一种耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因及其表达蛋白、重组载体、重组菌和应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因及其表达蛋白、重组载体、重组菌和应用。


背景技术：

2.半纤维素是仅次于淀粉和纤维素的一大类可再生资源，阿拉伯糖残基广泛分布于半纤维素中，如聚阿拉伯糖、阿拉伯聚半乳糖等。阿拉伯糖苷酶是一类从半纤维素中释放阿拉伯糖的辅助酶，与木聚糖酶存在协同作用，水解木聚糖非还原端的阿拉伯糖残基，以减少这些残基对木聚糖酶水解木聚糖时造成的空间阻碍；同时，木聚糖酶水解后产生的带有阿拉伯糖侧枝的寡聚糖经过阿拉伯糖苷酶脱侧枝后才能被木糖苷酶进一步分解为单糖，如木糖和阿拉伯糖。阿拉伯糖苷酶可以作为制备由降解半纤维素所产生低聚糖的工具以及达到提高纤维素质原料利用率的目的，因此可作为一种高效的工业酶制剂。
3.现有的阿拉伯糖苷酶在高温酸性环境下的酶解效率大多不尽如人意。如来源于aspergilus niger的阿拉伯糖苷酶最适温度为50℃，最适ph为6.0；来源于pseudopedobacter saltansde的阿拉伯糖苷酶最适温度为50℃；来源于b.longum b667的阿拉伯糖苷酶最适温度为45℃；来源于ruminiclostridium josui的阿拉伯糖苷酶最适温度为45℃；来源于c.thermocellum的阿拉伯糖苷酶最适温度为50℃。现有的工业生产中都需要在高温和酸性条件下导致阿拉伯糖苷酶资源在实际使用中受限严重，不能充分发挥在饲料发酵、食品添加剂的行业中的应用潜力。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因，其表达的蛋白在耐热耐酸性方面均有明显提高，可以在一些极端条件下进行半纤维素中阿拉伯糖基的酶解，从而运用于半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
5.本发明还提供所述耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因表达蛋白、重组载体、重组菌及其应用。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因，其特征在于，所述耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明所述用于扩增所述的耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因的引物，其特征在于，所使用的引物对为seq id no.3-4所示：
8.seq id no.3：tgctctagaatggctcctgaaatcagtgt
9.seq id no.4：ggcctcgagtcagtgatggtgatggtgatgtgatct
10.ttctacttctatca。
11.本发明所述的耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因的表达蛋白，所述表达蛋白为阿拉伯糖苷酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
12.其中，所述表达蛋白的衍生蛋白为序列seq id no.2中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯糖苷酶活性的衍生蛋白质。
13.本发明所述含有所述的耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因的重组载体。
14.本发明所述含有所述的耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因或者所述的重组载体的重组菌。
15.本发明所述的耐热耐酸阿拉伯糖苷酶基因在酶解半纤维素相关底物中阿拉伯糖苷的应用。
16.本发明所述的表达蛋白在酶解半纤维素相关底物阿拉伯糖苷中的应用。
17.其中，所述的半纤维素来源于植物细胞壁中。
18.其中，所述酶解反应温度为70-80℃，ph 4.5-6。
19.作为优选，所述酶解反应温度为80℃，ph 5。
20.其中，所述半纤维素相关底物为对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷。
21.本发明通过数据库比对，以pseudothermotoga thermarum dsm 5069阿拉伯糖苷酶序列中的保守序列作为骨架，选择氨基酸序列中非保守序列的无规则卷曲部分作为潜在的改造位点，根据模拟出的三维结构选择合适的位点，引入耐热氨基酸形成二硫键，优化酶内电荷的相互作用，刚化酶的活性中心，得到了一种性质更优良的酶。提高了酶的耐热、耐酸性，提高了最适温度、降低了最适ph，提升了酶活。
22.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
23.本发明提供的一种全新的阿拉伯糖苷酶基因，该经过改造的基因表达的蛋白为阿拉伯糖苷酶有极强的耐热性能和酸性ph条件下高活性的特性，在80℃、ph 5.0的条件下酶活性最高，比酶活达到56.07μmol/mg min；该酶在温度为70-85℃、ph为4.5-5.5的范围内，均具有较高的酶活。
24.本发明的阿拉伯糖苷酶的耐热性能极高，在70-85℃条件下的反应体系中，孵育1h酶活性保持80％以上；酶的耐酸性能好，在ph 4.5-7的范围内孵育1h酶活性保持80％以上。与改造前相比，该阿拉伯糖苷酶的比酶活提升约15％，耐热性能有明显提高由75℃提高到了80℃。上述特性使得本发明得到的阿拉伯糖苷酶比现有阿拉伯糖苷酶具有更大的优越性，适用于70-80℃以上高温、酸性ph条件下阿拉伯糖基的降解，可以运用于半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
附图说明
25.图1是阿拉伯糖苷酶tth ptara14的sds-page蛋白电泳图；
26.图2(a)是tth ptara14的最适温度结果图；
27.图2(b)是tth ptara14的最适ph结果图；
28.图2(c)是tth ptara14的热稳定性结果图；
29.图2(d)是tth ptara14的ph稳定性结果图。
具体实施方式
30.下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
31.以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
32.实施例1
33.阿拉伯糖苷酶基因tth ptara14的制备
34.以pseudothermotoga thermarum dsm 5069阿拉伯糖苷酶的氨基酸序列(seq id no.5)(ncbi编号：wp_013932416.1)为模版，其碱基序列为seq id no.6通过数据库比对得到阿拉伯糖苷酶的非保守位点作为潜在的改造位点；同时通过嗜热阿拉伯糖苷酶的氨基酸偏好性与引入优化分子内相互作用的策略，引入二硫键，优化酶内电荷的相互作用，刚化酶的活性中心；最后设定改造后酶的各项参数，进行改造。改造后的氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏好性，经过密码子优化，人工合成的方式制备tth ptara14基因，基因序列如seq id no.1所示。
35.实施例2
36.阿拉伯糖苷酶基因tth ptara14的亚克隆
37.用下述引物对pcr扩增实施例1中的阿拉伯糖苷酶基因：
38.tth-1：5
’‑
tgctctagaatggctcctgaaatcagtgt
39.tth-2：5
’–
ggcctcgagtcagtgatggtgatggtgatgtgatctttctacttctatca
40.上述引物合成时，tth-1引入bamhⅰ酶切位点，tth-2引入xbaⅰ酶切位点。
41.pcr反应体系：1μl p.thermarum dsm 5069基因组dna(购买自德国dsmz菌种保藏中心，提取总dna)，1μl tth-1，1μl tth-2，9.5μl ddh2o，12.5μl prime star hs dna polymerase。
42.pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30cycles；72℃延伸10min；12℃保温。
43.pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用pcr产物回收试剂盒进行纯化(biomiga，上海)。
44.实施例3
45.重组克隆、表达载体pet-28a-tth ptara14的构建与验证
46.将纯化的pcr产物(实施例2制备)、pet-28a(novagen)用分别xbaⅰ和xhoⅰ双酶切，琼脂糖电泳回收酶切pcr及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，加入1μl 10x ligase buffer和1μl ligase，于16℃连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌dh5α，然后涂于含100μg/ml kana(卡那青霉素)的培养皿，37℃培养10-15h。
47.从转化平板上挑取多个单菌落，采用biomiga的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pet-28a载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为1455bp)，进而得到重组克隆、表达载体pet-28a-tth ptara14，tth ptara14的dna序列如seq id no.1所示，其表达的蛋白(耐热耐酸阿拉伯糖苷酶)的氨基酸序列如seq id no.2所示，将该蛋白命名为tth ptara14。
48.实施例4
49.将重组克隆、表达载体pet-28a-tth ptara14(实施例3制备)热激转化至宿主菌e.coli bl21(de3)(novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5ml含有100μg/ml卡那青霉素的luria-bertani broth(lb)培养基，在37℃温度下，200rpm震荡培养4h。将上述4ml菌液接种于含800ml培养基的2000ml摇瓶中，37℃温度下，200rpm振荡培养，当吸光度达到0.4-0.6时，加入800μl的0.1m iptg，并在22℃温度下，150rpm诱导表达
15h。用高速冷冻离心机将培养液在4℃下以6000rpm离心10min，收集菌体。用50ml超纯水洗涤并在4℃下以6000rpm离心10min，回收菌体，接着用20ml binging buffer重悬(0.5m nacl，20mm tris-hcl，5mm imidazole，ph 7.4)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4℃下以10000rpm离心50min，得到含阿拉伯糖苷酶tth ptara14的粗提液。
50.粗提液使用ni-nta亲和层析柱进行纯化(方法见his-band kits，novagen)。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用sds-page方法进行，结果见图1，其中1表示200mm咪唑洗脱的纯化tth ptara14蛋白(作为纯酶液用于后续实验)。分子量约为56kda，与理论值相近。
51.实施例5
52.重组阿拉伯糖苷酶tth ptara14的酶学性质分析
53.酶活定义为：最适条件下，1min内酶解对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量为1u。
54.(1)最适温度
55.用ph值为5.0的50mm咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释10倍后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200μl，由5mg/ml对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷(sigma)溶液100μl，90μl ph 5.0的50mm咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和10μl稀释酶液组成；反应体系的ph为5.0。将反应体系在50-100℃(间隔梯度设置为5℃)温育10min后，加入600μl 1m na2co3终止反应，测定405nm的吸光值。以不添加稀释酶液进行酶促反应，相同处理条件下的混合液为空白对照。实验设3次重复，取平均值作图，研究的结果表明在80℃时，阿拉伯糖苷酶具有最高的酶活性，为56.07μmol/mg min；将此温度下的酶活反应体系的吸光值设为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性，结果如图2(a)所示。其中，在温度70-80℃的反应体系中酶活性较高。
56.(2)最适ph
57.用ph值为5.0的50mm咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释10倍后的酶液进行酶活测定。酶活性测定体系为200μl，由5mg/ml对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷溶液100μl，ph 4.0-8.5(间隔梯度设置为0.5)的90μl 50mm咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和10μl稀释酶液组成。将反应体系在80℃温育10min后，加入600μl 1m na2co3终止反应，测定405nm的吸光值，实验设三次重复试验，取平均值。以不添加稀释酶液进行酶促反应，相同处理条件下的混合液为空白对照。研究结果表明，在ph为5.0时，阿拉伯糖苷酶具有最高的酶活性，为56.07μmol/mg min；将此ph值下的酶活反应体系作为相对活性100％，其他ph值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性，结果如图2(b)所示。在ph 4.5-5.5条件下，酶活较高。
58.(3)重组酶热稳定性
59.用ph值为5.0的50mm咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释10倍后的酶液进行酶活测定。设定温度范围为70-100℃，每隔10℃设定一个温度梯度。酶活的反应体系设置为200μl，分别在离心管中加入10μl稀释10倍的纯化酶液与90μl 50mmol/l ph5的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液，置于不同温度梯度的恒温金属浴锅中分别保温0.5-2.0h(每隔0.5h设定一个时间梯度)，根据设置的不同保温时间分别取出后加入100μl 5mg/ml的对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷溶液，均于80℃水浴锅中反应10min，测
定405nm的吸光值。每组设置三个平行，以不添加稀释酶液进行酶促反应，相同处理条件下的混合液为空白对照，使用不经过保温的稀释酶液在80℃、ph 5条件下反应10min的酶活作为相对活性100％。研究结果显示，70℃处理1h未见酶活明显下降，结果如图2(c)，可见该阿拉伯糖苷酶在70-80℃条件下热稳定性比较好。
60.(4)重组酶ph稳定性
61.用ph值为5.0的50mm咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释10倍后的酶液进行酶活测定。设定ph范围为4.0-8.5，每隔0.5设定一个ph梯度。酶活的反应体系设置为200μl，分别在离心管中加入90μl浓度为50mmol/l不同ph的咪唑-邻苯二甲酸氢钾缓冲液和10μl稀释10倍的纯化酶液，在37℃的恒温金属浴锅中保温1h后，加入100μl 5mg/ml的对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷底物，置于80℃的水浴锅中反应10min，在od
405 nm下测定吸光度值。每组设置三个平行，以不添加稀释酶液进行酶促反应，相同处理条件下的混合液为空白对照。使用不经过ph调节的稀释酶液在80℃、ph5.0条件下反应10min的酶活作为相对活性100％。研究结果显示，70℃水浴1h后，ph 4.5-7.0缓冲体系中的酶活未见明显下降，结果如图2(d)，可见该阿拉伯糖苷酶在70℃，ph 4.5-6.5条件下耐酸性非常好。
62.同时采用上述方法对改造前的阿拉伯糖苷酶(模版序列按实施例2-4的方法制备)进行测定，其结果如表1所示。
63.表1 tth ptara14与改造前的阿拉伯糖苷酶相对比的结果
[0064][0065][0066]
由表1可知，本发明制备的阿拉伯糖苷酶与改造前相比，该阿拉伯糖苷酶的比酶活提升约15％，耐热性能有明显提高由75℃提高到了80℃，耐酸性提高到了ph为5；同时温度稳定性、ph定性等具有一定的提升，具有更好的工业应用价值。
[0067]
实施例6
[0068]
重组木聚糖酶tth ptara14对cmc-na、木糖、滤纸和对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷的特异性研究，其结果如表2所示。
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将重组木聚糖酶tth ptara14再分别作用于cmc-na、木糖、滤纸和对硝基苯酚-α-l-阿拉伯呋喃糖苷，(在最适ph温度下，按照实施例5体系进行测定)经实施例5中的酶活性测定实验后发现，该酶对cmc-na、葡聚糖和滤纸未见明显降解作用。可见该酶的特异性较高。
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表2重组阿拉伯糖苷酶tth ptara14对cmc-na、木糖、滤纸和对硝基苯酚-α-l-阿拉
伯呋喃糖苷的降解
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