一种糖功能化纳米粒子的制备及其在流感病毒检测中的应用的制作方法

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种糖功能化纳米粒子的制备及其在流感病毒检测中的应用。


背景技术：

2.流行性感冒的潜伏期通常是1-3天，轻则会导致患者身体虚弱，主要特征表现为发热、头痛、咽痛、干咳、流鼻涕、肌肉关节痛的症状，严重的患者可能引起身体其他各系统的发生并发症，甚至有可能会导致死亡。流感传播速度和广度与人口有着密不可分的关系。引起流感疫情的爆发可能是大量人群感染新变异流感病毒，会严重危害人们的健康。因此，需要对流感病毒进行快速准确的检测。
3.近年来，随着纳米技术的蓬勃发展，利用纳米材料检测和诊断已经成为科学界一个十分热门的研究领域，引起了科学界的广泛关注。利用纳米材料可以实现对诸如金属离子、生物小分子、核酸、蛋白质、多糖，甚至是细胞、细菌以及病毒的检测，其特点是比表面积大，并且粒子表面既无长程又无短程的非晶区。金纳米粒子除了具备纳米材料所具备的表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应外，金纳米粒子还可以和巯基通过au-s共价结合，所以金纳米粒子可以和生物蛋白分子结合作为生物分子探针。此外金纳米粒子具有大的比表面积、高的催化效率、强的吸附能力以及良好的生物共容性、无毒性，不会破坏酶和蛋白质的活性。所以金纳米粒子常结合功能分子作为生物分子探针来对病毒进行检测。目前用于金纳米粒子用于病毒检测时常常由于分散性较差，稳定性不好，从而影响检测的准确性。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种糖功能化纳米粒子的制备方法，本发明制得的糖功能化的纳米粒子分散稳定性好，用于病毒检测时灵敏度高。
5.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
6.一种糖功能化纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)向煮沸的氯金酸溶液中以1-2ml/min的速度滴加柠檬酸钠溶液，滴加结束后继续加热处理10-20min，之后冷却至室温，过滤，将过滤得到的固体干燥处理，之后重新分散在超纯水中，制得浓度为1-2g/l的纳米金分散液；
8.(2)将硫酸溶液和微晶纤维素混合酸解处理，酸解过程中保持持续搅拌，酸解结束后离心，用水洗涤离心后的上清液，最后将上清液冷冻干燥，制得纳米纤维素晶体；
9.(3)将纳米纤维素晶体采用四氢呋喃溶解后，滴加三氯氧磷，搅拌反应，之后室温下继续搅拌，最后加入去离子水搅拌混合处理，过滤，将过滤后的固体干燥，制得磷酸化纳米纤维素晶体；
10.(4)将磷酸化纳米纤维素晶体加入到纳米金分散液中，加入壳聚糖的乙酸溶液剧
烈搅拌，之后继续加入戊二醛溶液，搅拌交联，最后过滤，将固体干燥后制得纳米粒子；
11.(5)从牛初乳中提取唾液酸寡糖，然后将其与纳米粒子一起与超纯水混合，室温下搅拌处理20-25h，之后10000-15000rpm下离心，收集的沉淀溶于pbs缓冲液中，得到糖功能化纳米粒子分散液。
12.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述氯金酸溶液的浓度为0.1-0.2g/l；所述柠檬酸钠溶液的浓度为8-11g/l，二者体积比为(20-30)：1。
13.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述硫酸溶液的质量浓度为65％，所述微晶纤维素和硫酸溶液的用量比为1g：50ml-60ml。
14.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述酸解处理的温度为45℃，时间为60-100min。所述离心处理的转速为10000rpm。所述冷冻干燥的温度为-20℃，所述冷冻干燥的时间为24h。
15.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述纳米纤维素晶体、三氯氧磷的用量比为0.2g：(1-2)ml。
16.作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，所述搅拌反应的温度为40℃，时间为10-15min；所述室温下继续搅拌的时间为24h；所述搅拌混合处理的时间为1-2h。
17.作为上述技术方案的优选，步骤(4)中，所述壳聚糖乙酸溶液中，壳聚糖的浓度为0.01g/ml，乙酸的浓度为0.001ml/ml；所述戊二醛溶液的浓度为5wt％，所述磷酸化纳米纤维素晶体、纳米金分散液、所述壳聚糖的乙酸溶液、所述戊二醛溶液的用量比为0.05g：30ml：(4-5)ml:5ml。
18.作为上述技术方案的优选，步骤(5)中，从牛初乳中提取唾液酸寡糖的具体方法为：将牛初乳溶于氯仿内搅拌混合，之后进行离心脱脂，离心后的上清液加入无水乙醇搅拌混合30-50min，继续离心，收集上清液，最后将收集的上清液缓慢升温进行浓缩至无明显溶剂，将浓缩液进行冷冻干燥，得到唾液酸寡糖。
19.作为上述技术方案的优选，步骤(5)中，所述唾液酸寡糖、纳米粒子、超纯水的用量比为(2-3)g：(25-30)g：500ml。
20.上述方法制备的糖功能化纳米粒子可应用于流感病毒检测。
21.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
22.本发明首先以柠檬酸钠作为还原剂，制备分散均匀的纳米金分散液；然后以微晶纤维素为原料，通过酸解制备纳米纤维素晶体，并对其进行磷酸化处理，然后将磷酸化的纳米纤维晶体、纳米金分散液混合，并加入壳聚糖的乙酸溶液，在戊二醛的作用下交联反应，在纳米金与磷酸化纳米纤维晶体复合材料的表面形成三维网状包覆，制得的纳米粒子分散性好，具有良好的生物相容性，将其与唾液酸寡糖复合形成糖功能化纳米粒子，在用于检测流感病毒时可与流感病毒表面的ha特异性结合和识别，从而检测出流感病毒。本发明制得的糖功能化流感病毒稳定性好，用于测试流感病毒时，准确度高。
具体实施方式
23.下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
24.实施例1
25.向40ml煮沸的浓度为0.1g/l的氯金酸溶液中以1ml/min的速度滴加3ml浓度为8g/l的柠檬酸钠溶液，滴加结束后继续加热处理10min，之后冷却至室温，过滤，将过滤得到的固体干燥处理，之后重新分散在超纯水中，制得浓度为1g/l的纳米金分散液；将50ml质量浓度为65％的硫酸溶液和1g微晶纤维素混合45℃下酸解处理60min，酸解过程中保持持续搅拌，酸解结束后10000rpm下离心20min，用水洗涤离心后的上清液，最后将上清液在-20℃下冷冻干燥24h，制得纳米纤维素晶体；将0.2g纳米纤维素晶体采用80ml四氢呋喃溶解后，滴加1ml三氯氧磷，40℃下搅拌反应10min，之后室温下继续搅拌24h，最后加入100ml去离子水搅拌混合处理1h，过滤，将过滤后的固体干燥，制得磷酸化纳米纤维素晶体；将0.05g磷酸化纳米纤维素晶体加入到30ml纳米金分散液中，加入4ml含有0.01g/ml壳聚糖、0.001ml/ml乙酸的壳聚糖/乙酸水溶液剧烈搅拌，之后继续加入5ml浓度为5wt％戊二醛溶液，搅拌交联，最后过滤，将固体干燥后制得纳米粒子；
26.将100ml牛初乳溶于100ml氯仿内搅拌混合，之后进行离心脱脂，离心后的上清液加入500ml无水乙醇搅拌混合30min，继续离心，收集上清液，最后将收集的上清液缓慢升温至70℃进行浓缩至无明显溶剂，将浓缩液在-20℃进行冷冻干燥20h，得到唾液酸寡糖；将2g唾液酸寡糖、25g纳米粒子加入到500ml超纯水混合，室温下搅拌处理20h，之后10000rpm下离心，收集的沉淀溶于pbs缓冲液中，得到糖功能化纳米粒子分散液。
27.实施例2
28.向60ml煮沸的浓度为0.2g/l的氯金酸溶液中以2ml/min的速度滴加3ml浓度为11g/l的柠檬酸钠溶液，滴加结束后继续加热处理20min，之后冷却至室温，过滤，将过滤得到的固体干燥处理，之后重新分散在超纯水中，制得浓度为2g/l的纳米金分散液；将60ml质量浓度为65％的硫酸溶液和1g微晶纤维素混合45℃下酸解处理100min，酸解过程中保持持续搅拌，酸解结束后10000rpm下离心20min，用水洗涤离心后的上清液，最后将上清液在-20℃下冷冻干燥24h，制得纳米纤维素晶体；将0.2g纳米纤维素晶体采用80ml四氢呋喃溶解后，滴加2ml三氯氧磷，40℃下搅拌反应15min，之后室温下继续搅拌24h，最后加入100ml去离子水搅拌混合处理2h，过滤，将过滤后的固体干燥，制得磷酸化纳米纤维素晶体；将0.05g磷酸化纳米纤维素晶体加入到30ml纳米金分散液中，加入5ml含有0.01g/ml壳聚糖、0.001ml/ml乙酸的壳聚糖/乙酸水溶液剧烈搅拌，之后继续加入5ml浓度为5wt％戊二醛溶液，搅拌交联，最后过滤，将固体干燥后制得纳米粒子；
29.将100ml牛初乳溶于100ml氯仿内搅拌混合，之后进行离心脱脂，离心后的上清液加入500ml无水乙醇搅拌混合50min，继续离心，收集上清液，最后将收集的上清液缓慢升温至80℃进行浓缩至无明显溶剂，将浓缩液在-20℃进行冷冻干燥20h，得到唾液酸寡糖；将3g唾液酸寡糖、30g纳米粒子加入到500ml超纯水混合，室温下搅拌处理25h，之后15000rpm下离心，收集的沉淀溶于pbs缓冲液中，得到糖功能化纳米粒子分散液。
30.实施例3
31.向50ml煮沸的浓度为0.15g/l的氯金酸溶液中以1.5ml/min的速度滴加3ml浓度为8g/l的柠檬酸钠溶液，滴加结束后继续加热处理10min，之后冷却至室温，过滤，将过滤得到的固体干燥处理，之后重新分散在超纯水中，制得浓度为1g/l的纳米金分散液；将60ml质量浓度为65％的硫酸溶液和1g微晶纤维素混合45℃下酸解处理70min，酸解过程中保持持续搅拌，酸解结束后10000rpm下离心20min，用水洗涤离心后的上清液，最后将上清液在-20℃
下冷冻干燥24h，制得纳米纤维素晶体；将0.2g纳米纤维素晶体采用80ml四氢呋喃溶解后，滴加1ml三氯氧磷，40℃下搅拌反应10min，之后室温下继续搅拌24h，最后加入100ml去离子水搅拌混合处理2h，过滤，将过滤后的固体干燥，制得磷酸化纳米纤维素晶体；将0.05g磷酸化纳米纤维素晶体加入到30ml纳米金分散液中，加入4ml含有0.01g/ml壳聚糖、0.001ml/ml乙酸的壳聚糖/乙酸水溶液剧烈搅拌，之后继续加入5ml浓度为5wt％戊二醛溶液，搅拌交联，最后过滤，将固体干燥后制得纳米粒子；
32.将100ml牛初乳溶于100ml氯仿内搅拌混合，之后进行离心脱脂，离心后的上清液加入500ml无水乙醇搅拌混合40min，继续离心，收集上清液，最后将收集的上清液缓慢升温至70℃进行浓缩至无明显溶剂，将浓缩液在-20℃进行冷冻干燥20h，得到唾液酸寡糖；将2g唾液酸寡糖、25g纳米粒子加入到500ml超纯水混合，室温下搅拌处理21h，之后12000rpm下离心，收集的沉淀溶于pbs缓冲液中，得到糖功能化纳米粒子分散液。
33.实施例4
34.向40ml煮沸的浓度为0.15g/l的氯金酸溶液中以1.5ml/min的速度滴加3ml浓度为10g/l的柠檬酸钠溶液，滴加结束后继续加热处理20min，之后冷却至室温，过滤，将过滤得到的固体干燥处理，之后重新分散在超纯水中，制得浓度为1g/l的纳米金分散液；将50ml质量浓度为65％的硫酸溶液和1g微晶纤维素混合45℃下酸解处理60min，酸解过程中保持持续搅拌，酸解结束后10000rpm下离心20min，用水洗涤离心后的上清液，最后将上清液在-20℃下冷冻干燥24h，制得纳米纤维素晶体；将0.2g纳米纤维素晶体采用80ml四氢呋喃溶解后，滴加1.5ml三氯氧磷，40℃下搅拌反应10min，之后室温下继续搅拌24h，最后加入100ml去离子水搅拌混合处理2h，过滤，将过滤后的固体干燥，制得磷酸化纳米纤维素晶体；将0.05g磷酸化纳米纤维素晶体加入到30ml纳米金分散液中，加入4ml含有0.01g/ml壳聚糖、0.001ml/ml乙酸的壳聚糖/乙酸水溶液剧烈搅拌，之后继续加入5ml浓度为5wt％戊二醛溶液，搅拌交联，最后过滤，将固体干燥后制得纳米粒子；
35.将100ml牛初乳溶于100ml氯仿内搅拌混合，之后进行离心脱脂，离心后的上清液加入500ml无水乙醇搅拌混合40min，继续离心，收集上清液，最后将收集的上清液缓慢升温至70℃进行浓缩至无明显溶剂，将浓缩液在-20℃进行冷冻干燥20h，得到唾液酸寡糖；将2g唾液酸寡糖、30g纳米粒子加入到500ml超纯水混合，室温下搅拌处理22h，之后10000rpm下离心，收集的沉淀溶于pbs缓冲液中，得到糖功能化纳米粒子分散液。
36.实施例5
37.向50ml煮沸的浓度为0.15g/l的氯金酸溶液中以1.5ml/min的速度滴加3ml浓度为10g/l的柠檬酸钠溶液，滴加结束后继续加热处理15min，之后冷却至室温，过滤，将过滤得到的固体干燥处理，之后重新分散在超纯水中，制得浓度为1.5g/l的纳米金分散液；将50ml质量浓度为65％的硫酸溶液和1g微晶纤维素混合45℃下酸解处理80min，酸解过程中保持持续搅拌，酸解结束后10000rpm下离心20min，用水洗涤离心后的上清液，最后将上清液在-20℃下冷冻干燥24h，制得纳米纤维素晶体；将0.2g纳米纤维素晶体采用80ml四氢呋喃溶解后，滴加2ml三氯氧磷，40℃下搅拌反应10min，之后室温下继续搅拌24h，最后加入100ml去离子水搅拌混合处理1h，过滤，将过滤后的固体干燥，制得磷酸化纳米纤维素晶体；将0.05g磷酸化纳米纤维素晶体加入到30ml纳米金分散液中，加入5ml含有0.01g/ml壳聚糖、0.001ml/ml乙酸的壳聚糖/乙酸水溶液剧烈搅拌，之后继续加入5ml浓度为5wt％戊二醛溶
液，搅拌交联，最后过滤，将固体干燥后制得纳米粒子；
38.将100ml牛初乳溶于100ml氯仿内搅拌混合，之后进行离心脱脂，离心后的上清液加入500ml无水乙醇搅拌混合40min，继续离心，收集上清液，最后将收集的上清液缓慢升温至70℃进行浓缩至无明显溶剂，将浓缩液在-20℃进行冷冻干燥20h，得到唾液酸寡糖；将2.5g唾液酸寡糖、30g纳米粒子加入到500ml超纯水混合，室温下搅拌处理22h，之后12000rpm下离心，收集的沉淀溶于pbs缓冲液中，得到糖功能化纳米粒子分散液。
39.经检测，上述实施例中制得的糖功能化纳米粒子用于流感病毒检测时的最低检测浓度为2-3nm，灵敏度高。
40.此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。