容易通过医生熟悉的常规程序进行测量。
具体实施方式
[0055]
生物材料
[0056]
因此，本发明涉及携带至少一种补体成分、补体活性片段或其组合的生物材料。在一个实施方案中，本发明的生物材料是其中分散有补体成分、补体活性片段或其组合的三维基质。在一个实施方案中，本发明的生物材料是其中分散有包封在载体中的补体成分、补体活性片段或其组合的三维基质。
[0057]
在一个实施方案中，本发明的生物材料包含至少一种补体成分、补体活性片段或其组合。在一个实施方案中，补体成分选自补体成分c1、补体成分c2、补体成分c3、补体成分c4、补体成分c5及其任何组合。在优选实施方案中，所述补体成分为补体成分c5。在一个实施方案中，补体活性片段选自c5a、c3a及其任何组合。在优选的实施方案中，补体活性片段是c5a。补体活性片段c5a是特别有利的，因为它在牙本质-牙髓复合物的再生中起重要作用。在另一个实施方案中，补体活性片段是c3a。
[0058]
在一个实施方案中，本发明的生物材料中存在的补体成分、补体活性片段或其组合被包封在载体中。补体成分和/或补体活性片段的包封能够提供增强的稳定性和延长的递送。
[0059]
包封载体包括颗粒(特别是微粒)、脂质体等，或其组合。颗粒可以是例如微球，例如聚合物微球。
[0060]
聚合物微球可以使用天然存在或合成的聚合物制备，通常是尺寸为0.1μm至500μm的微粒系统。优选地，包封微球的平均直径为1μm至100μm；优选5μm至50μm；优选10μm至30μm；更优选约25μm。根据一个实施方案，包封微球的平均直径为10μm至90μm；优选10μm至80μm、10μm至70μm、10μm至60μm、10μm至50μm或10μm至40μm。根据一个实施方案，包封微球的平均直径为约1μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。
[0061]
在一个实施方案中，包封微球的聚合物选自生物相容性和/或可生物降解的聚酯；优选地选自聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸(pga)、聚羟基丁酸酯(phb)、聚3-羟基戊酸酯、聚丁二酸乙二醇酯(pesu)、聚丁二酸丁二醇酯(pbsu)及其任何组合或共聚物例如聚(乳酸-co-乙醇酸)(plga)。在一个实施方案中，聚合物选自聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸(pga)及其任何组合或共聚物，例如聚(乳酸-co-乙醇酸)(plga)。在具体实施方案中，聚合物微球由plga制成。
[0062]
例如可以使用水/油单乳液法或水/油/水双乳液法进行包封。在优选实施方案中，使用水/油/水双乳液方法进行包封。
[0063]
在一个实施方案中，本发明的生物材料包含基质，优选三维基质。基质可以使细胞黏附并指导体内组织修复或再生的过程。
[0064]
在一个实施方案中，基质由至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成。在一个实施方案中，生物相容性和/或可再吸收的聚合物选自多糖、蛋白质及其任何组合或共聚物；优选地选自胶原、壳聚糖、海藻酸盐及其任何组合或共聚物。在一个实施方案中，基质包括胶原。在一个实施方案中，基质由胶原组成。在另一个实施方案中，基质由胶原和壳聚糖的混合物或胶原和海藻酸盐的混合物制成。在一个实施方案中，生物相容性和/或可再吸收的聚合物是至少一种内源性聚合物和至少一种外源性聚合物的混合物。在一个实施方案
中，生物相容性和/或可再吸收的聚合物不是或不包含由engelbreth-holm-swarm(ehs)小鼠肉瘤细胞分泌的任何蛋白质，优选地，生物相容性和/或可再吸收的聚合物不是或不包含由康宁生命科学公司制造的产品
[0065]
在一个实施方案中，三维基质是多孔的。
[0066]
在一个实施方案中，三维基质是水凝胶。优选地，三维基质是多孔水凝胶。在一个实施方案中，三维基质由水凝胶产生，优选由干燥或冷冻干燥水凝胶产生。
[0067]
因此，本发明提供了一种生物材料，其包含：
[0068]-由至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成的三维基质，和
[0069]-包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒；所述颗粒分散在三维基质中。
[0070]
在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体成分、补体活性片段或其组合的聚合物微球；所述微球分散在三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体活性片段c5a的聚合物微球；所述微球分散在三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体成分、补体活性片段或其组合的plga微球；所述微球分散在三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体成分、补体活性片段或其组合的聚合物微球；所述聚合物微球分散在胶原三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体活性片段c5a的plga微球；所述微球分散在三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体成分、补体活性片段或其组合的plga微球；所述微球分散在胶原三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体活性片段c5a的聚合物微球；所述微球分散在胶原三维基质中。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含包封补体活性片段c5a的plga微球；所述微球分散在胶原三维基质中。
[0071]
在一个实施方案中，包封颗粒随机分散在三维基质中。在一个实施方案中，包封颗粒均匀地分散在三维基质中。在一个实施方案中，包封颗粒随机分散在三维基质的孔中。在一个实施方案中，包封颗粒均匀地分散在三维基质的孔中。
[0072]
在具体实施方案中，本发明的生物材料是两相的。这意味着生物材料包含：
[0073]-如上所述的第一相，即由至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成的三维基质，其中分散有包封补体成分、补体活性片段或其组合的颗粒；以及
[0074]-不含补体成分或补体活性片段的第二相，所述第二相例如是由至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成的三维基质；
[0075]
所述第一相和第二相接触在一起。
[0076]
在一个实施方案中，第二相是由至少一种不含补体成分或补体活性片段，特别是不含包封补体成分或补体活性片段的颗粒的生物相容性和/或可再吸收的聚合物制成的三维基质。在优选的实施方案中，第二相基质的聚合物与用于形成负载补体成分/补体活性片段的相的基质的聚合物相同。
[0077]
有利地，在两相中任一相，优选在第一相(负载相)中添加染料，以能够识别两相生物材料的负载部分。例如，染料可以是专利蓝v染料。染料的存在对于正确定位待治疗的病变中的材料很重要。
[0078]
两相生物材料如图1所示。示出了一种两相生物材料的圆柱形样品(1)，其包括负载补体成分/补体活性片段的基质的第一相(2)和未负载基质的第二相(3)，两相接触在一起。
[0079]
优选地，两相生物材料的两相由相同的聚合物制成，因此在基质中存在连续性。
[0080]
在一个实施方案中，第一相(负载相)的体积与第二相(未负载相)的体积之比为0.01至1；优选0.05至0.5；优选0.1至0.25。根据一个实施方案，第一相(负载相)的体积与第二相(未负载相)的体积之比为0.01至0.9；优选0.01至0.8；0.01至0.7；0.01至0.6；0.01至0.5；0.01至0.4或0.01至0.3。根据一个实施方案，第一相(负载相)的体积与第二相(未负载相)的体积之比为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08或0.09。
[0081]
在用于牙齿修复的两相圆柱形生物材料的情况下，第一相(负载相)的厚度与第二相(未负载相)的厚度之比为0.01至1，优选0.03至0.7；优选0.07至0.5。根据一个实施方案，第一相(负载相)的厚度与第二相(未负载相)的厚度之比为0.01至0.9；优选0.01至0.8；0.01至0.7；0.01至0.6或0.01至0.5。根据一个实施方案中，第一相(负载相)的厚度与第二相(未负载相)的厚度之比为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7。
[0082]
在一个实施方案中，本发明的生物材料还包含额外的生物活性剂。生物活性剂可以是例如生物材料，例如细胞因子、生长因子、肽、抗体、抗生素或分化因子。生物活性剂还可以包括治疗剂。
[0083]
在一个实施方案中，本发明的生物材料不包含细胞，特别是不包含干细胞。在一个替代实施方案中，本发明的生物材料包含细胞，特别是干细胞。
[0084]
在一个实施方案中，生物材料的补体成分和/或补体活性片段的负载率为生物材料总重量的0.001％至0.1％；优选0.005％至0.05％；更优选约0.01％。根据一个实施方案，生物材料的补体成分和/或补体活性片段的负载率为0.001％至0.1％；优选0.001％至0.09％；0.001％至0.08％；0.001％至0.07％；0.001％至0.06％；0.001％至0.05％；0.001％至0.04％；0.001％至0.03％；0.001％至0.02％或0.001％至0.01％。
[0085]
在一个实施方案中，本发明的生物材料具有适合待修复损伤的尺寸和体积。在一个实施方案中，本发明的生物材料优选具有0.01cm3至160cm3的体积。在牙科组织再生的情况下，本发明的生物材料优选具有10mm3至100mm3、优选15mm3至50mm3、优选30mm3至40mm3的体积。
[0086]
在一个实施方案中，本发明的生物材料具有选自圆柱体、平行六面体、立方体的形状。在一个实施方案中，本发明的生物材料具有适合填充牙齿的天然空腔或人造空腔的形状。
[0087]
在一个实施方案中，本发明的生物材料是多孔的。这种多孔结构为再生组织的细胞迁移、黏附和生长提供了空间。在一个实施方案中，生物材料具有直径为1μm至1500μm，优选100μm至500μm，优选200μm至400μm的孔。根据一个实施方案，生物材料具有直径为1μm至1400μm；优选1μm至1300μm；1μm至1200μm；1μm至1100μm；1μm至1000μm；1μm至900μm；1μm至800μm；1μm至700μm；1μm至600μm；1μm至500μm；或1μm至400μm的孔。根据一个实施方案，生物材料具有直径为约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390或400μm的孔。
[0088]
在一个实施方案中，本发明的生物材料例如通过注射、插入或植入靶组织递送。
[0089]
在一些实施方案中，生物材料通过注射被递送至对象牙齿的天然空腔或人造空腔，特别是当生物材料处于水凝胶形式时。
[0090]
生物材料的制造
[0091]
本发明的生物材料的制造可以通过技术人员已知的方法进行。本发明还提供了制造所述生物材料的方法。
[0092]
在一个实施方案中，本发明的生物材料的制造包括使包封补体成分和/或补体活性片段的颗粒与至少一种生物相容性和/或可再吸收的聚合物接触，以形成由所述聚合物制成的三维基质，其中分散有颗粒。
[0093]
在一个实施方案中，采用水/油单乳液法或水/油/水双乳液法包封补体成分、补体活性片段或其组合。在优选实施方案中，使用水/油/水双乳液法进行包封。
[0094]
在一个实施方案中，通过水/油/水双乳液法进行聚合物微球形式的包封包括以下步骤：
[0095]
a)准备：
[0096]-一种包含包封聚合物和有机溶剂的油相；以及
[0097]-包含补体成分、补体活性片段或其组合和水的第一水相；
[0098]
b)乳化油相和第一水相，以形成油包水乳液；
[0099]
c)将步骤b)中获得的油包水乳液与第二水相乳化，形成水包油包水双乳液；
[0100]
d)采用水中萃取法除去有机溶剂；
[0101]
e)回收形成的聚合物微球。
[0102]
在一个实施方案中，有机溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜二甲基亚砜(dmso)和丙酮；优选地，有机溶剂选自二氯甲烷和二甲基亚砜(dmso)；更优选二氯甲烷。
[0103]
在一个实施方案中，包含补体成分和/或补体活性片段的第一水相还包含牛血清白蛋白(bsa)。bsa的存在具有避免补体成分和/或补体活性片段吸附到包封过程中使用的容器壁的优点。此外，bsa还能在包封过程中稳定乳剂。
[0104]
在一个实施方案中，第二水相包含表面活性剂，例如聚乙烯醇(pva)、聚氧乙烯(100)硬脂基醚、聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)平均mn约2900、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、司盘20、司盘60、司盘80。在一个实施方案中，第二水相包含选自pva和司盘20的表面活性剂；优选pva。有利地，第二水相中pva的量为第二水相总体积(重量/体积)的0.01重量％至0.5重量％；优选0.05％至0.15％重量/体积；更优选约0.1％重量/体积。
[0105]
在一个实施方案中，通过剪切均质化、超声、微流化进行乳化；优选通过完全均质化；优选地，使用高速混合装置进行乳化。
[0106]
在一个实施方案中，聚合物微球的制备在室温下进行。
[0107]
在一个实施方案中，除去有机溶剂的步骤d)是通过将双乳液倒入大量水中进行的；优选在搅拌下进行。
[0108]
在一个实施方案中，回收形成的聚合物微球的步骤e)通过离心和/或用水洗涤来进行。
[0109]
有利地，分离的聚合物微球被冻干并储存在-20℃下。
[0110]
在一个实施方案中，本发明的生物材料的制造包括使包封补体成分、补体活性片
段或其组合的颗粒与用生物相容性和/或可再吸收的聚合物形成的水凝胶接触。
[0111]
在一个实施方案中，由生物相容性和/或可再吸收聚合物形成的水凝胶通过将聚合物溶解在水溶液中然后均质化来制备。在一个实施方案中，水凝胶中聚合物的量为水凝胶总重量的0.1重量％至5重量％(重量/重量)；优选0.5重量％至2重量％；更优选1重量％至1.5重量％。在一个实施方案中，聚合物溶解形成水凝胶的水溶液可以是水(优选纯净水)或酸性水溶液如0.25％重量/重量；乙酸水溶液。优选地，当聚合物为胶原或海藻酸盐时，溶解在水中进行；当聚合物为壳聚糖时，在酸性水溶液中进行溶解。在一个实施方案中，均质化通过混合进行，优选以100rpm至20000rpm，优选300rpm至15000rpm的速率进行。在一个实施方案中，均质化进行的时间段为5分钟至2小时，优选10分钟至1小时。特别是，胶原水凝胶的均质化以14000rpm的速度进行约10分钟；壳聚糖或海藻酸盐水凝胶的均质化以300rpm的速度进行约1小时。在基质由聚合物混合物(例如壳聚糖/胶原或海藻酸盐/胶原)制备的情况下，每种凝胶单独制备然后混合；优选在负载包封补体活性片段和/或补体组分的颗粒之前以300rpm混合30分钟。
[0112]
通过将颗粒与水凝胶混合，用包封补体活性片段和/或补体组分的颗粒负载生物相容性和/或可吸收聚合物的水凝胶；优选通过以500rpm的磁力搅拌，优选约30分钟。在一个实施方案中，包封颗粒的负载量为每毫升凝胶含有1mg至50mg颗粒；优选每毫升凝胶中含有2mg到30mg颗粒，更优选每毫升凝胶中含有4mg颗粒或每毫升凝胶中含有30mg颗粒。
[0113]
负载的水凝胶可以直接使用，也可以进行进一步的除水步骤。
[0114]
例如，除水能够以海绵的形式提供生物材料。在一个实施方案中，可以通过冷冻干燥来完成水的除去。优选地，水凝胶首先分布在所需的形状的模具中，然后冷冻干燥。模具的设计应适应预期海绵的尺寸要求。模具可以通过3d打印制造。
[0115]
在两相生物材料制备的情况下，如上所述制备负载有颗粒的第一水凝胶，优选颗粒浓度为每毫升凝胶30mg微球。也以相同方式制备不含包封补体成分和/或补体活性片段的颗粒的第二水凝胶。有利地，在两种水凝胶中的一种中添加一种染料，以便能够识别两相生物材料的负载部分。例如，染料可以是专利蓝v染料。染料的存在对于正确定位待治疗病变中的材料很重要。然后，将第一水凝胶(负载凝胶)分配在模具中以部分填充所述模具，然后分配第二水凝胶(未负载凝胶)以完成模具填充。然后进行冷冻干燥，得到两相海绵。
[0116]
用途
[0117]
本发明的生物材料可用于组织修复和再生，尤其是关于牙科组织或骨组织，或其他组织如神经组织和皮肤组织。因此，在一个实施方案中，提供了根据本发明的用于组织修复和/或再生的生物材料。因此，本发明提供了一种组织修复和/或再生的方法，包括使待修复和/或再生的组织与本发明的生物材料接触。“接触组织”旨在包括生物材料与待修复和/或再生的组织之间的任何形式的相互作用(例如直接或间接相互作用)。组织与生物材料的接触可以在体内或体外进行。在某些实施方案中，组织与生物材料在体外接触并随后以离体施用方法转移到对象体内。例如，可以通过将生物材料置于组织中，或通过将生物材料注射到与组织相邻的另一个区域中来使组织与生物材料在体内接触，从而使组织内的细胞将朝向生物材料行进。
[0118]
在一个实施方案中，牙科组织选自牙髓、牙本质、牙周组织和牙龈组织。在一个实施方案中，根据本发明的生物材料用于修复和/或再生牙髓、牙本质、牙周和/或牙龈组织。
[0119]
在一个实施方案中，通过将生物材料放入待处理牙齿的天然空腔或人造空腔中，使牙科组织与本发明的生物材料接触。
[0120]
本发明的生物材料在牙本质-牙髓再生中特别有用。
[0121]
对于这种用途，生物材料可以以水凝胶或海绵的形式使用。使用如上所述的两相生物材料，优选两相海绵，特别有利于牙本质-牙髓再生，因为补体活性片段扩散提供了用于引导干细胞迁移到需要/必需的牙本质再生的部位的梯度。
[0122]
特别是，本发明的生物材料可用于直接盖髓或用于牙髓切断术。使用本发明的生物材料能够获得牙髓体积的完全再生。与以前在此类处理中使用的材料所观察到的相反，它能够避免纸浆体积的显著减少。这尤其有利，因为牙髓体积的减少导致牙髓-牙本质再生能力的降低。在继发龋/牙齿断裂的情况下尤其如此。
[0123]
图3示出了直接盖髓或牙髓切断术的牙本质-牙髓再生机制，比较了两相形式下本发明生物材料的用途(右侧(b))和经典直接盖髓材料的用途(左侧(a))。图3(1)示出了一颗有龋损的受损牙齿，其中一部分牙本质和牙髓被移除，以便进行直接盖髓或牙髓切断术。图3(2)示出了填充空腔的材料的放置，分别是经典的直接盖髓材料(a)或本发明的两相生物材料(b)，负载相位于上部，即负载相位于牙本质的上部，而未负载相从牙本质的底部延伸至牙髓。图3(3)示出了牙髓干细胞的迁移情况。使用经典的直接盖髓材料，细胞在其界面迁移，而使用本发明的两相生物材料、细胞定殖生物材料，特别是定殖未负载相直至负载相。结果是，在经典直接的情况下盖髓材料，牙本质的再生发生在与填充材料的界面，导致牙髓体积减少，如图3(4)-(a)所示。相反，采用本发明的两相生物材料，牙髓和牙本质一样可以再生，牙本质的再生接近生理牙本质水平，导致牙髓体积的完全再生，如图3(4)-(b)。
[0124]
因此本发明提供了一种在所需对象中治疗牙周病的方法，即牙髓感染。该方法包括使牙髓与本发明的生物材料接触。牙周病通常从简单的牙龈炎症到会导致对支撑牙齿的软组织和骨骼造成重大损害的严重的疾病。
[0125]
本发明因此提供了一种治疗所需的对象的牙髓感染的方法。该方法包括使牙髓与本发明的生物材料接触。牙齿感染可能由牙髓炎引起，即牙髓组织的炎症，这种炎症始于牙齿表面的龋齿。牙齿感染可能导致牙髓组织暴露，并最终导致牙本质和/或牙髓的腐烂和/或损失，这通常通过牙髓手术，例如根管治疗来治疗。
[0126]
需要本文所述的治疗方法的对象可以是患有、被诊断患有、怀疑患有或有发生与牙科组织相关的损伤、疾病或病症的风险的对象，例如牙外伤、牙髓炎或龋齿。例如，需要本文所述的治疗方法的对象可以是患有、诊断为患有、怀疑患有或有风险发展为可逆性牙髓炎或通常需要连同患病牙髓一起除去的健康牙髓的其他疾病或病症的对象。通常通过与所讨论的疾病或状况一致的病史和体格检查来评估是否需要治疗。可以通过本文所述方法治疗的各种病症的诊断在本领域技术范围内。对象可以是动物对象，包括哺乳动物，优选人类对象。
[0127]
在一个实施方案中，本发明的生物材料用于对所需的哺乳动物牙齿进行牙科、牙髓或根管手术。该方法可以包括暴露牙髓腔和/或根管中的创伤或患病牙髓组织；用本发明的生物材料盖髓或填充牙髓腔和/或根管的至少一部分。在一个实施方案中，生物材料在盖髓或填充期间不包括活细胞。在另一个实施方案中，生物材料包括活细胞。在一个实施方案中，该方法还包括从牙齿上除去创伤或患病的牙髓组织，以产生基本上没有创伤或患病组
织的牙髓腔和/或根管。
[0128]
当用于直接盖髓或用于牙髓切断术时，本发明的材料被放置在要再生的空腔中，然后可以被密封材料覆盖。密封材料可以是例如基于硅酸三钙的水泥，例如biodentine(septodont)、矿物三氧化物凝聚体(mta)。当用于牙周引导组织再生程序时，本发明的材料可以被膜覆盖。
[0129]
本发明的生物材料还可用于骨修复和/或再生，并可应用于骨科和种植学。
[0130]
在一个实施方案中，根据本发明的生物材料因此用于修复和/或再生骨组织。
[0131]
在这种类型的用途中，尤其优选使用单相生物材料，因为需要干细胞对生物材料进行同质定殖以再生缺失的组织。
[0132]
使用本发明的单相生物材料的骨再生机制如图4所示。图4(1)示出了有骨缺损的骨组织。图4(2)示出了填充空腔的本发明的单相生物材料的位置。图4(3)示出了在生物材料上定殖的骨祖细胞的迁移，从而能够再生骨组织，如图4(4)所示。
[0133]
本发明的生物材料也可用于神经组织修复和/或再生。在一个实施方案中，根据本发明的生物材料因此用于修复和/或再生神经组织。神经组织包括神经元和神经胶质细胞(包括星形胶质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞、少突胶质细胞、卫星细胞和施万细胞)。
[0134]
本发明的生物材料也可以用于皮肤修复和/或再生。在一个实施方案中，根据本发明的生物材料因此用于修复和/或再生皮肤。皮肤组织包括表皮、真皮和皮下层。
[0135]
在这样的应用中，生物材料优选以固体框架的形式使用。特别地，本发明的生物材料可以被插入到固体支架中，例如插入由磷酸三钙或羟基磷灰石或部分可吸收的材料制成的可吸收组织替代(rtr)颗粒制成的固体支架中，包括硅酸盐并具有开孔孔隙度。这呈现出允许其被干细胞定殖的优势。
[0136]
在一个实施方案中，本发明的生物材料包含c5a作为补体活性片段。在这种情况下，生物材料能够促进牙髓祖细胞的募集。因此，本发明提供了一种募集牙髓祖细胞的方法，包括使牙髓与本发明的生物材料接触。
[0137]
在一个实施方案中，本发明的生物材料适合作为细胞培养基质。这对于骨再生特别有利。
附图说明
[0138]
图1是本发明的圆柱形两相生物材料的透视图。
[0139]
图2是示出了根据本发明的单相(a)和两相(b)负载c5a-微球的胶原基质以及示出了分散在基质中的微球的放大图(c)的一系列照片。
[0140]
图3是表示直接盖髓或牙髓切断术中的牙本质-牙髓再生过程的一系列示意图。方案(1)至(4)的左侧(a)表示经典的直接盖髓或牙髓切断术，而右侧(b)表示使用本发明的生物材料在两相形式下的直接盖髓或牙髓切断术。方案(1)表示有龋损的受损牙齿，其中部分牙本质和牙髓被除去。方案(2)示出了填充牙本质和牙髓的材料的位置：(a)经典的直接盖髓材料和(b)本发明的两相生物材料，负载相在上部。方案(3)示出了牙髓干细胞的迁移情况。方案(4)示出了直接盖髓或牙髓切断术后牙齿的最终状态。
[0141]
图4是表示了骨再生过程的一系列示意图。图4(1)示出了有骨缺损的骨组织。图4(2)示出了本发明的单相生物材料填充空腔的位置。图4(3)示出了在生物材料上定殖的骨
祖细胞的迁移，其能够再生如图4(4)所示的骨组织。
[0142]
图5是一组3张照片(a)、(b)和(c)，示出了包封c5a补体活性片段的plga微球。所示刻度尺为10.00μm。
[0143]
图6是表示从放置在dmem中的包封c5a的微球释放c5a的累积百分比的曲线图。
[0144]
图7a和图7b为显示不同材料的牙髓成纤维细胞存活力随时间变化的图表。对照是dmem培养基。对胶原海绵进行测试，无论是未负载的胶原海绵还是负载c5a包封微球的胶原海绵，单相或两相。图7a记录了直接评估的结果，而图7b记录了间接评估的结果。
[0145]
图8是表示在本发明的生物材料存在下牙髓成纤维细胞随时间迁移的图。
[0146]
图9是表示c5a从负载有包封在微球中的c5a的胶原海绵随时间释放的图。
[0147]
图10是表示c5a从负载游离c5a的胶原海绵中随时间释放的图。
[0148]
实施例
[0149]
本发明还通过以下实施例说明。
[0150]
缩写
[0151]
bsa:牛血清白蛋白，
[0152]
dcm:二氯甲烷，
[0153]
dmso:二甲基亚砜，
[0154]
h:小时，
[0155]
min:分钟，
[0156]
plga:聚(乳酸-co-乙醇酸)，
[0157]
pva:聚乙烯醇，
[0158]
rpm：转每分。
[0159]
材料
[0160]
c5a(r&d系统，法国)；酶联免疫试剂盒c5a(r&d系统，法国)。dmem(dulbecco改良培养基)及所有细胞培养材料和试剂：fischer scientific(paa实验室)
–
法国。磁珠：dynal biotech，奥斯陆
–
挪威。一级抗体：r&d系统，里尔-法国。胶原(datascope提供的纤维状胶原，getinge集团，美国)，壳聚糖(sigma)，海藻酸盐(septodont，法国)，plga(法国pcas提供的dlg 50-2a)，pva(默克，德国)。
[0161]
i.包封补体活性片段的颗粒
[0162]
i.1.包封c5a的聚合物微球的制造
[0163]
plga微球通过水/油/水(w/o/w)双乳液和溶剂萃取/蒸发方法制备，该方法改编自kalaji等人先前描述的方法(kalaji n等人,j.biomed.nanotech.,2010,6(2),pp.1-11)。简而言之，将plga溶解在dcm中形成油相。然后使用高速混合设备(t25 basic,werke/germany)将该油相与含有c5a的纯化水的内部水相总是与bsa一起乳化以形成w/o乳液。所有的准备工作都在室温下进行。将所得乳液加入到50ml含有0.1％(w/v)pva的外部水溶液中，并用乳化以产生双w/o/w乳液。然后在磁力搅拌下将双乳液倒入大量水(100ml)中2小时以除去有机溶剂。最后，将得到的微球离心，用50ml去离子水洗涤两次，冻干并储存在-20℃下。
[0164]
i.2.包封c5a的聚合物微球的表征
[0165]
用keyence vhx-5000数字显微镜分析微球形态。由于其简便的软件可以在很短的
时间内测量微球尺寸，因此该设备可以自动重建清晰而深刻的图像。
[0166]
通过实施例i.1中所述的w/o/w双乳法和溶剂萃取/蒸发法所获得的颗粒都以微球的形式存在。微球的外表面具有粗糙的外观，可能反映在它们的孔隙率上，如图5所示。微球的平均粒径为25.51( 9.83)μm。
[0167]
i.3.包封率
[0168]
包封率测试旨在确定颗粒中存在的补体成分和/或补体活性片段(例如c5a)的量。这对于调整生物材料中补体成分和/或补体活性片段的量特别重要。
[0169]
重要的是包封率高，以限制生物材料中所需的颗粒量，以避免存在大量可能有毒的plga。
[0170]
用两种方法检测包封率：
[0171]-方法1(直接测定)包括在提取后测量包埋在微球中的补体活性片段的量。提取方案包括将约5mg微球溶解在1ml dmso中，然后加入9ml dmem(dulbecco改良培养基)，并通过elisa分析捕获在微球中的补体活性片段的量(在下文第iii.2节中描述)。
[0172]-方法2(间接测定)包括使用elisa定量测定在微球制备结束时(在溶剂蒸发后，包括冲洗水之后)含水上清液中补体活性片段的损失量。将损失量与包封过程中涉及的补体活性片段的初始量进行比较以确定包封量。
[0173]
测定实施例i.1中获得的包封c5a的微球的包封率。直接和间接两种方法是一致的。包封率为70％至79％，平均值为74.79( 3.72)％。
[0174]
i.4.释放测定
[0175]
释放测定旨在确定可从包封微球中释放的补体成分和/或补体活性片段(例如c5a)的量。
[0176]
将包封c5a的聚合微球置于37℃，5％co2的固定体积的dmem中。在第1天、第7天、第14天、第21天和第31天，取出培养基，在-20℃下保存，并添加新鲜培养基。在每个时间点，使用elisa法(第iii.2节描述)测定释放c5a的剂量。
[0177]
分析了c5a从实施例i.1中获得的包封c5a的微球中的释放。如图6所示，在释放测定的第一天，观察到c5a有重要的突然释放。在此突然释放期间，微球中53％的c5a被释放。在初始突然释放后是c5a在21天内的缓释，其中91％的包封c5a已被释放。
[0178]
ii.本发明生物材料：制造与表征
[0179]
ii.1.无负载的基质的制造
[0180]
采用冷冻干燥法制备多孔固体基质。首先，通过将选定的生物相容性和/或可吸收的聚合物(例如胶原、壳聚糖或海藻酸盐—见下表1)溶解在水溶液中并均质化来制备水凝胶。然后将凝胶分布在模具中以满足尺寸要求(直径3mm，高5mm)。然后将凝胶在-40℃下冷冻12小时并使用以下参数冷冻干燥：在-40℃、12毫巴、24小时期间升华，以提供海绵形式的基质。
[0181]
表1：用于基质制备的凝胶的组成。
[0182][0183]
在混合基质的情况下(例如壳聚糖1％/胶原1％或海藻酸盐1％/胶原1％)，每个凝胶单独制备，然后在分配前以300rpm混合30分钟。
[0184]
ii.2.制造负载有c5a微球的基质
[0185]
如实施例ii.1中所述制备负载微球的多孔固体基质，进一步的步骤是在分配到模具中之前用包封实施例i.1的c5a的聚合物微球(4mg微球/ml凝胶)负载凝胶。以转速500rpm磁力搅拌30分钟，将凝胶分布在模具中，使用前述参数冷冻和冻干，以提供海绵形式的负载基质。
[0186]
在两相多孔固体基质制备的情况下(即包含第一相微球负载的基质和第二相无负载的基质的材料)，微球负载凝胶的制备方法相同，微球浓度为每毫升凝胶中加入30mg微球，并加入0.5mg专利蓝v染料。先将微球负载的凝胶分布在模具内，再将未负载的凝胶分布在模具内，完成模具的充填。然后冷冻干燥可以获得两相海绵。在一个实施例中，将10μl的负载凝胶分布到模具中，然后将60μl的无负载的凝胶分布到模具中。
[0187]
为了便于比较，还制备了负载有游离c5a的基质。如实施例ii.1中所述制备负载有游离c5a的胶原海绵，进一步的步骤是在分配到模具中之前用游离c5a(每毫升凝胶4μg c5a)负载凝胶。在以500rpm磁力搅拌30分钟后，为了使c5a在胶原凝胶中均匀分布，将凝胶分布在模具中，使用前面描述的参数冷冻和冻干，以提供游离的c5a负载胶原海绵。
[0188]
ii.3.c5a在三维基质中的负载率
[0189]
通过测定生物材料中的c5a负载率可以知道该生物材料中c5a的量。
[0190]
对于负载有游离c5a的基质，使用间接方法来确定c5a负载率：使用elisa测定法测量冷冻干燥期间和用于运输的箔中的c5a损失。在制造方法中损失的c5a量是从参与实验的c5a量(4μg/ml凝胶)推导出来的，从而能够计算负载率。
[0191]
结果。对于实施例ii.2中获得的负载有游离c5a的支架，测量到1ml胶原凝胶损失了1μg的c5a。因此，材料在c5a中的负载率为生物材料制造方法中使用的c5a总重量的75％。
[0192]
对于微球负载基质，还使用间接方法来确定c5a负载率：在这种情况下，微球被困在胶原基质中，在运输或冷冻干燥过程中不会损失。通过计算微球的包封率，可以通过凝胶中微球的浓度来计算基质中负载c5a的量。
[0193]
结果。对于微球负载的基质，微球的包封率为75％(平均)，如实施例i.3所示。微球分散在凝胶中，在这一步骤中c5a没有损失。因此，材料中c5a的负载率为用于生物材料制造方法中c5a总重量的100％，认为包封步骤也为75％。
[0194]
ii.4数字显微镜下生物材料的形态表征
[0195]
用keyence vhx-5000数字显微镜分析多孔固体基质的形貌。
[0196]
对实施例ii.2中获得的单相和两相微球负载基质进行了分析，负载基质的形态见图2。特别地，图2(a)示出了如实施例ii.2中所述获得的单相负载微球的胶原海绵；以及海
绵结构的放大倍数(100μm)。图2(b)示出了如实施例ii.2中获得的负载两相微球的胶原海绵。虚线示出了底部的负载相和顶部的未负载相之间的界限。右侧放大图中的三角形(比例为100μm)指向一些包封的微球。图2(c)是分散在胶原海绵基质中的包封微球的进一步放大(20.0μm)。
[0197]
ii.5.吸水测试-吸收因子
[0198]
吸水测试的目的是模拟血液的吸收，评估多孔网络的吸水情况。该测试的灵感来自于hui-min wang对胶原/透明质酸/明胶海绵的研究(hui-min wang等人,plos one,2013,8(6),e56330)。
[0199]
更具体地，干材料在注入液体烧杯之前要称重。一旦流体自发地渗透到基质中，就会通过挤压材料除去水泡。这一步很关键，因为气泡构成了未使用的体积，并且会稍微影响进水量。然后用针镊子将材料从流体中取出。在此步骤中，不得损坏或挤压材料。允许水从材料中排出，无需挤压。一旦不再形成液滴，就将湿材料称重。
[0200]
吸收系数使用以下公式计算：
[0201][0202]
结果
[0203]
吸收因子可以比较不同生物材料的吸水率。生物材料的孔隙率影响使用上述公式计算的吸收因子。由1.5％的胶原、1％的胶原-壳聚糖和1％的胶原-海藻酸盐组成的生物材料具有相似的吸收因子。
[0204]
如实施例ii.1中所述获得的未负载海绵的吸收系数如上文所述确定(表2)：
[0205]
表2未负载的海绵的吸收系数。
[0206]
三维基质吸收因子胶原1.5％33胶原1％-壳聚糖1％35胶原1％-海藻酸盐1％33
[0207]
这些结果表明，所有测试海绵具有相似的吸水率。这很重要，因为海绵需要吸收血液以允许再生所需的细胞迁移。
[0208]
ii.6.降解试验
[0209]
降解测试的灵感来自davidenko等人(davidenko等人，acta biomaterialia,2015,25,pp.131-142)，旨在确定材料在37℃的水中的降解情况。
[0210]
对于每种测试的材料，将4个已知质量的海绵置于37℃的20ml水的烧杯中，以通过量化其质量损失来监测它们的溶解与孵育时间的函数关系。在每次监测t
x
时，从溶出介质中取出样品，冷冻干燥并称重。质量损失计算如下：
[0211][0212]
测试的总持续时间取决于烧杯中的样品状态，根据样品是否仍然存在或已经完全降解。
[0213]
结果
[0214]
测试如实施例ii.1中所述获得的未负载的海绵。胶原海绵的降解速度较慢，在降
解试验后显示，14天后，仅33％的支架损失。混合海绵(胶原-壳聚糖或胶原-海藻酸盐)采用胶原的降解率。
[0215]
第三部分：生物评价
[0216]
iii.1.细胞制备与表征
[0217]
臼齿的收集。根据法国立法(包括知情同意和机构审查委员会对所用协议的批准)获得因正畸原因和龋齿新鲜拔除的人类未成熟第三臼齿。
[0218]
原代牙髓细胞培养。采用外植体生长法从三分之二根形成阶段的未成熟第三臼齿制备人牙髓细胞。简单地说，就是从牙齿中取出牙髓。然后机械切割牙髓形成小的牙髓外植体。每个外植体都放置在培养皿中的少量dmem中。24小时后，培养皿中充满培养基。收集超出外植体的细胞，构成牙髓细胞群。
[0219]
磁性细胞分选。根据制造商的方案(dynal，奥斯陆，挪威)，用小鼠抗人stro-1igm和免疫磁珠直接从第1代至5代的原代牙髓细胞培养物中分选牙髓祖细胞。简单地说，磁珠上涂有小鼠抗人stro-1igm。然后将细胞添加到制备好的珠子上。一旦stro-1抗原与其特异性抗体固定，细胞群就会使用珠子分离。非固定群体或负向部分是牙髓成纤维细胞群。固定群体或正向部分是一种牙髓干细胞群。在后一种群体中，一旦细胞黏附到培养瓶上，就需要清洗珠子。
[0220]
牙髓细胞特征。这个测试是用来确认分选磁细胞后存在哪些细胞。stro-1分选和未分选的牙髓细胞在8孔玻璃培养室中生长，融合度高达70％。在这2种培养物中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗细胞，并在15分钟内用4％多聚甲醛在4℃固定1小时。将未分选的牙髓细胞与抗成纤维细胞表面蛋白(fsp；2μg/ml)的一抗孵育1小时，将stro-1分选的细胞与抗stro-1(5μg/ml)和cd44(2.5微克/毫升)，cd90(2.5μg/ml)、cd105(2.5μg/ml)、cd146(2.5μg/ml)或cd166(2.5μg/ml)的一抗孵育。对照组与相应的一抗同种型孵育。洗涤后，将细胞与各自的二抗孵育45分钟，alexa fluor 488或alexa fluor 594(2μg/ml)，以及用于荧光显微镜检测的dapi(1μg/ml)。
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iii.2elisa法测定c5a浓度
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根据制造商的说明(r&d系统，里尔，法国)通过酶联免疫吸附试验(elisa)确定c5a浓度。简要地，用抗c5a蛋白的一抗包被96孔板在4℃过夜。在封闭溶液1小时后，将样品置于孔中并在室温下孵育2小时。然后在室温下加入抗c5a的生物素化二抗2小时。然后将与hrp酶偶联的链霉亲和素添加到孔中。这一发现通过添加由hrp酶转化为蓝色底物的tmb来实现。在650nm波长读取板。
[0223]
iii.3毒性测定
[0224]
使用牙髓成纤维细胞(磁选后牙髓细胞的stro-1阴性部分)在体外测定生物材料的毒性。
[0225]
将细胞接种在96孔板中并培养至近汇合。通过将样品在dmem中孵24小时来制备含有生物材料洗脱液的培养基。将成纤维细胞与条件培养基一起孵育24小时和72小时(间接方法)。生物材料也直接与细胞接触(直接方法)。在每个时间点进行mtt测试。将mtt以1mg/ml的浓度置于细胞上并孵育2小时，形成甲臜晶体。孵育2小时后，使用dmso溶解晶体。在550nm波长处读取板。
[0226]
结果。已经评估了本发明的不同材料的细胞活力。对照是单独的dmem培养基，细胞
活力为100％。采用mtt试验评价包封微球的毒性。结果表明，包封微球(无论是负载c5a还是未负载)对细胞没有毒性。
[0227]
未负载的胶原基质和单相或两相c5a-负载包封微球的胶原海绵的毒性也通过mtt测试直接和间接地进行了评估，分别如图7a和7b的图表所示。结果表明，负载或未负载的胶原基质对牙髓细胞没有毒性。
[0228]
壳聚糖、胶原-壳聚糖和胶原-海藻酸盐基质，负载和未负载的，也已通过间接毒性试验进行了测试。结果显示这些基质没有毒性。
[0229]
iii.4.迁移测定
[0230]
为了评估生物材料释放的c5a的活性，进行了迁移实验。事实上，c5a蛋白因其在动员免疫细胞和干细胞方面的作用而闻名，而这一功能对于牙本质-牙髓复合体的再生是最重要的。
[0231]
迁移在24孔板中进行分析，该板配备了带有8μm孔径膜的transwell小室。将stro-1分选细胞(104个细胞/孔)重新悬浮在无血清mem中，在上腔播种。下面的腔室负载了条件培养基。24小时后，用棉签擦掉插入膜上侧的非迁移性stro-1分选细胞，用乙醇固定同一膜下表面的stro-1分选细胞，并用苏木精染色。在光学显微镜(
×
200)下，在5个随机场中统计迁移到膜下表面的stro-1分选细胞的数量。
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结果。在本实验的对照条件下(dmem培养基)，只有少数牙髓干细胞迁移。如图8所示，在第7天之前，本发明生物材料释放的c5a的存在显著增加了牙髓干细胞的迁移。
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iii.5.ca5释放测定
[0234]
将包封的c5a负载基质置于37℃的固定体积的dmem中，5％的co2。在第1天、第7天、第14天、第21天和第31天，取出培养基，在-20℃下保存，并添加新鲜培养基。在每个时间点，使用elisa法(第iii.2节描述)测定释放c5a的剂量。
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结果。如图9所示，c5a包封微球加入胶原基质后，在试验条件下，c5a可以缓慢而可控的释放。在第一天，观察到一个重要的c5a突然释放。在此突然释放期间，生物材料中42％的c5a被释放。在初始突然释放后，c5a的缓释和控释一直持续到31天。以支架中c5a的百分比表示结果。
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比较实施例—不含c5a负载的基质。负载游离c5a的胶原蛋白海绵(例ii.2)在相同的释放试验条件下进行测试。观察到90％的c5a在第1天以高突然释放方式释放(图10)。在此初始突然释放后，不再从基质中释放c5a。在实验条件下，释放的c5a保持稳定和活性达7天。然而，已知c5a在体内的半衰期很短，不到1小时。