一种茶芎提取物的提取方法、胶囊剂及应用

1.本发明涉及中医药技术领域，特别涉及一种茶芎提取物的提取方法、胶囊剂及应用。


背景技术：

2.脑卒中，俗称“中风”，是一种突然起病的急性脑血管类疾病，具有高致残率、高致死率和高复发率等特点，是世界上的第二大死因。目前我国现存中风患者近700万，其中450万患者因中风丧失不同程度的劳动能力，甚至生活不能自理，致残率高达75％，因此，如何研制出用于治疗脑卒的药物显得尤为重要。
3.目前，国内用于治疗急性缺血性脑卒中(ais)的药物十分稀少，除抗血小板药、抗栓药外，能直接治疗ais的药物多年来也只有组织纤维溶媒原激活剂(t-pa)和丁苯酞，制备相对比较困难，制备成本也相对较高。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的是提供一种茶芎提取物的提取方法、胶囊剂及应用，旨在解决现有技术中的用于治疗缺血性脑卒中的制备困难和制备成本较高。
5.根据本发明实施例当中的一种茶芎提取物的提取方法，该方法包括：
6.将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液；
7.利用所述乙醇提取液蒸发除去乙醇，得到乙醇提取物浸膏；
8.将所述乙醇提取物浸膏与设定比例的水进行混合分散得到分散液，向所述分散液中加入乙酸乙酯进行萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液；
9.对所述乙酸乙酯萃取液进行分子精馏，获取其中的轻组分以得到茶芎提取物。
10.进一步地，上述茶芎提取物的提取方法，其中，所述将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液的步骤中，筛选的过筛网目数为20～60目。
11.进一步地，上述茶芎提取物的提取方法，其中，所述将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液的步骤中，所述乙醇为体积分数为75％～95％的乙醇水溶液，所述乙醇的用量为茶芎的5～9倍，回流提取温度为70℃～80℃，回流时间为1～2小时。
12.进一步地，上述茶芎提取物的提取方法，其中，所述将所述乙醇提取物浸膏与设定比例的水进行混合分散得到分散液，向所述分散液中加入乙酸乙酯进行萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液的步骤中，所述提取物浸膏与水的比例为1∶10，所述乙酸乙酯的体积为水体积的1～2倍。
13.进一步地，上述茶芎提取物的提取方法，其中，所述将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液的步骤中，所述乙醇回流
的次数为2～4次。
14.进一步地，上述茶芎提取物的提取方法，其中，所述将所述乙醇提取物浸膏与设定比例的水进行混合分散得到分散液，向所述分散液中加入乙酸乙酯进行萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液的步骤中，所述乙酸乙酯萃取次数为2～3次。
15.进一步地，上述茶芎提取物的提取方法，其中，对所述乙酸乙酯萃取液进行分子精馏，获取其中的轻组分以得到茶芎提取物的步骤中，所述分子精馏采用pope分子精馏。
16.本发明提出的茶芎提取物的提取方法，通过对新鲜茶芎进行粉碎筛选后利用乙醇进行回流过滤，再次进行蒸发去除乙醇后与水混合进行萃取然后进行分子精馏从而得到茶芎提取物，再整个提取过程中仅需要通过对天然植物茶芎进行回流萃取以及精馏即可获取到所需提取物，解决了现有技术中的用于治疗缺血性脑卒中的制备相对比较困难，制备成本也相对较高的问题。
17.本发明的另一个目的在于提供一种用于抗缺血性脑卒中的胶囊剂，所述胶囊剂按重量百分比包括以下组份：
18.泊洛沙姆188或β-环糊精、助流剂、润滑剂以及权利要求1至7中任一项所述的茶芎提取物的提取方法提取出的茶芎提取物。
19.进一步地，上述用于抗缺血性脑卒中的胶囊剂，其中，所述胶囊剂的内容物为固体分散体或包合物中的一种。
20.本发明的另一个目的在于提供一种上述的茶芎提取物的提取方法提取出的茶芎提取物在制备抗缺血性脑卒中药物中的应用。
附图说明
21.图1为本发明提出的第一试验例中各实验组斑马鱼脑缺血表型图；
22.图2为本发明提出的第二试验例中的茶芎提取物对大脑中动脉阻塞再灌注模型大鼠的脑缺血保护作用的示意图。
具体实施方式
23.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
24.此外，本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。在具体实施方式及权利要求书中，由术语“中的一者”连接的项目的列表可意味着所列项目中的任一者。例如，如果列出项目a及b，那么短语“a及b中的一者”意味着仅a或仅b。在另一实例中，如果列出项目a、b及c，那么短语“a、b及c中的一者”意味着仅a；仅b；或仅c。项目a可包含单个元件或多个元件。项目b可包含单个元件或多个元件。项目c可包含单个元件或多个元件。在具体实施方式及权利要求书中，由术语“中的至少一者”、“中的至少一种”或其他相似术语所连接的项目的列表可意味着所列项目的任何组合。例如，如果列出项目a及b，那么短语“a及b中的至少一者”或“a或b中的至少一者”意味着仅a；仅b；或a及b。在另一实例中，如果列出项目a、b及c，那么短语“a、b及c中的至少一者”或“a、b或c中的至少一者”意味着仅a；或仅b；仅c；a及b(排除c)；a及c(排除b)；b及c(排除a)；或a、b及c的全部。
项目a可包含单个元件或多个元件。项目b可包含单个元件或多个元件。项目c可包含单个元件或多个元件。
25.本发明针对现有技术中尚未存在制备简单高效的用于治疗缺血性脑卒中的药物，具体提出了一种茶芎提取物的提取方法，其中，该方法包括：
26.将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液；
27.利用所述乙醇提取液蒸发除去乙醇，得到乙醇提取物浸膏；
28.将所述乙醇提取物浸膏与设定比例的水进行混合分散得到分散液，向所述分散液中加入乙酸乙酯进行萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液；
29.对所述乙酸乙酯萃取液进行分子精馏，获取其中的轻组分以得到茶芎提取物。
30.在本发明一些实施例当中，所述将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液的步骤中，筛选的过筛网目数为20～60目，例如，20目、40目以及60目，在本发明一些较佳的实施例当中，筛网目数优选20目。
31.在本发明一些实施例当中，所述将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到乙醇提取液的步骤中，所述乙醇为体积分数为75％～95％的乙醇水溶液，例如，75％、85％以及95％，在本发明一些较佳的实施例当中，乙醇的体积分数优选95％；所述乙醇的用量为茶芎的5～9倍，例如，5倍、6倍以及7倍，在本发明一些较佳的实施例当中，乙醇的用量优选为茶芎的6倍；回流提取温度为70℃～80℃，例如，70℃、75℃以及80℃，在本发明一些较佳的实施例当中，回流提取温度优选为80℃；时间为1～2小时，例如1小时、1.5小时以及2小时，在本发明一些较佳的实施例当中，回流时间优选为1.5小时。
32.另外，在本发明一些可选的实施例当中，乙醇回流提取的次数为2～4次，优选为2次，具体的，将新鲜茶芎置于室温下阴干粉碎后筛选，加入设定量的乙醇回流后过滤沉淀物得到第一次乙醇提取液，再通过乙醇对上一次回流提取出现的滤渣进行回流提取，将两次回流提取的提取液进行合并得到最终的乙醇提取液。
33.在本发明一些实施例当中，所述将所述乙醇提取物浸膏与设定比例的水进行混合分散得到分散液，向所述分散液中加入乙酸乙酯进行萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液的步骤中，所述乙醇提取物浸膏与水的比例为1∶10，例如，1g提取物浸膏加入1～10ml水，其中，以每1g浸膏加入8ml水为佳；所述乙酸乙酯的体积为水体积的1～2倍。其中，优选为2倍；所述乙酸乙酯萃取次数为2～3次，其中优选为3次，具体的，将所述乙醇提取物浸膏与设定比例的水进行混合分散得到分散液，向所述分散液中加入乙酸乙酯进行萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液，将上一次分离出的水相再次进行萃取得到乙酸乙酯萃取液，再将该次分离出的水相进行萃取得到乙酸乙酯萃取液，最后将三次的乙酸乙酯萃取液进行融合得到最终的乙酸乙酯萃取液。
34.在本发明一些实施例当中，对所述乙酸乙酯萃取液进行分子精馏，获取其中的轻组分以得到茶芎提取物的步骤中，所述分子精馏采用pope分子精馏。
35.本发明另一方面还提出一种用于治疗缺血性脑卒中的胶囊剂，所述胶囊剂按重量百分比包括以下组份：
36.泊洛沙姆188或β-环糊精、助流剂、润滑剂以及上述的茶芎提取物的提取方法提取
出的茶芎提取物。
37.具体的，胶囊剂的内容物为固体分散体或包合物中的一种，在具体实施时，以制备固体分散体的胶囊剂为例，精密称取处方量泊洛沙姆188置于烧杯中，与70℃水浴使其成熔融状态，另称取处方量茶芎提取物，溶于适量无水乙醇中，在电动搅拌器不断搅拌下，将茶芎提取物乙醇溶液缓缓滴入载体溶液中，加入完毕后开始计时。搅拌2h后，取出继续搅拌冷却至室温，-80℃超低温冰箱冷冻12h，趁冷粉碎，过40目筛，晾干至无乙醇味即得茶芎提取物固体分散体。取茶芎提取物固体分散体约20g，加入1％微粉硅胶(助流剂)、0.5％硬脂酸镁(润滑剂)，混合均一后过60目筛，填充于胶囊内，得到茶芎提取物固体分散体胶囊剂。
38.以制备包含物胶囊剂为例，准确称取一定量的β-cd，加入200ml纯化水中，然后将其置于设定温度的水浴锅中，电动搅拌使其形成饱和水溶液。精密称取一定量茶芎提取物，溶于适量无水乙醇中，在搅拌下缓缓滴入饱和水溶液中，滴入完毕后开始计时。搅拌规定时间后，取出，继续搅拌至室温，置4℃冰箱中冷藏24h，趁冷抽滤，并用乙醚洗涤沉淀物3次，每次10ml。将沉淀物置于40℃鼓风干燥箱中干燥12h，取出过40目筛即得茶芎提取物包合物。取茶芎提取物包合物约20g，加入1％微粉硅胶(助流剂)、0.5％硬脂酸镁(润滑剂)，混合均一后过60目筛，填充于胶囊内，得茶芎提取物包合物胶囊剂。
39.本发明还提出一种上述茶芎提取物的提取方法提取出的茶芎提取物在制备抗缺血性脑卒中药物中的应用。作为补充的，上述的茶芎提取物在治疗缺血性脑卒中以及脑缺血保护中均具有应用价值。
40.下面以几个具体的实施例和试验例对本发明的技术方案进行更加详细的阐述。
41.实施例1
42.本实施例当中的茶芎提取物的提取方法包括如下步骤：
43.步骤1、取新鲜茶芎根茎，室温阴干，粉碎过20目筛；加入6倍量95％的乙醇，80℃下回流1.5小时，过滤收集提取液。
44.步骤2、取步骤1中所得的滤渣，加入6倍量95％的乙醇，80℃下回流1.5小时，过滤收集提取液。
45.步骤3、合并两次提取液，蒸发除去乙醇制备得到乙醇提取物浸膏。
46.步骤4、按照乙醇提取物浸膏与水1:10的比例加水分散，向分散液中加入水体积2倍的乙酸乙酯，混匀后静置萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
47.步骤5、将步骤4中分离的水相再次按步骤4萃取1次，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
48.步骤6、将步骤5中分离的水相再次按步骤4萃取1次，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
49.步骤7、合并三次萃取液采用pope分子精馏后，取轻组分即得茶芎提取物。
50.实施例2
51.本实施例当中的茶芎提取物的提取方法包括如下步骤：
52.步骤1、取新鲜茶芎根茎，室温阴干，粉碎过40目筛；加入7倍量85％的乙醇，70℃下回流2小时，过滤收集提取液。
53.步骤2、取步骤1中所得的滤渣，加入7倍量85％的乙醇，70℃下回流2小时，过滤收集提取液。
54.步骤3、合并两次提取液，蒸发除去乙醇制备得到乙醇提取物浸膏。
55.步骤4、按照乙醇提取物浸膏与水1:10的比例加水分散，向分散液中加入水体积1.5倍的乙酸乙酯，混匀后静置萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
56.步骤5、将步骤4中分离的水相再次按步骤4萃取1次，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
57.步骤6、合并三次萃取液采用pope分子精馏后，取轻组分即得茶芎提取物。
58.实施例3
59.本实施例当中的茶芎提取物的提取方法包括如下步骤：
60.步骤1、去新鲜茶芎根茎，室温阴干，粉碎过60目筛；加入9倍量75％的乙醇，80℃下回流1小时，过滤收集提取液。
61.步骤2、取步骤1中所得的滤渣，加入9倍量75％的乙醇，80℃下回流1小时，过滤收集提取液。
62.步骤3、合并两次提取液，蒸发除去乙醇制备得到乙醇提取物浸膏。
63.步骤4、按照乙醇提取物浸膏与水1:10的比例加水分散，向分散液中加入等体积的乙酸乙酯，混匀后静置萃取，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
64.步骤5、将步骤4中分离的水相再次按步骤4萃取1次，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
65.步骤6、将步骤5中分离的水相再次按步骤4萃取1次，分离水相得到乙酸乙酯萃取液。
66.步骤7、合并三次萃取液采用pope分子精馏后，取轻组分即得茶芎提取物。
67.试验例1
68.取按照实施例1、2、3制备茶芎提取物作为实验药物。
69.1、试验对象：黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼。
70.2、模型制作：普纳替尼以水溶给药方式处理正常2dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼，建立斑马鱼脑缺血模型。
71.3、确定茶芎提取物的最大检测浓度(mtc)：
72.在显微镜下挑选发育健康且阶段一致的受精后2天的(2dpf)黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔随机挑选30尾，每孔容量为3ml，用普纳替尼诱导斑马鱼建立脑缺血模型。分别水溶给予分别水溶给予“20190220-1”、“20190220-2”、“20190220-3”、“20190220-4”、“20190220-5”、“20190220-6”，浓度均为3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml；同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)与模型对照组，供试品处理20小时后观察记录斑马鱼的死亡情况及毒性表型，统计各实验组的斑马鱼死亡数量，确定6个供试品对斑马鱼的mtc。
73.4、评价供试品脑缺血改善作用：
74.在显微镜下挑选发育健康且阶段一致的受精后2天的(2dpf)黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔随机挑选30尾，每孔容量为3ml，用普纳替尼诱导斑马鱼建立脑缺血模型。分别水溶给予“20190220-1”、0.35、1.04和3.13μg/ml浓度；“20190220-2”0.35、1.04和3.13μg/ml浓度；“20190220-3”0.35、1.04和3.13μg/ml浓度；“20190220-4”1.39、4.17和12.5μg/ml浓度；“20190220-5”1.39、4.17和12.5μg/ml浓度；“20190220-6”1.39、4.17和12.5μg/ml浓度；阳性对照药阿司匹林50μg/ml浓度，同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)与模型对照组，置于28℃培养箱中培养20小时后，每组随机取10尾斑马鱼在显微镜下观察、拍照并保存图片；统计发生形成脑缺血的斑马鱼数目，计算每个实验组斑马鱼脑缺血的发生率；用fisher精确检验进行统计学分析，分别评价6个供试品对普纳替尼诱发的斑马鱼脑缺血的改善作用。
75.5.实验结果：
76.(1)“20190220-1”、“20190220-2”、“20190220-3”在25和50μg/ml浓度时，诱发100％斑马鱼死亡；在12.5μg/ml浓度时，诱发100％斑马鱼卵黄囊发黑、心胞水肿；在6.25μg/ml浓度时，诱发100％斑马鱼卵黄囊发黑；在3.125μg/ml浓度时，斑马鱼无明显异常，因此确定“20190220-1”、“20190220-2”、“20190220-3”对斑马鱼的mtc为3.125μg/ml。
[0077]“20190220-4”、“20190220-5”、“20190220-6”在50μg/ml浓度时，诱发100％斑马鱼死亡；在25μg/ml浓度时，诱发100％斑马鱼卵黄囊发黑、心胞水肿；在12.5μg/ml浓度时，斑马鱼无明显异常，因此确定“20190220-4”、“20190220-5”、“20190220-6”对斑马鱼的mtc为12.5μg/ml。
[0078]
具体如表1所示：
[0079]
表1
[0080][0081][0082]
(2)模型对照组斑马鱼脑缺血发生率100％(20/20)与正常对照组0％(0/20)比较p《0.001，说明斑马鱼脑缺血模型建立成功。阳性对照药阿司匹林50μg/ml浓度组斑马鱼脑缺血发生率35％(7/20)与模型对照组比较p《0.001，说明阿司匹林对脑缺血斑马鱼有明显的改善作用。
[0083]“20190220-1”、“20190220-2”、“20190220-3”在浓度为0.35、1.04和3.13μg/ml时，斑马鱼脑缺血发生率分别为55％(11/20)、30％(6/20)和35％(7/20)；与模型对照组100％(20/20)比较，0.35μg/ml浓度组p《0.01，1.04μg/ml浓度组p《0.001，3.13μg/ml浓度组p《0.001，说明“20190220-1”、“20190220-2”、“20190220-3”在浓度为0.35、1.04和3.13μg/ml时对斑马鱼脑缺血均具有明显的改善作用。
[0084]“20190220-4”、“20190220-5”、“20190220-6”在浓度为1.39、4.17和12.5μg/ml时，斑马鱼脑缺血发生率分别为75％(15/20)、55％(11/20)和25％(5/20)；与模型对照组100％
(20/20)比较，1.39μg/ml浓度组p《0.05，4.17μg/ml浓度组p《0.01，12.5μg/ml浓度组p《0.001，说明“20190220-4”、“20190220-5”、“20190220-6”在浓度为1.39μg/ml、4.17和12.5μg/ml时对斑马鱼脑缺血均具有改善作用。
[0085]
具体如图1所示，其中，20190220-1为茶芎提取物、20190220-2为z-藁本内酯、20190220-3为丁烯基苯酞、20190220-4为新蛇床内酯、20190220-5为正丁基苯酞、20190220-6为洋川芎内酯a。
[0086]
其中，各实验组对斑马鱼脑缺血的改善作用如表2所示：
[0087]
表2
[0088][0089][0090]
结果显示，根据实施例1至3以及试验例1可以明显看出，在本实验浓度条件下，供试品茶芎提取物及其五种有效成分对斑马鱼缺血性脑中风均具有明显的改善作用。
[0091]
试验例2
[0092]
按照实施例2的方法制备茶芎乙酸乙酯萃取部位。
[0093]
1、试验对象：健康雄性sd大鼠，体重230～260g。
[0094]
2、模型制作：采用线栓法制备大鼠中动脉阻塞模型(mcao)。大鼠用3％异氟烷诱导麻醉，1.5％异氟烷维持麻醉。仰卧于手术台上，沿颈中线切开皮肤，仔细分离右侧颈总动脉(cca)，颈外动脉(eca)，颈内动脉(ica)。将eca结扎剪断，拉直与ica成一直线，在eca上剪一小口，将硅酮树脂包被的硅化尼龙线由此开口插入ica约1.85-2.00cm，至大鼠大脑前动脉起始处，阻断大脑中动脉的血流供应。缝合手术切口，动物放回鼠盒。在大脑中动脉阻塞后2小时将栓线小心拔出，完成脑缺血后再灌注。全部过程中室温保持在23－25℃。
[0095]
3、给药方案及试验方法：实验共分为5组，每组10只动物，分别是：脑缺血模型组；
cx-3口服100mg/kg组；cx-6口服100mg/kg组；cx-4口服100mg/kg组。实验动物大脑中动脉阻塞后10分钟灌胃给药，给药体积为0.5ml/100g。茶芎提取物20100107-3(cx-3)、20100107-4(cx-4)、20100107-6(cx-6)；cx-3、cx-6用食用植物油配置成20mg/ml溶液，cx-4用cmc-na配置成20mg/ml溶液；
[0096]
4、神经行为学评分：于实验动物术后24小时进行动物的行为学观察。参照文献方法，提鼠尾离开地面约1尺，观察两前肢状况；将大鼠置于水平地面，推动其双肩，观察两侧抵抗力有无差异；大鼠置于地面，观察其行走情况。采用四级评分法(0-5分)，分数越高，说明其神经行为损伤越严重。
[0097]
1)行为完全正常为0分；
[0098]
2)提起鼠尾离开地面，手术对侧前肢内旋、内收者，为1分；
[0099]
3)大鼠至地面，用手挤压两侧检查其抗力，手术对侧抗力下降者，为2分；
[0100]
4)大鼠至地面，观察其行走，围绕手术对侧转圈者，为3分；
[0101]
5)损伤极其严重，已无法自主活动者，为4分。
[0102]
5、.脑梗塞体积的测定：实验动物神经行为学评分后，即刻断头取脑，去除嗅束、小脑和低位脑干，将其冠状切成6片(第一至第五片2mm/slice，第六片4mm)，迅速置于ttc溶液中染色(37℃，避光)20-30分钟，其间每隔5分钟翻动一次。经ttc染色后，正常组织深染呈红色，梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存。应用图象分析系统软件处理并统计，求算每片的梗塞面积，并最终叠加换算成梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，以消除脑水肿的影响。
[0103]
脑梗塞体积(％)＝(手术对侧半球的体积－手术侧半球未梗塞部分的体积)/手术对侧半球的体积
×
100％
[0104]
6、实验结果
[0105]
实验结果显示，大鼠大脑中动脉阻塞10分钟后口服给予nbp和cx-6100mg/kg可以显著减小实验动物的脑梗死体积，而对实验动物的神经行为学损伤则无改善作用(见表3和图2)
[0106]
实验结果显示，大鼠大脑中动脉阻塞10分钟后口服给予nbp和cx-6100mg/kg可以显著减小实验动物的脑梗死体积，而对实验动物的神经行为学损伤则无改善作用(见表3和图2)
[0107]
表3：
[0108][0109]
*p＜0.05，vs mcaomodol group
[0110]
结合上述表3和图2的数据可以明显看出，茶芎提取物灌胃给药100mg/kg对大脑中动脉阻塞再灌注模型大鼠具有显著的脑缺血保护作用。
[0111]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员
来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。