植物乳杆菌L168在制备抗结直肠癌药物中的应用的制作方法

植物乳杆菌l168在制备抗结直肠癌药物中的应用
技术领域：
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌l168在制备抗结直肠癌药物中的应用。该植物乳杆菌l168(菌株保藏号：cgmcc no.13660)能够通过增加树突状细胞分泌il-12促进ifn-γ cd8 t细胞的抗肿瘤功能，进而抑制结直肠癌的发生。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer,crc)是世界范围内发病率和死亡率最高的的胃肠道恶性肿瘤之一，是一个严重的公共卫生问题。尽管目前crc的治疗方法很多，如手术、化疗、生物治疗等，但癌症治疗的成功率仍难以预测，死亡率高，且存在其他不良副作用。因此，早期诊断和预防更具挑战性。crc的发病是一个复杂的多因素过程，受遗传和环境因素的影响，且有不同的病因机制。特别是在环境危险因素中，慢性肠道炎症是crc发生的重要因素。此外，越来越多的研究阐明肠道菌群及其代谢产物与炎症性肠病(ibd)和crc存在显著的相关性。
3.植物乳杆菌l168(菌株保藏号：cgmccno.13660)是发明人筛选的一株益生菌，研究表明，植物乳杆菌l168可矫正果蝇的社交行为，并有望应用到人类自闭症疾病的诊疗中。研究该益生菌的功效，拓展能有效抑制结直肠癌的成分是本领域亟待解决的技术问题。
4.本发明研究发现植物乳杆菌l168(l168)给药可改善肠道炎症和结直肠癌。我们提供实验证据证明l168处理能改善结肠肿瘤模型中紊乱的肠道微生态结构，通过促进树突状细胞il-12的产生，进一步增加ifn-γ cd8 t细胞的抗肿瘤功能。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供植物乳杆菌l168在制备抗结直肠癌或结肠炎药物中的应用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.植物乳杆菌l168在制备抗结直肠癌或结肠炎药物中的应用。
8.优选的：所述的植物乳杆菌l168的保藏号为：cgmcc no.13660,该菌株分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，于2017年2月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
9.进一步优选的：所述的药物包括植物乳杆菌l168和药学上可接受的载体或者常规食用辅料。
10.更进一步优选的：所述药物的剂型为口服剂型。
11.本发明的有益效果：
12.本发明人研究了植物乳杆菌l168在治疗小鼠急性结肠炎治疗作用以及植物乳杆菌l168在治疗小鼠结肠癌中治疗作用及其机制；研究发现，植物乳杆菌l168对小鼠急性结肠炎具有显著的改善作用；植物乳杆菌l168对小鼠结直肠癌具有显著的改善作用。可成为
未来治疗结直肠炎和结直肠癌的有效药物。
附图说明
13.图1为急性结肠炎的造模过程示意图及l168处理改善急性结肠炎表型结果图。
14.图2为植物乳杆菌l168处理改善aom/dss诱导的结肠癌表型结果图。
15.图3为植物乳杆菌l68处理小鼠可显著改善其肠道菌群结构效果图。
16.图4为植物乳杆菌l168处理能够增加树突状细胞分泌il-12，进而加强ifn-γ cd8 t细胞的杀伤功能效果图。
具体实施方式：
17.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
18.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
19.实施例1植物乳杆菌l168处理能够改善急性结肠炎表型
20.急性结肠炎的造模过程为：6-8w的c57bl/6小鼠，随机分为正常对照组、dss组和dss lpl168组。各组的处理如下所示：
21.正常组：造模过程中饮用纯水；
22.dss组：造模前7天小鼠饮用含有3％的dss，之后换成正常纯水；
23.dss lp l168组：造模前7天小鼠饮用含有3％的dss，之后换成正常纯水,造模过程中小鼠每天灌胃l168(2 109 cfu)；
24.小鼠饮用含有3％(m/v,g/100ml)的dss(葡聚糖硫酸钠)(mp公司)纯水一周，7天后换成正常纯水饮用，第16天时，小鼠取材。在整个造模过程中，小鼠每天灌胃l168(2*10^9cfu)。每隔一天称重并记录小鼠状态。
25.造模结束后，小鼠取材如下：
26.造模结束后，5％(m/v,g/100ml)的水合氯醛麻醉小鼠，对小鼠进行取材，取小鼠脾脏及结肠，测量结肠长度长度，小鼠结肠长度为肛门到盲肠下端的距离。取小鼠结肠远端0.5-1cm，进行4％(m/v,g/100ml)的多聚甲醛固定，结肠组织进行石蜡切片操作并进行常规h&e染色(he染色武汉塞维尔公司具体操作)。
27.如图1结果所示，l168处理能够改善急性结肠炎表型，图中各图具体介绍如下：
28.a：急性结肠炎的造模过程示意图；
29.b：在整个造模过程中称量体重，具体如图b，在饮用dss 4天后，小鼠体重开始下降，但同时l168处理后的小鼠能够明显减少体重的减轻，尤其在模型中后期，ila处理的的小鼠体重得到了明显的缓解，p＜0.01。
30.c-d：在造模第16天时，对小鼠进行取材，取小鼠结肠并量取长度，小鼠结肠长度为肛门到盲肠下端的距离。相对于对照组，dss组小鼠结肠长度明显变短，然而同时用l168处理的小鼠，其结肠长度得到恢复，趋向于正常组。且差异均有统计学意义，p＜0.05。
31.e：在造模第16天时，对小鼠进行取材，取小鼠脾脏并称重。相对于正常组，dss处理组小鼠脾脏重量明显增加，出现脾脏肿大的现象。同时用l168处理的小鼠脾脏重量减轻，且
有统计学意义p＜0.05。
32.f-g：在造模第16天时，对小鼠进行取材，取小鼠结肠远端0.5-1cm，进行4％的多聚甲醛固定，结肠组织进行石蜡切片操作并进行常规h&e染色。he显示，dss处理组结肠正常结构已破坏，隐窝增生，上皮损伤且有炎性浸润，累计范围较广。l168处理的小鼠结肠损伤得到明显改善，p＜0.001。
33.结果显示，植物乳杆菌l168处理能够显著改善小鼠急性结肠炎表型。
34.实施例2植物乳杆菌l168处理能够改善aom/dss诱导的结肠癌表型
35.化学诱导结直肠癌造模过程：6-8w的c57bl/6小鼠，随机分为正常对照组、aom dss组和aom dss l168组。各组的处理如下所示：
36.正常组：整个造模过程中，小鼠饮用纯水；
37.aom dss组：第0天，小鼠腹腔注射aom(氧化偶氮甲烷)7.5mg/kg。第7天，给与小鼠含有2％(m/v,g/100ml)的dss的饮用水，一周后即第14天，换成正常纯水，持续2周。3周作为一个循环，小鼠给与dss重复3个循环，之后小鼠全部换成正常纯水直至造模结束。
38.aom dss l168组：第0天，小鼠腹腔注射aom(氧化偶氮甲烷)7.5mg/kg。第7天，给与小鼠含有2％(m/v,g/100ml)的dss的饮用水，一周后即第14天，换成正常纯水，持续2周。3周作为一个循环，小鼠给与dss重复3个循环，之后小鼠全部换成正常纯水直至造模结束。在整个造模过程中，小鼠给与l168(2
×
109cfu)饮用。
39.第0天，小鼠腹腔注射aom(氧化偶氮甲烷)7.5mg/kg。第7天，给与小鼠含有2％(m/v,g/100ml)的dss的饮用水，一周后即第14天，换成正常纯水，持续2周。3周作为一个循环，小鼠给与dss重复3个循环，之后小鼠全部换成正常纯水直至造模结束。在整个造模过程中，l168(2*10^9cfu)隔天灌胃小鼠。
40.造模结束后，小鼠取材如下：
41.造模结束后，5％水合氯醛麻醉小鼠，取小鼠结肠、脾脏及肝脏。将结肠纵向剖开，拍照，记录肿瘤个数、位置并测量直径大小，称量脾脏及肝脏的重量。
42.如图2所示。相对于模型组，l168处理小鼠后，造模后期，小鼠体重丢失明显减少(图i),结肠肿瘤数量和负荷显著减少(图j-l),脾脏和肝脏重量减轻(图m-n)，图中各图具体介绍如下：
43.h：aom/dss诱导的结直肠癌的造模过程，第0天，小鼠腹腔注射aom(氧化偶氮甲烷)7.5mg/kg。第7天，给与小鼠含有2％的dss的饮用水，一周后即第14天，换成正常纯水，持续2周。3周作为一个循环，小鼠给与dss重复3个循环，之后小鼠全部换成正常纯水直至造模结束。在整个造模过程中，l168(2*10^9cfu)隔天灌胃小鼠。
44.i:在整个造模过程中，观察小鼠状态，每周3次称量体重并记录。相对于模型组l168处理的小鼠，在模型的后期，使得小鼠体重得到明显的缓解，p＜0.001。
45.j-l:模型结束后，取小鼠结肠，纵向剖开，拍照，记录肿瘤个数、位置并测量直径大小，如图可见，l168处理后的小鼠肿瘤个数明显减少，不同大小的肿瘤个数均减少，p＜0.001。
46.m-n:模型结束后，取小鼠脾脏和肝脏并称重。相对于正常组，模型组的小鼠脾脏及肝脏重量明显增加，出现肿大的现象。l168处理的小鼠，小鼠脾脏及肝脏重量明显减轻且有统计学意义，p＜0.05。
47.结果显示，植物乳杆菌l168处理能够显著改善aom/dss诱导的结肠癌表型。
48.实施例3植物乳杆菌l168治疗可改善aom/dss诱导的crc小鼠模型肠道微生态系统的紊乱
49.我们对aom/dss诱导的结直肠癌小鼠的粪便进行16s测序，取小鼠粪便样本180-220mg提取dna，试剂盒为粪便基因组dna提取试剂盒(dp328)。具体操作按照试剂盒说明书进行。将提取的dna送天津诺禾资源科技有限公司检测。
50.如图3所示：l168处理后，相对于模型组，α多样性有升高的趋势(图a),β多样性有显著的差异(图b)，具体表现为已报道具有抑制肿瘤作用的菌的富集，如faecalibaculum，bifidobacterium等，以及已报道具有促进肿瘤作用的菌的显著减少，如bacterodes，oscillibacter，alistipes等，因此l68处理小鼠可显著改善其肠道菌群结构。
51.实施例4植物乳杆菌l168处理能够增加树突状细胞分泌il-12，进而加强ifn-γ cd8 t细胞的杀伤功能。
52.对小鼠脾脏、淋巴结及肠道固有层单个核细胞进行流式分析，检测mhcii cd11c dc及ifn-γcd8 t细胞的比例。具体方法如下：
53.制备小鼠脾脏、淋巴结及肠道固有层单核细胞的单细胞悬液。脾脏及淋巴结按照正常研磨方法制备，肠道固有层单核细胞的获取方法简单如下：纵行切开肠管，并将其重新剪成1cm大小肠段，在1x pbs中冲洗干净。在50ml离心管中装入5ml分离液(含有5mm edta和10mm hepes)，于37℃、4200rpm转速条件下消化肠段20分钟。用100μm细胞筛过滤出未消化肠组织，用1x pbs洗掉组织中残留的edta，并将其置于含5ml消化液(10ml rpmi1640包含4％胎牛血清,0.5mg/ml胶原酶d(collagenase d)和40μg/ml dnase i)的50ml离心管中。37℃、200rpm转速条件下消化肠段30分钟。消化完成后，剧烈震荡细胞悬液20s，用40μm细胞筛将细胞过滤至50ml离心管中。500g、20℃离心10分钟。弃上清。预先准备好装有4ml 80％percoll溶液的15ml离心管，用8ml 40％percoll溶液重悬细胞，并用吸管缓慢小心地将细胞悬液转移到80％percoll溶液的上方，将上述离心管小心放入离心机中，1000g、20℃离心20分钟。离心后，小心地将白色中间相的细胞转移到新的15ml离心管中，加入1x pbs后，500g、20℃离心10分钟。弃上清，立即用facs buffer重悬。
54.获得的单细胞悬液按照入选步骤进行流式检测：得到的单细胞悬液用flow cytometry staining buffer重悬，加入100ng/ml pma和1ug/ml离子霉素和3μg/ml的莫能霉素，37℃孵育5小时；收集细胞，加入fc阻断剂室温15min；
55.加入荧光标记的表面抗体：cd45、cd3、cd8、cd11c、fvs510及mhcii的抗体，4℃避光孵育30min；离心，弃上清，每管加入ic fixation buffer，吹打混匀细胞，室温20min；离心，弃上清，加入1
×
permeabilization buffer，吹打混匀细胞；离心，弃上清，加入100μl 1
×
permeabilization buffer重悬细胞后，加入ifn-γ及il-12的抗体，4℃避光孵育40min；1
×
permeabilization buffer洗涤一次，离心；弃上清，加入400μl的staining buffer重悬细胞，bdverse上机检测；用flowjo 10软件分析实验结果。如图4所示：我们发现，相对于模型组，l168处理能够cd11 mhcii dc的比例，并且这类细胞高表达il-12，在脾脏(图j-i)，淋巴结(图j-l)均可看到此现象。同时我们也发现l168处理后，能够增加脾脏(图a-b)、淋巴结(图c-d)及结肠固有层单核细胞(图e-f)的ifn-γ cd8 t细胞的比例。因此我们推测l168处理能够增加树突状细胞分泌il-12，进而加强ifn-γ cd8 t细胞的杀伤功能。(*p＜0.05；**
p＜0.01)
56.综上所述，本发明首次发现植物乳杆菌l168表现出了良好的改善急性结肠炎和结直肠癌表型的效果，有可能成为未来抗急性结肠炎和结直肠癌的有效成分。