通过抑制IL11活性增加癌细胞对肿瘤治疗场(TTFIELD)的敏感性的制作方法

通过抑制il11活性增加癌细胞对肿瘤治疗场(ttfield)的敏感性
1.相关申请的交叉引用本技术要求保护在2019年8月5日提交的美国临时申请62/882,813权益，其通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

2.肿瘤治疗场或ttfield是在中频范围(例如100-500 khz)内的低强度(例如1-3v/cm)交变电场，其抑制癌细胞生长。这种非侵入性治疗靶向实体瘤，并描述于美国专利7,565,205，其通过引用以其整体并入本文。ttfield被fda批准用于治疗成胶质细胞瘤(gbm)，并且可以例如经由optune
™
系统递送。optune
™
包括场发生器和两对换能器阵列(即电极阵列)，它们被放置在患者的剃光的头上。一对电极位于肿瘤的左侧和右侧，而另一对电极位于肿瘤的前面和后面。在临床前设置中，ttfield可以使用例如inovitro
tm ttfield实验室工作台系统体外施用。
附图说明
3.图1a-1b显示示例性研究的结果，证明在n1s1肝癌细胞中由150 khz的ttfield和索拉非尼的组合分别导致的肿瘤体积的倍数增加的降低和肿瘤体积的降低；图2显示用于评价纤维化的四种治疗条件(i、ii、ii和iv)的示例性ttfield治疗和给药方案；图3a显示经治疗的n1s1肝癌肿瘤的纤维化特异性mason三色(mt)染色(蓝色)的示例性组织病理学评价，其显示(1)原始图像(用于纤维化评分) (左上)，(2) mt染色的切片中纤维化的颜色分割，其中roi-蓝色代表纤维化(用于面积计算)，(3)没有纤维化的整个组织(用于面积计算，红色-曙红，左下)；和(4)组织外部的区域(右下)；图3b显示关于图3a所述实验的纤维化评分；图4显示由关于图3a所述实验计算的每种条件的纤维化面积(%)；图5显示由以上关于图3a所述的实验计算的表示为每种条件的倍数变化的纤维化面积；和图6a-6d显示以下之间的相关性：(1)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化评分与肿瘤体积之间的相关性(图6a)，(2)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化评分与肿瘤倍数变化之间的相关性(图6b)，(3)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化面积与肿瘤倍数变化之间的相关性(图6c)，和(4)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化面积与肿瘤体积之间的相关性(图6d)。


技术实现要素：

4.本发明的一个方面涉及降低癌细胞的生存力的第一方法。所述第一方法包括将交变电场施加到所述癌细胞，所述交变电场的频率在100 khz至500 khz之间；和抑制il11活性。
5.在所述第一方法的一些情况下，所述交变电场的频率在180 khz至220 khz之间。在所述第一方法的一些情况下，所述癌细胞包含成胶质细胞瘤细胞和肝细胞。
6.在所述第一方法的一些情况下，所述抑制il11活性包括降低il11表达、抑制il11信号传导、下调il11、中和il11和阻断il11受体中的至少一种。在所述第一方法的一些情况下，所述抑制il11活性包括给予il11拮抗剂、给予il11中和抗体和给予il11受体α (il11ra)中和抗体中的至少一种。
7.在所述第一方法的一些情况下，将治疗有效浓度的纤维化抑制剂给予所述受试者。在所述第二方法的一些情况下，所述给予所述纤维化抑制剂包括给予所述受试者法舒地尔、吡非尼酮、尼达尼布、氯沙坦、透明质酸酶、曲尼司特和维莫德吉中的至少一种。在一些情况下，将治疗有效浓度的至少一种广谱酪氨酸激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼和伊马替尼)给予所述受试者。
8.本发明的另一方面涉及降低活的受试者体内肿瘤体积的第二方法。所述第二方法包括向所述肿瘤施加交变电场，所述交变电场的频率在100 khz至500 khz之间；和给予所述受试者治疗有效浓度的il11抑制剂。
9.在所述第二方法的一些情况下，所述交变电场的频率在180 khz至220 khz之间。在所述第二方法的一些情况下，所述施加步骤的至少一部分与所述给予步骤的至少一部分同时进行。
10.在所述第二方法的一些情况下，所述给予所述il11抑制剂包括给予il11拮抗剂、给予il11中和抗体和给予il11受体α (il11ra)中和抗体中的至少一种。
11.在所述第二方法的一些情况下，所述给予所述il11抑制剂包括给予il13拮抗剂、给予il13中和抗体和给予il13受体α (il13ra)中和抗体中的至少一种。
12.在所述第二方法的一些情况下，将治疗有效浓度的纤维化抑制剂给予所述受试者。
13.在所述第二方法的一些情况下，给予所述受试者所述纤维化抑制剂包括给予法舒地尔、吡非尼酮、尼达尼布(pintedanib)、氯沙坦、透明质酸酶、曲尼司特和维莫德吉中的至少一种。
14.在一些情况下，所述第二方法进一步包括给予所述受试者治疗有效浓度的至少一种广谱酪氨酸激酶抑制剂(例如索拉非尼、舒尼替尼和伊马替尼)。所述肿瘤的肿瘤体积可以至少降低到约五分之一。
15.本发明的另一方面涉及降低位于活的受试者体内的癌细胞的生存力的第三方法。所述第三方法包括将交变电场施加到所述癌细胞，所述交变电场的频率在100 khz至500 khz之间；和给予所述受试者治疗有效浓度的纤维化抑制剂。
16.在所述第三方法的一些情况下，所述交变电场的频率在180 khz至220 khz之间。在所述第三方法的一些情况下，所述施加步骤的至少一部分与所述给予步骤的至少一部分同时进行。在所述第三方法的一些情况下，所述给予所述纤维化抑制剂包括给予所述受试者法舒地尔、吡非尼酮、尼达尼布、氯沙坦、透明质酸酶、曲尼司特和维莫德吉中的至少一种。
17.在所述第三方法的一些情况下，所述给予所述纤维化抑制剂包括给予所述受试者钙通道阻断剂。任选地，在这些情况的一些中，所述钙通道阻断剂包含非洛地平、维拉帕米、
地尔硫卓和硝苯地平中的至少一种。
具体实施方式
18.通常，大多数肿瘤具有比健康的周围组织更高的电导率。并且这种提高的电导率可以解释ttfield对恶性组织的特异性。更具体地，电场的功率损耗密度l定义为
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
等式(1)其中σ是组织的电导率，并且是电场的强度。(功率损耗密度以毫瓦/立方厘米为单位测量)。并且肿瘤组织内的升高的电导率σ在该特定组织内产生更高的功率损耗密度。
19.临床数据证明来自用ttfield治疗的gbm患者的肿瘤中il11 (白细胞介素-11)表达水平显著增加。数据如下获得。在根据标准放化疗方案(六名患者)或将ttfield与标准放化疗组合的方案(六名患者)治疗之前和之后获得gbm肿瘤样品。通过rna-seq进行基因表达分析。负二项广义线性模型用于分析治疗后的表达以及对照和ttfield治疗的差异作用。使用deseq2软件分析原始数据。使用放化疗和ttfield治疗组的每千碱基百万读数(rpkm)值计算差异基因表达分析。使用负二项广义线性模型进行统计分析。分别对每个个体导出治疗之前和之后表达之间的差异，并计算每个治疗组的平均净治疗作用。治疗作用之间的差异表示为ttfield和对照的平均净作用之间的倍数变化。使用benjamini-hochberg方法校正多重比较的倍数变化p值。使用一般文献，nanostring
ꢀ“
ncounter
® pancancer immune profiling panel”和thermofischer
ꢀ“
oncomine
tm immune response”基因列表，汇编了与免疫活性相关的712个基因的列表。
20.ttfield和对照治疗作用之间的显著差异定义为倍数变化》2或《0.5，其中校正的p值《0.1。下表呈现表现出显著改变的基因表达的基因。基因倍数变化f.d.rp值il118.50.001gpr185.90.071cd7050.079ccl264.50.031nkg2d4.20.034t-bet3.40.019icos-l3.30.094isg153.20.035fac.xii3.10.032hgf30.041gnly2.60.083mmp22.50.036
21.值得注意的是，ttfield 放化疗治疗对il11的表达的差异作用(与仅放化疗的对照相比)增加至8.5倍。不受下面阐述的操作理论的约束，il11的这种增加可以引起两个成问题的问题。
22.第一个成问题的问题是il11已知是纤维化因子。结果是，与施加ttfield相关的il11的增加可以在肿瘤组织内产生细胞外基质重塑和纤维化。因为纤维化导致细胞内和细胞外流体减少，纤维化组织通常具有比非纤维化组织更低的电导率。因此，通过il11促进的纤维化应(随时间)降低肿瘤中的电导率σ，这应进而通过等式(1)的运算来降低肿瘤中的功率损耗密度，从而降低ttfield的有效性。这种不利的事件链可以通过抑制il11活性而中断。更具体地，抑制il11活性降低纤维化，这允许电导率σ保持是高的，这允许功率损耗密度保持是高的，这允许ttfield的有效性保持是高的。
23.通过建立抑制il11已显示预防心脏和肾纤维化的实验支持了中断上述不利的事件链的预期的有效性。
24.第二个成问题的问题是肿瘤中的il11表达与侵袭性表型和在大量肿瘤中预后不良相关，所述肿瘤包括肝细胞癌、胰腺癌、胃腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和软骨肉瘤。
25.上述两个成问题的问题可以通过抵消当将肿瘤暴露于ttfield时发生的il11增加(例如通过抑制il11活性)而得到改善。
26.用于抑制il11活性的一些合适方法的实例包括：降低il11表达、抑制il11信号传导 (例如通过给予巴多昔芬)、下调il11、中和il11、阻断il11受体、给予il11拮抗剂(例如w147a)、给予il11中和抗体(例如enx108a、enx203或enx209)和给予il11受体α (il11ra)中和抗体。
27.抑制il11活性也可以通过抑制il11的刺激物或通过抑制il11受体α (il11ra)的刺激物来间接完成。例如，因为il13是il11和il11ra的有效刺激物，用于抑制il11活性的合适方法的另外的实例包括：降低il13表达、抑制il13信号传导、下调il13、中和il13 (例如通过给予dupilumab)、阻断il13受体、给予il13拮抗剂、给予il13中和抗体和给予il13受体α (il13ra)中和抗体。
28.鉴于上述内容，治疗肿瘤和降低癌细胞的生存力的一种方法是将ttfield施加到癌细胞并抑制il11活性。预期该方法通过改善上述两个成问题的问题而增加ttfield治疗的功效。在体内情境下，通过给予受试者治疗有效浓度的il11抑制剂可以完成il11活性的抑制。
29.用于治疗肿瘤和降低癌细胞的生存力的备选的方法是将ttfield施加到癌细胞并一般性地抑制纤维化。预期该方法通过改善上述第一个成问题的问题(不考虑是否改善上述第二个成问题的问题)来增加ttfield治疗的功效。更具体地，因为纤维化组织通常具有比非纤维化组织更低的电导率，由il11触发的纤维化应(随时间)降低肿瘤中的电导率σ，这应进而通过等式(1)的运算来降低肿瘤中的功率损耗密度，从而降低ttfield的有效性。这种不利的事件链可以通过使用用于抑制由il11触发的纤维化的不同的方法来抵消。
30.在一些实施方案中，使用以下药物中的至少一种来完成这一点：法舒地尔、吡非尼酮、尼达尼布、氯沙坦、透明质酸酶、曲尼司特和维莫德吉(其各自包含已知抑制纤维化的化合物)。在其它实施方案中，使用已知抑制纤维化的钙通道阻断剂(例如非洛地平、维拉帕米、地尔硫卓和/或硝苯地平)来完成这一点。在其它实施方案中，使用已知抑制纤维化的多种其它化合物中的任一种来完成这一点。
31.在一些实施方案中，使用既抗肿瘤发生又抗纤维化的至少一种化合物(例如索拉
非尼或任何合适的广谱受体酪氨酸激酶抑制剂(rtki)例如舒尼替尼和伊马替尼)可以完成这一点。在这方面，索拉非尼可以降低纤维化和降低肿瘤大小，改进肿瘤对ttfield治疗的反应。
32.如在依赖抑制il11活性来抑制纤维化的上述实施方案中，在这些实施方案中降低纤维化水平将允许电导率σ保持是高的，这允许功率损耗密度保持是高的，这允许ttfield的有效性保持是高的。
33.在体内情境中，通过给予受试者治疗有效浓度的纤维化抑制剂可以完成纤维化的抑制。
34.在体内情境中，给予癌细胞相关的一个或多个分子(例如il11抑制剂或纤维化抑制剂)可以从该一个或多个分子在患者体内循环(例如全身给药后)或引入癌细胞附近的第一时间(t1)连续发生，直到该一个或多个分子从患者体内消除或耗尽的时间(t2)。结果是，如果在t1和t2之间将ttfield施加到癌细胞，施加步骤将与给予步骤的至少一部分同时进行。可以使用多种方法中的任一种来进行给予受试者一个或多个分子，所述方法包括但不限于静脉内、口服、皮下、鞘内、肌内、心室内和腹膜内。并且可以使用novocure optune
®
系统或其以不同频率操作的变体来进行将交变电场施加到癌细胞。
35.在一些情况下，可以使用既抗纤维化又抗肿瘤发生的因子来降低纤维化。例如，已知ttfield和索拉非尼的组合协同地降低肝细胞癌n1s1细胞中的肿瘤体积。参见美国专利申请公开2020/0016067；图1。如在图1中所示，ttfield和索拉非尼的组合导致肿瘤体积至少降低到十分之一。
36.关于单独的ttfield和与索拉非尼组合的ttfield对n1s1肿瘤中纤维化的影响，评价了其作用。相对于单独的ttfield，与索拉非尼组合的ttfield显著降低了纤维化评分，如由病理学家评价的。图3a-3b。通过面积百分比和倍数变化测量肿瘤的纤维化面积，并且显示纤维化的类似降低。图4-5。
37.在ttfield治疗的肿瘤中，肿瘤倍数变化(图1a)和肿瘤体积(图1b)的降低与纤维化评分(图6a-6b)的增加相关。肿瘤倍数变化和肿瘤体积的降低与纤维化面积的增加相关(图6c-6d)。
38.总之，ttfield可以与抗il11和/或另外的抗纤维化剂和可以协同降低肿瘤体积的药剂组合。在一些情况下，索拉非尼可以用于降低肿瘤体积，并且还用作如本文所述的抗纤维化剂。
39.如本文所用的术语“降低癌细胞的生存力”是指降低癌细胞的生长、增殖或存活。在一些方面，降低癌细胞的生存力包括降低癌细胞的产克隆存活，增加癌细胞的细胞毒性，诱导癌细胞的凋亡，以及降低由至少一部分癌细胞形成的肿瘤的肿瘤体积。
40.术语“产克隆存活”是指单个癌细胞生长为癌细胞集落的能力。在一个方面，“集落”是至少五十个细胞。
41.术语“细胞毒性”是指药物或治疗杀死细胞的能力的量度。
42.术语“凋亡”是指称为“程序性细胞死亡”的现象，程序性细胞死亡是指作为细胞生长和发育的受控细胞周期的一部分的细胞死亡。
43.如本文所用的术语“治疗有效浓度”是指足以实现其预期目的(例如，抑制il 11活性、抑制纤维化等)的相关化合物的浓度。
实施例
44.实施例1—ttfield (150 khz)/索拉非尼组合导致体内肿瘤体积的显著降低如在图1a和图1b和美国专利申请公开2020/0016067 (在此通过引用以其整体并入本文)中所示，150 khz的ttfield和索拉非尼的组合显著降低在n1s1肝癌细胞中肿瘤体积的倍数增加。通过mri确定肿瘤体积。图1a和图1b显示下面描述的体内研究的结果，该研究是关于在用热、单独的ttfield、单独的索拉非尼以及ttfield和索拉非尼的组合治疗的sprague dawley大鼠的n1s1肿瘤体积。在该实验中，在第6天(治疗开始前的一天)和第14天(治疗结束后的一天)使用mri测量肿瘤的体积；和在图1a中的每个数据点代表在第14天的肿瘤体积除以在第6天的肿瘤体积。因此，大于1的数字代表肿瘤体积的生长，而小于1的数字代表在第6天和第14天之间缩小的肿瘤。在该图中，“*”代表p《0.1，“**”代表p《0.01，并且“****”代表p《0.0001。如在图1中所示，在用ttfield (2.86 v/cm)和索拉非尼(10mg/kg/天)的组合治疗后，肿瘤体积协同降低。图1b代表肿瘤的体积。
45.实施例2—纤维化和ttfield治疗通过i.p.注射氯胺酮(75 mg/kg)和赛拉嗪(10 mg/kg)使8周龄雄性sd大鼠(envigo ltd, 以色列)麻醉(图2)。在失去姿势反射后，使用修剪器从上腹部区域去除毛皮。将肝的左叶手术暴露，并用带有31号针头的注射器将10μl在等体积的无血清培养基和基质胶(corning, bedford, ma)中含有50,000个n1-s1肝细胞癌细胞的细胞悬浮液直接注射到左叶中。使用外科缝合线闭合腹膜和腹肌切口，并用夹子闭合皮肤。让大鼠恢复6天。
46.在第6天，所有动物经历第一次mri扫描，并随机分成以下治疗组：第i组—用假加热电极和媒介物注射治疗大鼠。
47.第ii组—用150 khz ttfield和媒介物注射治疗大鼠。
48.第iii组—用10mg/kg/天索拉非尼治疗大鼠。
49.第iv组—用150 khz ttfield和10 mg/kg/天索拉非尼治疗大鼠。
50.在第7天，将电极(ttfield或假加热)放置在动物上。用ttfield或假加热治疗动物6天。索拉非尼或对照媒介物在6天治疗中的5天通过ip注射给予。在第13天，去除所有电极，并且在第14天对动物进行第二次mri并处安乐死。基于肿瘤移植后第7天和14天的mri扫描确定肿瘤体积。mri系统是放置在公司的动物设施内的在1特斯拉下工作的bruker icon系统。用异氟烷麻醉动物并使其俯卧放置在大鼠身体线圈中。在定位器图像之后，用rare序列和以下参数扫描t2加权冠状解剖图像：tr/te 1900/51 ms，切片数量10，切片厚度1mm，fov 55-65 mm，采集矩阵140，8个平均值，采集时间4分18秒。使用itk-snap版本3.6.0-无rc1软件通过肿瘤的人工分割测量肿瘤体积。(t-测试；*p《0.05，**p《0.01，和***p《0.001) (图1)。
51.收获肿瘤，用于使用半定量评价量表组织学评价纤维化的等级。将石蜡块切成约4微米厚。将切片放在载玻片上，并用苏木精和曙红(h&e)和梅森三色(mt)染色。使用评分等级量表和数字形态测定，分析梅森三色染色的切片的纤维化。
52.由一个病理学家检查h&e染色的切片，并通过半定量评分系统对病理变化的存在进行评分(图3和图3a)，如下：等级0：无纤维化迹象等级1：非常轻微的纤维化迹象
等级2：轻微的纤维化迹象等级3：中等纤维化迹象等级4：高纤维化等级等级5：极高纤维化等级如在图3中证明的，使用l*a*b*颜色空间，利用基于matlab颜色的分割，进行蓝色染色区域(mt：纤维化)的颜色分割。从cie xyz三刺激值导出l*a*b*颜色空间。l*a*b*空间由光度
‘
l*’或亮度层、指示当颜色沿红绿轴下降的色度层
‘
a*’和指示当颜色沿蓝黄轴下降的色度层
‘
b*’组成。
53.实施例3—形态测定(纤维化面积倍数变化，纤维化面积百分比)如在图4中所示计算整个组织(图3：右上 左下)的染色区域(图3：右上)的百分比。
54.纤维化百分比的形态测定显示，在接受单独的ttfield的大鼠肿瘤中纤维化面积最高(相对于对照增加34%)，而在接受单独的索拉非尼(抗纤维化)的大鼠肿瘤中纤维化面积最低(相对于对照降低30.4%)。
55.与对照组相比，ttfield和索拉非尼的组合治疗导致纤维化面积降低20.8%。这些结果总结于“纤维化面积(倍数变化)
”ꢀ
(图5)中。纤维化面积的百分比变化总结于图4中。
56.实施例4—以肿瘤体积降低和纤维化增加测量的对ttfield反应的相关性图6a-6d显示以下之间的相关性：(1)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化评分与肿瘤体积之间的相关性(图6a)，(2)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化评分与肿瘤倍数变化之间的相关性(图6b)，(3)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化面积与肿瘤倍数变化之间的相关性(图6c)，和(4)在ttfield治疗的肿瘤中纤维化面积与肿瘤体积之间的相关性(图6d)。不受理论束缚，据信降低与ttfield治疗相关的纤维化使肿瘤对用单独的ttfield以及与il 11抑制剂、纤维化抑制剂或抗肿瘤发生因子/纤维化抑制剂(例如索拉非尼)组合的治疗更敏感。
57.尽管已经参考某些实施方案公开了本发明，在不背离如所附权利要求中限定的本发明的领域和范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行许多修改、变更和改变。因此，旨在本发明不局限于所描述的实施方案，而是具有由所附权利要求的语言及其等同物限定的全部范围。