采用高效液相色谱法测定苯硫酚中二苯二硫醚的方法与流程

1.本发明涉及检测术领域，具体为一种高效液相色谱法测定苯硫酚中二苯二硫醚的检 测方法。


背景技术：

2.苯硫酚是一种具有特殊臭味的无色液体，不易溶于水。它是有机合成反应中重要的中间体，能够合成多种药物、催化剂、阻聚剂、燃料等。苯硫酚主要用于医药、农药、高分子材料及有机合成的助剂等方面，如生产医药氯霉素的代用品甲砜霉素，农药克瘟散等以及制橡胶再生剂、石油添加剂等；也用于制局部麻醉剂。
3.苯硫酚是合成盐酸阿比多尔的主要起始原料，但苯硫酚在存放和使用过程中极易转化为杂质二苯二硫醚(sm02-d)，在盐酸阿比多尔中间体中要求控制sm02-d在0.10％以下，所以对起始原料苯硫酚中的sm02-d杂质控制非常必要。但目前没有关于苯硫酚中杂质二苯二硫醚的检测方法。


技术实现要素：

4.本发明提供一种高效液相色谱法测定苯硫酚中二苯二硫醚的检测方法，该方法灵敏度高，重复性好，结果准确，能够用于盐酸阿比多尔中间体生产的质量控制。
5.本发明的技术方案是，一种采用高效液相色谱法测定苯硫酚中二苯二硫醚的方法，色谱条件为：色谱柱为c18；流动相包括流动相a和流动相b，其中流动相a以乙腈和高氯酸缓冲液按50:50混合，流动相b为乙腈；检测波长210～254nm，柱温30℃
±
5℃，流速1.0ml/min
±
0.1ml/min。
6.进一步地，流动相a中高氯酸缓冲液浓度为0.02mol/l。
7.更近一步地，流动相a配制时，先取纯水加高氯酸混合，调节ph值在5.4-7.0，混匀并放置10分钟；再加三乙胺，混匀后调节ph值至6.0
±
0.05，得到高氯酸缓冲液；最后将乙腈和高氯酸缓冲液混合得流动相a。
8.进一步地，流动相a配制时，纯水加高氯酸后用氨水调节ph；加三乙胺后用磷酸调节ph。
9.进一步地，检测苯硫酚样品中二苯二硫醚时，样品溶液临用新制。
10.进一步地，样品溶液配制时，先配用溶剂制备储备溶液，然后稀释成样品溶液；溶剂为乙腈。
11.进一步地，色谱柱为waters xbridge c18色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂固定相。
12.进一步地，检测波长为254nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；样品盘温为5℃。
13.进一步地，测试过程中，采用流动相进行梯度洗脱，具体洗脱程序如下表1所示：
14.表1
[0015][0016]
本发明还涉及所述的方法在盐酸阿比多尔中间体生产质量控制中的应用。
[0017]
本发明具有以下有益效果：
[0018]
本发明提供的高效液相色谱法测苯硫酚中二苯二硫醚含量的方法，对苯硫酚中sm02-d杂质专属性确认分离度大于1.5，成功分离了苯硫酚中的sm02-d杂质。sm02-d 杂质的最小检测限lod为0.04473μg/ml，约相当于样品浓度的0.014％，sm02-d杂质的定量限为0.1491μg/ml，约相当于样品浓度的0.046％。
[0019]
该检测方法简便、准确、有效，能够满足实际样品检测的需要，适用于苯硫酚中 sm02-d杂质测定，测定结果可靠。原国家标准没有建立苯硫酚有关物质检测方法，现采用hplc方法，提高了产品质量标准。hplc检测方法更适用于苯硫酚的检测，hplc方法更能有效检出有关杂质，控制杂质超标风险，有利于保证合成药物产品安全有效。该液相方法的建立为今后的生产过程中对苯硫酚杂质的控制提供了有效的监控手段。
附图说明
[0020]
图1为实施例1测试图谱。
[0021]
图2为实施例2中采用2-1～2-5梯度洗脱条件测试的图谱。
[0022]
图3为实施例4中专属性试验中苯硫酚有关物质检测图谱。
[0023]
图4为实施例4中苯硫酚线性关系图。
[0024]
图5为为实施例4中sm02-d线性关系图。
[0025]
图6为对比例样品主峰图谱。
[0026]
图7为对比例杂质sm02-d峰图谱。
具体实施方式
[0027]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0028]
实施例中使用的液相色谱仪(日本岛津lc-20at，紫外检测器)；电子分析天平(梅特勒-托利多xse 205)；苯硫酚样品、sm02-d对照品(hwh136-190406湖北生物医药产业研究院)；高氯酸(ar级)、氨水(ar级)、乙腈(hplc级)、三乙胺(ar 级)、磷酸(ar级)。
[0029]
实施例1：
[0030]
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-缓冲液按体积比50：50为流动相a，缓冲溶液配制时，取纯水1l，精密加入高氯酸1.6ml，加氨水调节ph值在5.4-7.0范围内，混匀并放置约10分钟；加三乙胺10.0ml，混匀并用磷酸调节ph值至6.0。乙腈为流动相 b；按下表
2进行梯度洗脱；检测波长为254nm。
[0031]
表2
[0032][0033]
分别取对照溶液、杂质sm02-d对照溶液在波长254nm、230nm、260nm、220nm、 210nm进行波长及校正因子考察，如下表3所示，各波长条件下sm02-d杂质的吸收均明显大于苯硫酚。
[0034]
表3
[0035]
波长254nm230nm260nm220nm210nm苯硫酚峰面积34648917192068661466132410sm02-d峰面积5609414556636136147388203262苯硫酚出峰时间8.486min，sm02-d出峰时间34.188min，具体见图1，分离度良好，但方法时间较长，且溶液室温放置4h后sm02-d明显增长约3％，溶液稳定性差，还可以进一步优化。
[0037]
实施例2：
[0038]
梯度洗脱的研究，采用同一批次样品，分为5组分别为：2-1、2-2、2-3、2-4和2
‑ꢀ
5；在不同梯度条件下，具体如下表4～表8，光破坏样品溶液主要降解杂质均有检出，分离度符合要求，相关图谱见图2
[0039]
表4 2-1对应梯度条件
[0040][0041]
表5 2-2对应梯度条件
[0042][0043]
表6 2-3对应梯度条件
[0044][0045]
表7 2-4对应梯度条件
[0046][0047][0048]
表8 2-5对应梯度条件
[0049][0050]
综合考虑运行时间及分离度选择2-5中的梯度条件作为最终检测梯度。
[0051]
实施例3：在5℃保存样品进行稳定性研究，配制苯硫酚供试溶液，在5℃条件下放置不同时间后进样，结果如下表9所示。
[0052]
表9
[0053]
放置时间0h0.5h1h2h5h7hsm02-d杂质含量2.87％2.93％3.01％3.24％3.79％4.39％
[0054]
从表中可以看出sm02-d杂质随时间变化增加明显，说明本品样品溶液在5℃保存
仍不稳定，需临用新制。
[0055]
实施例4：
[0056]
1)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(waters xbridge c18, 4.6mm
×
250mm，5μm或效能相当的色谱柱)为固定相；流动相a：以0.02mol/l高氯酸缓冲液(取纯水1l，精密加入高氯酸1.6ml，加氨水调节ph值至6.1，混匀并放置约10 分钟；加三乙胺10.0ml，混匀并用磷酸调节ph值至6.02)-乙腈(50:50)；流动相b：乙腈；
[0057]
检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；样品盘温： 5℃；
[0058]
梯度洗脱程序如表8所示。
[0059]
2)溶液制备：
[0060]
空白溶剂：乙腈
[0061]
供试品储备溶液：取苯硫酚样品0.2ml，置10ml棕色量瓶中，加乙腈稀释至刻度，即得。
[0062]
供试品溶液：精密量取供试品储备溶液0.15ml，置10ml棕色量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得(临用新制)。
[0063]
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml棕色量瓶中，加乙腈稀释至刻度，即得。
[0064]
杂质sm02-d对照储备溶液：取杂质sm02-d对照品15mg，置100ml量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0065]
杂质sm02-d对照溶液：精密量取sm02-d对照储备溶液0.8ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0066]
3)专属性试验：
[0067]
取空白溶剂、供试品溶液、对照溶液、杂质sm02-d对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，其中图3为苯硫酚有关物质检测专属性图谱，图中1.苯硫酚；2.杂质sm02-d。
[0068]
空白溶剂对供试品溶液无干扰，供试品溶液中主峰与杂质峰最小分离度r＝9.860＞1.5，能有效分离。图3表明苯硫酚和其杂质sm02-d得到较好的分离，苯硫酚保留时间约8.4min，杂质sm02-d保留时间约16.7min，主峰与杂质峰最小分离度为9.860，二者分离度大于1.5。
[0069]
4)强降解试验
[0070]
供试品溶液各种破坏条件处理溶液的配制：
[0071]
sm02强光样品溶液：取样品溶液于日光照射约20min，即得。平行配制空白溶液。
[0072]
sm02氧化样品溶液：精密量取供试品储备溶液0.15ml，置10ml量瓶中，加 3％h2o2溶液0.1ml，加乙腈稀释至刻度，摇匀，于5℃放置约45min，即得。平行配制空白溶液。
[0073]
sm02强酸样品溶液：精密量取供试品储备溶液0.15ml，置10ml量瓶中，加1m盐酸溶液1.0ml，加乙腈适量摇匀，室温放置约4h，加1m氢氧化钠溶液1.0ml中和，加乙腈稀释至刻度，即得。平行配制空白溶液。
[0074]
sm02强碱样品溶液：精密量取供试品储备溶液0.15ml，置10ml量瓶中，加1m氢氧化钠溶液1.0ml，加乙腈适量摇匀，室温放置约4h，加1m盐酸溶液1.0ml中和，加乙腈稀释至刻度，即得。平行配制空白溶液。
[0075]
sm02高温样品溶液：精密量取供试品储备溶液0.15ml，置10ml量瓶中，加乙腈适量，于60℃水浴约2h或于室温放置约24h，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0076]
具体测试时，分别取空白溶剂、供试品溶液、各破坏条件下样品溶液及空白溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。具体如下表10所示。
[0077]
表10
[0078][0079]
上述破坏试验结果说明，各破坏条件下空白溶剂均对苯硫酚有关物质检测无干扰。各破坏条件下样品溶液中主峰及相邻杂质、各主要杂质间的分离度均大于1.5，符合要求。主峰最小峰纯度相似度均大于0.998，符合要求。物料平衡均在90％～110％范围内，说明此方法专属性较好。
[0080]
苯硫酚样品溶液在室温条件下不稳定，主要增加杂质为sm02-d，在高温条件下 sm02-d略有增加。在高温60℃，强酸条件下相对较稳定，sm02-d杂质略有增加。在氧化、强光、强碱条件下较不稳定，在强光、氧化条件下主要降解杂质为sm02-d，约 14.5min(rrt约1.7)的杂质略有增加。在强碱条件下，主要降解杂质为sm02-d，约 2.38min(rrt约0.28)和约14.5min(rrt约1.7)的杂质略有增加。
[0081]
各条件下供试品溶液中主峰及相邻杂质、各主要杂质之间的分离度均≥1.5；各条件下供试品溶液中主峰的最小峰纯度相似度均＞0.998；物料平衡均在90％～110％之间。说明苯硫酚有关物质分析方法专属性较好。
[0082]
5)检测限试验
[0083]
检测限溶液的制备：分别取苯硫酚供试品储备液、杂质sm02-d储备液溶液逐级稀释，至信噪比s/n≥3时的溶液浓度即为检测限浓度。
[0084]
测定方法：分别取空白溶剂、检测限溶液进样考察。
[0085]
结果如下表11。
[0086]
表11
[0087][0088][0089]
苯硫酚检测限为0.09655μg/ml，约相当于样品浓度0.03％，s/n为7.33(＞3.0)；
[0090]
sm02-d检测限为0.04473μg/ml，约相当于样品浓度0.014％，s/n为12.43(＞ 3.0)。检测限溶液的主峰及杂质信噪比s/n均≥3。
[0091]
6)检测限试验
[0092]
定量限溶液的制备：分别取苯硫酚供试品储备液、杂质sm02-d储备液溶液逐级稀释，至信噪比s/n≥10时的溶液浓度即为定量限浓度。
[0093]
测定方法：重复进样6针，分别取空白溶剂、定量限溶液进样考察。
[0094]
结果如下表12所示，
[0095]
表12
[0096][0097]
苯硫酚定量限为0.3218μg/ml，约相当于样品浓度0.10％，s/n为23.3(＞10.0)；sm02-d定量限为0.1491μg/ml，约相当于样品浓度0.046％，s/n为35.8(＞10.0)。苯硫酚定量限溶液信噪比s/n最大值为25.10，最小值为21.93，峰面积的rsd为6.1％ (n＝6)。sm02-d定量限溶液信噪比s/n最大值为41.25，最小值为32.78，峰面积的 rsd为5.8％(n＝6)。主峰及杂质信噪比s/n均≥10，定量限溶液峰面积rsd≤10％ (n＝6)。
[0098]
7)线性试验
[0099]
线性对照溶液：分别取苯硫酚供试品储备液、杂质sm02储备液溶液稀释，制成杂质 sm02-d浓度从定量限至约6％样品浓度的溶液。
[0100]
线性对照-1溶液：取上述对照储备液0.2ml，置100ml容量瓶，加乙腈稀释至刻度，
摇匀，即得。
[0101]
线性对照-2溶液：取上述对照储备液1ml，置100ml容量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0102]
线性对照-3溶液：取上述对照储备液1ml，置50ml容量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0103]
线性对照-4溶液：取上述对照储备液2ml，置25ml容量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0104]
线性对照-5溶液：取上述对照储备液1.2ml，置10ml容量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。
[0105]
测定方法：分别取空白溶剂、定量限溶液、各浓度线性对照溶液进样考察。相关系数r≥0.995。
[0106]
结果：苯硫酚线性范围检测结果如表13所示，线性关系图如图4所示。sm02-d线性范围检测结果如表14所示，线性关系图如图5所示。
[0107]
表13
[0108][0109]
表14
[0110][0111][0112]
分别进样，以峰面积y对浓度x进行线性回归，苯硫酚回归方程为：y＝29464x
‑ꢀ
6902，r＝0.9995。杂质sm02-d回归方程为：y＝36033x 1401，r＝1.0000。
[0113]
表13及图2表明苯硫酚在0.3218μg/ml～38.62μg/ml浓度范围内线性良好，线性方程为y＝29464x-6902，r值为0.9995。
[0114]
表14及图3表明sm02-d在0.1491μg/ml～17.80μg/ml浓度范围内线性良好，线性方程为y＝36033x 1401，r值为1.0000。sm02-d的校正因子为0.82。
[0115]
8)溶液稳定性
[0116]
样品溶液的制备：取供试品溶液于5℃条件下放置不同时间进行考察。
[0117]
测定：分别于0h、0.5h、1h、2h、5h、7h、9h进样，计算各样品溶液中sm02-d的 rsd。
[0118]
分别取空白溶剂、样品溶液在5℃放置并在不同时间进行考察。sm02-d杂质 rsd＝22.9％(＞4.0％)，总杂rsd＝22.9％(＞4.0％)。
[0119]
溶液稳定性检测结果见表15。
[0120]
表15
[0121][0122]
溶液稳定性结果表明在5℃放置条件下sm02-d杂质随时间变化增加明显，说明本品样品溶液不稳定，需临用新制。
[0123]
9)耐用性试验
[0124]
分别取空白溶剂、样品溶液在不同色谱条件下进行考察。考察不同流速、不同柱温、不同流动相ph值微小变化的色谱条件。
[0125]
具体结果见表16。
[0126]
表16
[0127][0128][0129]
耐用性考察不同流速时，sm02-d杂质检测量无明显变化，无其他单个杂质增加，说明不同流速的微小变化对苯硫酚有关物质检测无影响。
[0130]
耐用性考察不同柱温变化时，sm02-d杂质检测量无明显变化，35℃时检出其他单个杂质为0.020％(小于0.05％)，说明不同柱温的微小变化对苯硫酚有关物质检测无影响。
[0131]
耐用性考察不同ph条件时，ph6.2条件时sm02-d杂质检测量较正常条件偏小，推测ph6.2条件不适用于苯硫酚杂质检测。ph5.9条件下，sm02-d杂质检测量无明显影响。说明不同ph条件对苯硫酚有关物质检测略有影响，建议检测时使用ph6.0
±
0.05。
[0132]
在色谱条件微小变化时，不同流速(
±
0.1ml/min)、不同柱温(
±
5℃)及不同流动相ph值(
±
0.1)条件下，样品溶液中sm02-d杂质rsd为2.4％，总杂rsd为2.6％；且无大于0.05％的新增杂质。
[0133]
实施例5：
[0134]
取样3批次，批号分别为a01-201309003、a01-201901010和a01-201909001。按照实施例4的中的色谱条件1)和溶液制备方法2)进行样品检测。其检测结果如下表17 所示。
[0135]
表17
[0136]
批号sm02-da01-2013090033.4％a01-2019010100.13％a01-2019090010.30％
[0137]
其中，样品a01-201309003中sm02-d含量达到3.4％，标准不得过4.0％。采用该方法能够控制杂质超标风险，有利于保证合成药物产品安全有效。该液相方法的建立为生产过程中对苯硫酚杂质的控制提供了有效的监控手段。
[0138]
对比例：
[0139]
采用气相色谱法检测苯硫酚有关物质，色谱条件：色谱柱为hp-5(30m
×
0.53mm
×
3μm) 毛细管柱，程序升温，初始温度为135℃，维持10分钟。以每分钟15℃的速率升至200℃；检测器为氢火焰离子化检测器(fid)，温度235℃；进样口温度200℃；载气流速为每分钟5.0ml；分流比为20∶1；进样量1ul。
[0140]
测定方法：精密量取苯硫酚100μl，加无水乙醇溶解并稀释至10ml作为供试品溶液。苯硫酚样品中未检出杂质，且样品主峰(见图6)与杂质sm02-d峰(见图7)重叠，因此气相色谱法不适用于检测苯硫酚中的sm02-d杂质。
[0141]
综上，采用本发明建立的高效液相色谱法，对苯硫酚中sm02-d杂质专属性确认分离度大于1.5，成功分离了苯硫酚中的sm02-d杂质。sm02-d杂质的最小检测限lod为 0.04473μg/ml，约相当于样品浓度的0.014％，sm02-d杂质的定量限为0.1491μg/ml，约相当于样品浓度的0.046％。