一种检测土壤溶液重金属铅离子的电化学传感器及其构建方法

1.本发明涉及环境分析技术领域，具体涉及一种检测土壤溶液重金属铅离子的电化学传 感器及其构建方法。


背景技术：

2.重金属铅离子(pb
2
)的毒性较强，即使在痕量水平也会对大脑、肾脏、血液、神经 等器官造成严重损害，而且其具有非生物降解性，一旦进入人体很难被排除。由于污水灌 溉、化肥农药滥用以及冶炼、化工等工业废渣、废液、废气不合理排放等，导致土壤重金 属污染严重。重金属铅会被农作物吸收，在动物体内积累，进而会在食物链的生物放大作 用下，成千百倍的富集进入人体，对人类健康造成严重危害。
3.近年来，由于重金属铅造成的污染事件屡次发生，土壤重金属污染信息的快速、准确 获取是土壤重金属污染监控和治理的基本要求。因此，开发一种快速、准确的土壤重金属 铅的检测方法，对土壤重金属污染治理和农产品安全保障具有重要意义。
4.目前常用的铅离子的检测方法有：电感耦合等离子体发射光谱、石墨炉原子吸收分光 光度法等。但需要复杂的土壤预处理、检测成本高、需要专业人员操作且仪器体积庞大， 无法用于土壤重金属的现场检测。
5.电化学分析方法具有仪器设备简单、样品需要量少、灵敏度高等特点，尤其适用于具 有电化学活性的物质的直接分析检测。重金属铅离子具有良好的电化学活性，目前用于测 定铅离子的电化学分析方法主要有极谱法、溶出伏安法和离子选择电极法等。但土壤中的 物质成分复杂，含有多种金属阳离子、阴离子以及丰富的有机质等，重金属的伏安信号易 受土壤中复杂成分的干扰，从而降低了电化学分析法对土壤溶液中重金属铅离子检测的灵 敏性和准确性。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术，在国家重点研发计划项目(2018yfc1801001)的支持下，本发 明提供了一种检测土壤溶液中重金属铅离子的电化学传感器及其构建方法。本发明通过在 基底电极上依次修饰fe/zif-8、纳米金颗粒(aunps)和pb
2 -dnazyme，构建能够特异 性检测土壤溶液中重金属铅离子的电化学传感器。本发明构建的电化学传感器抗干扰能力 强，能够在复杂的土壤环境中实现对重金属铅离子的特异性检测，而且检测灵敏度高、稳 定性强。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面，提供一种电化学传感器，所述电化学传感器以在基底电极表面依 次修饰有fe/zif-8、aunps和pb
2 -dnazyme的电极为工作电极。
9.优选的，所述基底电极为玻碳电极(gce)。
10.优选的，所述pb
2 -dnazyme包括底物链s1和酶链s2；所述底物链s1的核苷酸序 列
如seq id no.1所示；所述酶链s2的核苷酸序列如seq id no.2所示。具体如下：
11.底物链s1：5
’‑
hs-(ch2)
6-ss-(ch2)
6-tttcatctcttctccgagccggtcgaaatagt gagt-3’；(seq id no.1)
12.酶链s2：5
’‑
actcactatraggaagagatg-3’。(seq id no.2)
13.注：酶链s2中的“ra”表示的是rna碱基。
14.进一步的，所述电化学传感器还包括：参比电极和对电极。
15.本发明的第二方面，提供上述电化学传感器的构建方法，包括以下步骤：
16.(1)将fe/zif-8加入到n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，超声分散得到fe/zif-8悬浮液； 将fe/zif-8悬浮液滴加到预处理后的基底电极表面，干燥，得到fe/zif-8/gce电极；
17.(2)在fe/zif-8/gce电极上沉积纳米金颗粒，得到aunps/fe/zif-8/gce电极；
18.(3)将pb
2 -dnazyme的底物链s1与酶链s2进行温育反应，得到杂交后的混合液； 将混合液与三羧乙基膦(tcep)溶液混合，得到dnazyme混合液；将dnazyme混合液 滴加到aunps/fe/zif-8/gce电极表面，通过金硫键将dnazyme结合到电极上，用巯基 乙醇(mch)封闭未结合的作用位点，洗涤，干燥，制备得到工作电极 dnazyme/aunps/fe/zif-8/gce。
19.优选的，步骤(1)中，基底电极预处理的方法为：基底电极经打磨、浸泡、超声清 洗后，将其插入0.5m h2so4溶液中，以50mv/s在-0.4～0.8v范围进行循环伏安法扫描活 化，达到稳定状态；再将电极放置在含0.1m kcl和5.0mm fe(cn)
63-溶液中，测定峰位 差，保证在120mv以内。
20.优选的，步骤(1)中，fe/zif-8悬浮液中fe/zif-8的含量为0.5～1.5mg/ml；更优选 为1mg/ml。
21.优选的，步骤(2)中，将fe/zif-8/gce电极浸入0.1％的氯金酸溶液中，采用恒电位 法在fe/zif-8/gce电极上沉积纳米金颗粒。
22.优选的，步骤(3)中，温育反应的温度为37℃，时间为4min。
23.优选的，步骤(3)中，dnazyme混合液中脱氧核酶的浓度为1μm。
24.本发明的第三方面，提供上述电化学传感器在检测土壤溶液重金属铅离子的应用。
25.本发明的第四方面，提供一种利用上述电化学传感器检测土壤溶液中重金属铅离子的 方法，包括以下步骤：
26.(1)将上述电化学传感器的工作电极浸入到含有不同浓度铅离子的缓冲溶液中30 min，将电极取出，清洗干燥后再浸入到含0.1m kcl和5.0mm fe(cn)
63-溶液中，采用差 分脉冲伏安法在-0.2～0.6v范围进行扫描检测，建立差分脉冲伏安电流值的变化与铅离子 浓度的对数之间的线性方程；
27.(2)取待测土壤溶液，将电化学传感器的工作电极浸入到待测土壤溶液中30min， 将电极取出，清洗干燥后再浸入到含0.1m kcl和5.0mm fe(cn)
63-溶液中，采用差分脉 冲伏安法在-0.2～0.6v范围进行扫描检测，利用步骤(1)构建的线性方程对土壤溶液中重 金属铅离子的浓度进行检测。
28.本发明的有益效果：
29.本发明构建的电化学传感器检测灵敏度高，抗干扰能力强，土壤中的各阴、阳离子和 有机质对电化学传感器的检测基本不会造成干扰，能够特异性的检测土壤中的重金属
铅离 子，对土壤溶液中铅离子的检测限达10-13
m(3δ)。而且，本发明的电化学传感器对土壤溶 液中铅离子检测的重复性好，并具有良好的稳定性和较长的使用寿命。本发明对土壤重金 属污染快速检测与治理具有十分重要的意义。
附图说明
30.图1：pb
2 -dnazyme的二级结构(a)和工作电极表面pb
2 -dnazyme特异性识别pb
2
的反应过程(b)。
31.图2：不同掺杂比的fe/zif-8扫描电子显微镜图谱(1μm)；图中，(a)为按摩尔比 n(fecl2·
4h2o):n(zn(no3)2·
6h2o):n(2-甲基咪唑)＝1:1:8制备的fe/zif-8；(b)为按摩尔比 n(fecl2·
4h2o):n(zn(no3)2·
6h2o):n(2-甲基咪唑)＝0.75:1:8制备的fe/zif-8；(c)为按摩尔 比n(fecl2·
4h2o):n(zn(no3)2·
6h2o):n(2-甲基咪唑)＝0.5:1:8制备的fe/zif-8；(d)为按摩 尔比n(fecl2·
4h2o):n(zn(no3)2·
6h2o):n(2-甲基咪唑)＝0.25:1:8制备的fe/zif-8。
32.图3：zif-8(a)和fe/zif-8(b)的扫描电镜与能谱图。
33.图4：不同修饰电极的循环伏安图(a)和交流阻抗图谱(b)。
34.图5：不同修饰电极检测铅离子的差分脉冲伏安图谱。
35.图6：优化实验条件结果；(a)脱氧核酶浓度，(b)底物链s1与酶链s2杂交互补 配对时间，(c)脱氧核酶固定时间，(d)铅离子与dnazyme反应时间。
36.图7：铅离子浓度与差分脉冲伏安值之间的关系；(a)差分脉冲伏安图谱，(b)线 性拟合图。
37.图8：本发明制备的电化学传感器的抗干扰性能测试结果。
38.图9：本发明制备的电化学传感器的重复性(a)和再现性(b)测试结果。
具体实施方式
39.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有 指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。
40.如前所述，土壤成分复杂，含有有机质、多种金属阳离子和阴离子等，会对土壤溶液 中铅离子的检测造成一定的干扰。
41.基于此，在国家重点研发计划项目(2018yfc1801001)的支持下，发明人对土壤溶 液中重金属铅离子的检测进行了深入研究，开发设计了一种用于土壤溶液中重金属铅离子 检测的电化学传感器。
42.本发明电化学传感器是以玻碳电极为基底电极，首先将fe/zif-8滴涂在玻碳电极表 面，再继续电沉积纳米金，最后通过金硫键将pb
2 -dnazyme结合到电极上。
43.本发明的pb
2
检测机理为：在基底电极上依次修饰fe/zif-8和aunps，二者具有协 同作用，能够提供更多的活性位点，结合更多的pb
2 -dnazyme，提高电化学传感器的检 测性能；在电化学传感器最外面修饰的pb
2 -dnazyme是rna剪切型酶，酶链由催化中 心的识别区域和两侧的底物识别链构成。如图1(a)所示，pb
2 -dnazyme催化中心区域 含有茎-环结构和部分单链区域。3对碱基对组成了茎-环结构的茎部区域，最少需要两对 碱基对为g-c碱基
匹配。催化区域的环部结构含有3个单碱基，其序列要求为5'-agc-3'。 如果改变茎-环结构的碱基序列，酶链便会丢失催化活性。催化核心区域的部分单链结构 也有严格的要求，需要位于茎-环结构的3'-端，碱基序列为5'-a(t)cga(g)-3'或 5'-a(t)cgaa-3'。催化核心区域的两侧为底物识别序列，紧靠茎-环结构5'-端的核苷酸碱 基，需要与底物链形成g
·
t配对，否则会使酶链丧失酶活性。底物链的碱基序列内要存在 一个核糖核酸碱基(rna碱基)。在pb
2
的存在下，底物链可以在rna碱基(ra)发生断 裂。
44.采用[fe(cn)6]
3-作为指示剂，当溶液中存在铅离子时，pb
2
会特异性的与dnazyme 发生反应，如图1(b)所示，一部分dnazyme会发生断裂，减小了[fe(cn)6]
3-通过电极 修饰材料到达电极表面的阻力，极化电阻减小，此时采用差分脉冲伏安法进行检测，电流 值增大。根据检测前后伏安值的变化可直接对铅离子浓度进行检测。
[0045]
本发明所制备的电化学传感器具有灵敏度与准确度高、快速方便、稳定性及抗干扰能 力强等优点，对实现快速有效监控土壤溶液重金属离子浓度具有重要意义。
[0046]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的 实施例详细说明本技术的技术方案。
[0047]
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通 过商业渠道购买得到。
[0048]
实施例1：fe/zif-8的制备与表征
[0049]
1、zif-8的制备：
[0050]
取1.4875g zn(no3)2·
6h2o，溶于40.0ml甲醇中，混合均匀，得到溶液a；将3.284g 2
‑ꢀ
甲基咪唑溶于40.0ml甲醇中，混合均匀，得到溶液b；将溶液b逐滴加入溶液a中，磁力 搅拌混合1h，转移到高温高压反应釜内，加热至120℃并保持10h。反应结束冷却至室温， 将产物用甲醇离心洗涤3次至上清液澄清，置于真空干燥箱中80℃干燥，得到zif-8。
[0051]
2、fe/zif-8的制备：
[0052]
在制备得到zif-8的基础上，进一步对zif-8进行了金属离子掺杂。首先对中心金属离 子与有机配体的掺杂比进行了探究。制备不同掺杂比例[n(fecl2·
4h2o):n(zn(no3)2·
6h2o): n(2-甲基咪唑)＝1:1:8，0.75:1:8，0.5:1:8，0.25:1:8]的fe/zif-8材料，由扫描电镜可知，当fe
2
的掺杂量较高时，fe/zif-8复合材料结构容易塌陷，难以形成晶体(图2)。结合扫描电镜 可知，当n(fecl2·
4h2o):n(zn(no3)2·
6h2o):n(2-甲基咪唑)＝0.25:1:8时，fe/zif-8晶体呈正 八面体，棱角分明，因而选取此掺杂比。
[0053]
按优化后的掺杂比进行fe/zif-8的制备，具体如下：
[0054]
取1.4875g zn(no3)2·
6h2o和0.2485g fecl2·
4h2o于40.0ml甲醇中，转移至平底三口烧 瓶内，通入n2，混合均匀，得到溶液c；另取3.284g 2-甲基咪唑溶于40.0ml甲醇中，混合 均匀，得到溶液b。将溶液b逐滴加入溶液c中，磁力搅拌混合1h，转移到高温高压反应釜 中，加热至120℃并保持10h。反应结束冷却至室温，将产物用甲醇离心洗涤3次至上清液 澄清，置于真空干燥箱内80℃干燥，得到fe/zif-8。
[0055]
对上述制备的zif-8和fe/zif-8进行结构表征，由扫描电镜和能谱分析(图3)可知， zif-8为正八面体型，表面形貌均匀、形状规整，主要含c、n、o、zn元素。掺杂fe元素 后，fe/zif-8复合材料仍保持正八面体型，表面孔道疏松，主要元素为c、n、o、cl、fe、 zn，同时表明成功在zif-8材料中掺杂了铁元素。
位点，促进了对铅离子的特异性识别能力，提高了传感器灵敏度。而且负载纳米金后能够 促进电子的传递，增大了电流，aunps/fe/zif-8/gce修饰后电极的氧化峰电流为71.27μa， 与单独aunps修饰后的氧化峰电流值(71.44μa)相近。加入修饰材料后，电流值的变化 也从侧面说明传感器的构建过程是成功的。
[0068]
将dnazyme/aunps/gce、dnazyme/aunps/zif-8/gce和dnazyme/aunps/fe/zif
‑ꢀ
8/gce分别作为工作电极通过差分脉冲伏安法进行扫描测试，结果如图5所示。进一步证 明了经fe/zif-8和aunps共同修饰后，工作电极的差分脉冲伏安值增大，灵敏度升高， 可有效提高该电化学传感器对铅离子的检测效果。
[0069]
3、反应条件优化：
[0070]
所优化的反应条件包括：底物链s1与酶链s2杂交混合后形成的脱氧核酶的浓度、底物 链s1与酶链s2的杂交互补配对时间、脱氧核酶的固定时间、与铅离子的反应时间。
[0071]
设置脱氧核酶浓度分别为0.5μmol、0.75μmol、1μmol、1.25μmol、1.5μmol，由图6 (a)可知，当脱氧核酶的浓度为1μmol时，电流变化最为明显，因而选取探针脱氧核酶 的最佳浓度为1μmol。
[0072]
设置杂交互补配对时间分别为2min、3min、4min、5min和6min，由图6(b)可知， 采用4min的杂交互补配对时间，加入5
×
10
–5m pb
2
后电化学传感器的电流变化值最为显 著。
[0073]
设置固定化时间为15h、16h、17h、18h和19h，由图6(c)可知，17h为最优脱 氧核酶固定时间。
[0074]
设置铅离子与dnazyme反应时间分别为10min、20min、30min、40min和50min， 由图6(d)所示，最优反应时间为30min。
[0075]
综上，经优化后的工作电极的构建方法如下：
[0076]
以玻碳电极为基底电极进行修饰，依次用1μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末进行 打磨，然后在浓硫酸与双氧水的体积比为3:1溶液中浸泡5min，而后依次在无水乙醇和 超纯水溶液中超声3min进行洗涤，最后置于0.5m的h2so4溶液中，采用循环伏安法扫 描(-0.4～0.8v，50mv/s)活化，直至稳定。将电极放置在含0.1m kcl和5.0mm fe(cn)
63-溶液中(溶剂为0.1m pbs缓冲溶液(ph 7.4))，通过测定氧化峰与还原峰之间的峰差 值，保证在120mv以内。
[0077]
取实施例1制备的fe/zif-8材料加入到n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，超声1h得 到浓度为1.0mg/ml的fe/zif-8材料悬浮液。将5.0μl fe/zif-8材料悬浮液滴加到预处理 后的玻碳电极表面，通过滴涂法晾干得到fe/zif-8/gce电极。
[0078]
将fe/zif-8/gce电极浸入0.1％(质量浓度)的氯金酸溶液中，用恒电位法(-0.2v， 200s)电沉积纳米金，随后用超纯水冲洗，晾干得到aunps/fe/zif-8/gce电极。
[0079]
将pb
2 -dnazyme的底物链s1(5
’‑
hs-(ch2)
6-ss-(ch2)
6-tttcatctcttctccgagc cggtcgaaatagtgagt-3’)与酶链s2(5
’‑
actcactatraggaagagatg-3’)按体积 比1:1混合，在37℃水浴锅内温育4min，促进底物链s1与酶链s2的特异性结合，缓慢 冷却至室温，将杂交后的混合液与10mm的三羧乙基膦溶液(tcep)按体积比1:1混合 1h，得到dnazyme混合液。取10μl浓度为1μm的dnazyme混合液滴加至aunps/ fe/zif-8/gce电极表面，置于4℃的冰箱里通过金硫键结合17h。用tris-乙酸缓冲溶液缓 慢冲洗电极表面，氮气吹干，将工作电极末端浸入10mm的巯基乙醇(mch)溶液中3 0min，封闭未结合的作用位点，用tris-乙酸缓冲溶
液冲洗，并且用氮气吹干，得到工作 电极dnazyme/aunps/fe/zif-8/gce。
[0080]
实施例3：用于铅离子检测的电化学传感器的方法学考察
[0081]
1、铅离子检测方法：
[0082]
将实施例2经优化后制备的工作电极(dnazyme/aunps/fe/zif-8/gce)应用于铅离子 的检测分析，具体方法为：将工作电极浸入到待测液中30min，将电极取出清洗后再浸入 到含0.1m kcl和5.0mm fe(cn)
63-溶液中，采用差分脉冲伏安法(-0.2～0.6v)，利用三 电极体系(参比电极和对电极分别是饱和甘汞电极和铂电极)，在含0.1m kcl和5.0mmfe(cn)
63-溶液中扫描测试分析。检测完毕后用tris-乙酸缓冲溶液清洗，晾干，于4℃保存。 所有实验均设置三个平行，所得数据取平均值。
[0083]
2、线性及灵敏度考察：
[0084]
将实施例2经优化后制备的工作电极(dnazyme/aunps/fe/zif-8/gce)浸入到铅离子 浓度分别为5
×
10-5
m、5
×
10-6
m、5
×
10-7
m、5
×
10-8
m、5
×
10-9
m、5
×
10-10
m、5
×
10-11
m、 5
×
10-12
m的溶液中，按上述铅离子检测方法进行检测，构建差分脉冲伏安电流值的变化 与铅离子浓度的对数之间的线性方程。结果如图7所示。
[0085]
结果表明：在5
×
10-12
m～5
×
10-5
m浓度范围内，差分脉冲伏安电流值的变化与铅离 子浓度的对数呈线性关系：y＝-0.50198x 9.35349，其中，y为δdpv(μa)，x是铅离子 浓度的负对数值，相关系数r2＝0.99856，拟合效果较好；本发明构建的电化学传感器对铅 离子的检测限为10-13
m pb
2
(3δ)。
[0086]
3、抗干扰性能考察：
[0087]
为进一步验证本发明制备的电化学传感器的抗干扰性能，选取土壤溶液中典型存在的 阴、阳离子(k

、ca
2
、al
3
、po
43-、no
3-、co
32-、cl-)、有机质(柠檬酸、腐植酸) 及重金属离子(co
2
、cu
2
、ni
2
、zn
2
、cd
2
)对制备的电化学传感器进行抗干扰试验。
[0088]
分别加入5
×
10-12
m的pb
2
，5
×
10-10
m的co
2
、cu
2
、ni
2
、zn
2
、cd
2
、k

、ca
2
、 al
3
、po
43-、no
3-、co
32-、cl-、柠檬酸和腐植酸；以及用5
×
10-10
m的co
2
、cu
2
、ni
2
、 zn
2
、cd
2
、k

、ca
2
、al
3
、po
43-、no
3-、co
32-、cl-、柠檬酸和腐植酸配制的混合液(无 pb
2
混合液)；以及这些物质的混合物和5
×
10-12
m pb
2
的混合样(有pb
2
混合液)。采 用差分脉冲伏安法进行检测。
[0089]
检测结果图8所示，结果表明：加入各种阴离子、阳离子和有机质后，传感器δdpv 变化不大，对pb
2
检测结果基本无影响，说明各阴、阳离子和有机质对传感器的检测基本 不会造成干扰，表明经fe/zif-8和aunps修饰后传感器表面负载的dnazyme能够与pb
2
特异性反应，克服其它信号的干扰，特异性地检测土壤溶液中的pb
2
。
[0090]
4、重复性、稳定性及再现性考察：
[0091]
将本发明制备的铅离子检测电化学传感器采用差分脉冲伏安法连续测试4次，每次均 加入5
×
10-12
m铅离子，结果如图9(a)所示，其电流变化的相对标准偏差为1.667％，表明 该传感器具有较好的重复性。
[0092]
将制备好的工作电极每隔5天，采用差分脉冲伏安法对5
×
10-12
m铅离子进行检测， 经20天后，工作电极测得的δdpv值仍保持为初次测量值的93.58％，表明制备的传感器 具有良好的稳定性和较长的使用寿命。
[0093]
在相同的实验条件下，利用同样的制备方法，组建5个相互独立的工作电极，采用差 分脉冲伏安法对5
×
10-12
m的pb
2
进行扫描测试，检测结果如图9(b)所示，差分脉冲伏 安
法电流值变化的相对标准偏差为2.79％，表明制备的电化学传感器具有良好的再现性。
[0094]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人 员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。