一种检测喹乙醇的电化学免疫传感器及制备方法

1.本发明涉及新型功能纳米材料、免疫分子和生物传感检测技术领域，具体是指一种检测喹乙醇的电化学免疫传感器及制备方法。


背景技术：

2.喹乙醇(olaquindox,ola)又称喹酰胺醇，属喹噁啉类药物，于1965年联邦德国 bayer公司首次研制成功。ola具有广谱抗菌作用和提高蛋白同化作用，因而常作为抗菌促生长剂，被广泛用于犊牛、猪、禽、鱼类等的饲料添加剂。但是随着ola在养殖业中大剂量、长时间的使用，动物中毒甚至死亡的事件频频出现，为此很多学者对ola的毒性作用重新做了研究和评估，发现该药具有一定的毒副作用，其蓄积毒性不但可使动物中毒或死亡，而且有致畸性、致突变性和致癌性。ola使用导致的残留直接或间接进入人体，将对人体产生不可逆的危害。为确保食品安全和人类健康，国家农业部于2018年1月11日发布第2628号公告，决定停止在食品动物中使用喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂3种兽药。尽管如此，由于ola促生长效果好，价格便宜，仍旧受到养殖户的青睐，因此，建立ola的残留检测方法，用于快速检测和批量筛查，对其进行残留监控十分必要。
3.目前，ola的检测和分析方法多种多样。最常用的方法是色谱法，包括超高效液相色谱法(uplc)、高效液相色谱串联质谱法(hplc-ms/ms)和气相色谱质谱法(gc-ms)等。虽然色谱法具有较低的检出限和较高的准确度，但该方法需要复杂的预处理过程、昂贵的仪器设备和专业的操作人员，阻碍了它在快速检测中的应用。
4.免疫分析法由于特异性强、灵敏度高、分析容量大等特点，已成为快速检测添加剂残留的首选方法。目前对ola快速检测的研究主要集中在传统的酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法，而电化学免疫分析法的研究相对较少。电化学免疫传感器结合了免疫分析的特异性和电化学传感器技术的敏感性，具有灵敏度高、选择性好、成本低、可用于复杂系统的监测等优点。所以亟需研究一种利用电化学免疫传感器对ola快速检测的方法。


技术实现要素：

5.本发明要解决上述技术问题，提供一种检测喹乙醇的电化学免疫传感器及制备方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
7.一种检测喹乙醇的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.(1)基础电极预处理；
9.(2)制备go-pei-ag-nf复合溶液，将所述复合溶液滴于步骤(1)预处理后的基础电极上，干燥；
10.(3)将步骤(2)获得的电极浸于氯金酸溶液中，采用恒电位沉积法沉积金纳米粒子，
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0.2v恒电位沉积20-100秒，冲洗电极表面，晾干，获得修饰电极；
11.(4)将抗喹乙醇单克隆抗体溶液滴涂于修饰电极上，进行孵育，孵育结束后冲洗电
极表面，晾干，然后取牛血清白蛋白溶液滴涂于修饰电极上，牛血清白蛋白溶液质量浓度为0.25％，进行孵育，孵育结束后冲洗电极表面，晾干，得检测喹乙醇的修饰电极。
12.采用以上结构后，本发明具有如下优点：
13.1.本发明提供了一种用于检测喹乙醇的电化学免疫传感器，具有检出限低，线性检测范围宽，灵敏度高，操作简便等优势，对于饲料中喹乙醇的高灵敏度和高选择性定量检测有一定的实际应用前景。
14.2.本发明将go-pei-ag-nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，银纳米粒子不仅具有优良的导电性能，还能作为检测电化学信号的氧化还原探针，不需要额外加入氧化还原探针，从而制备了一种免标记的电化学免疫传感器，简化了电化学免疫传感器的制备过程。
15.3.本发明将go-pei-ag-nf纳米复合材料作为电化学免疫传感器的基底材料，金纳米粒子不仅能高效的固定单克隆抗体，还能加快电化学免疫传感器敏感界面的电子转移，从而提高电化学免疫传感器的灵敏性。
16.作为改进，所述的基础电极为金电极。
17.作为改进，所述的基础电极预处理为：依次用1微米、0.3微米、0.05微米的三氧化二铝抛光粉打磨至镜面，然后在无水乙醇或去离子水中超声3-8分钟，氮气吹干。
18.作为改进，所述的go-pei-ag-nf复合溶液制备方法，包括以下步骤：
19.(a)go-pei溶液的制备
20.(b)将葡萄糖于搅拌状态下加入上述溶液中，氧化石墨烯与葡萄糖的质量比1∶(3-7)，获得溶液a；
21.(c)将质量分数为0.28％的氨水加入到5-8ml浓度为0.06-0.15m的硝酸银溶液中，获得溶液b；
22.(d)将溶液b缓慢加入到溶液a中，磁力搅拌8-10分钟后室温静置1-2小时得到溶液 c；
23.(e)将溶液c于转速10000-13000转/分钟的条件下，离心3-6分钟，弃上清液获得沉淀，用去离子水洗涤沉淀，直至洗涤液ph为中性，然后将沉淀于50℃-80℃干燥12-24小时，即得go-pei-ag纳米材料；
24.(f)将步骤(e)获得的go-pei-ag纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，依次加入去离子水和质量浓度为0.4％的全氟磺酸溶液，配成1.5mg/ml的go-pei-ag-nf溶液，所添加的去离子水与全氟磺酸溶液的体积比为(1-4)：1。
25.作为改进，(a)将氧化石墨烯溶于水中并超声分散1-5小时，再将等体积的浓度为 5-20mg/ml的pei逐滴加入得到的go溶液中，超声分散10-30分钟。
26.(b)调节(a)所得溶液的ph至8后，依次向溶液中加入0.02g,0.04g的edc.hcl并分别超声10-30分钟。
27.(c)将(b)所得溶液30℃磁力搅拌24小时，然后在转速10000-13000转/分钟的条件下，离心3-6分钟，弃上清液获得沉淀，用去离子水洗涤沉淀2-3次，收集沉淀；
28.(d)用5ml的去离子水溶解(c)收集的沉淀，并超声30分钟即得go-pei溶液。
29.作为改进，步骤(3)中所述的氯金酸溶液为质量浓度1.0％haucl4与0.5m h2so4按照体积比1∶30混合制成。
c；
51.(e)将溶液c于转速10000-13000转/分钟的条件下，离心3-6分钟，弃上清液获得沉淀，用去离子水洗涤沉淀，直至洗涤液ph为中性，然后将沉淀于50℃-80℃干燥12-24小时，即得go-pei-ag纳米材料；
52.(f)将步骤(e)获得的go-pei-ag纳米材料用玛瑙研钵研成粉末，依次加入去离子水和质量浓度为0.4％的全氟磺酸溶液，配成1.5mg/ml的go-pei-ag-nf溶液，所添加的去离子水与全氟磺酸溶液的体积比为(1-4)：1。
53.所述的go-pei溶液的制备方法，包括以下步骤：
54.(a)将氧化石墨烯溶于水中并超声分散1-5小时，再将等体积的浓度为5-20mg/ml的 pei逐滴加入得到的go溶液中，超声分散10-30分钟。
55.(b)调节(a)所得溶液的ph至8后，依次向溶液中加入0.02g,0.04g的edc.hcl并分别超声10-30分钟。
56.(c)将(b)所得溶液30℃磁力搅拌24小时，然后在转速10000-13000转/分钟的条件下，离心3-6分钟，弃上清液获得沉淀，用去离子水洗涤沉淀2-3次，收集沉淀；
57.(d)用5ml的去离子水溶解(c)收集的沉淀，并超声30分钟即得go-pei溶液。
58.步骤(3)中所述的氯金酸溶液为质量浓度1.0％haucl4与0.5m h2so4按照体积比1∶ 30混合制成。
59.一种检测喹乙醇的方法，所述的工作电极为步骤(4)中检测喹乙醇的修饰电极，包括以下步骤：
60.(s1)工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在pbs缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对喹乙醇进行电化学测量，得出所述电化学免疫传感器对喹乙醇的拟合线性回归方程；
61.(s2)工作电极与参比电极和对电极构成三电极体系，在pbs缓冲溶液中采用差分脉冲伏安法对将待测样品进行电化学测量，并利用步骤(s1)的拟合线性回归方程即可计算出待测样品中喹乙醇的浓度。
62.步骤中(s1)中所述的喹乙醇的浓度为0.01-150ng/ml，所述的参比电极为饱和甘汞电极，所述的对电极为铂丝电极。
63.所述的检测喹乙醇的修饰电极的制备方法制得的检测喹乙醇的修饰电极，以及该修饰电极在检测喹乙醇中的应用。
64.实施例一：
65.(1)go-pei-ag-nf纳米复合材料的制备
66.称取10mg氧化石墨烯粉末溶于20ml去离子水并超声2小时得到分散均匀的go溶液，向 go溶液中逐滴加入20ml浓度为10mg/ml的聚乙烯亚胺溶液，超声20分钟后调节溶液的ph 至8，再依次向溶液中加入0.02g和0.04g的edc.hcl并分别超声20分钟，将所得溶液置于磁力搅拌器上30℃搅拌24小时。然后以12000转/分钟的转速离心5分钟，重复2次，以相同转速水洗3次，收集沉淀，向收集的沉淀中加入5ml去离子水并超声30分钟即得go-pei 溶液。按照氧化石墨烯与葡萄糖质量比为1：5的比例向得到的go-pei溶液中加入葡萄糖。将2.8％的氨水缓慢加入到5ml 0.09m的硝酸银溶液中至沉淀突然消失，制得新鲜的银氨溶液。将制得的银氨溶液加入到含有go-pei和葡萄糖的溶液中，搅拌10分钟后室温静置1.5小
时。然后以12000转/分钟的转速离心5分钟，重复2次，以相同转速水洗3次，收集沉淀，将所得沉淀置于60℃烘箱中干燥24小时。用玛瑙研钵将干燥后的沉淀研成粉末，称取6mg粉末，首先向粉末中加入3ml的去离子水并超声1小时，然后再向上述溶液中加入1ml的全氟磺酸并超声1小时，即得go-pei-ag-nf纳米材料。
67.(2)bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极的构建
68.金电极修饰前，先依次用1微米、0.3微米和0.05微米的三氧化二铝粉进行抛光，然后用无水乙醇和去离子水分别超声2分钟，得到镜状表面，用氮气吹干。
69.取9μl上述(1)制得的go-pei-ag-nf滴在经过预处理的电极表面，在室温下干燥，即到go-pei-ag-nf修饰电极。
70.将go-pei-ag-nf修饰电极浸于氯金酸溶液中，-0.2v恒电位沉积60秒，冲洗电极表面，晾干，即得aunps/go-pei-ag-nf修饰电极。
71.在aunps/go-pei-ag-nf修饰电极表面滴加20μl抗喹乙醇单克隆抗体，37℃孵育1小时，孵育结束后冲洗电极表面除去未结合的抗体，即得anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极。
72.在anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极表面滴加20μl牛血清白蛋白溶液滴，37℃孵育30分钟，孵育结束后冲洗电极表面，即得bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极，在4℃保存。
73.(3)标准曲线与检测限的测定
74.配制浓度分别为0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、1.25ng/ml、6.30ng/ml、31.60ng/ml、 150ng/ml的ola标准溶液，备用。
75.以bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极为工作电极，该工作电极先分别与不同浓度的ola标准溶液在37℃下孵育75分钟，形成ola/bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf 修饰电极，然后该工作电极与铂丝电极(对电极)和饱和甘汞电极(参比电极)搭配构建三电极体系，以pbs溶液作为检测液，构建电化学免疫传感器。
76.以差分脉冲伏安法得到电流信号。其原理是：在bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极表面孵育ola，ola与抗ola单克隆抗体特异性结合形成免疫复合物，形成的免疫复合物会阻碍电子传递，降低电流信号，而且降低的电流信号强度在一定范围内与ola的浓度成正比。
77.在37℃条件下，利用构建的传感器检测不同浓度的ola获得电流信号。以 bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极的电流信号值为空白值，以 ola/bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极的电流信号值为检测值，计算空白值与检测值的差值(δi)，以ola浓度的对数为横坐标，以该电流差值为纵坐标，作图得到标准曲线(见图3)。
78.由标准曲线可知，电流信号的差值与ola浓度的对数成正比，其线性关系为δi＝ 20.12lgc
ola
46.75(r2＝0.993)。
79.对空白值进行多次测定，计算空白值的相对标准偏差，根据公式：检测限＝3
×
空白的标准偏差/标准曲线的斜率，计算得出该电化学免疫传感器的检测限为4.7pg/ml。
80.实施例二
81.样品测试溶液的制备：将不含ola的饲料研磨成粉末后过60目筛子，称量5.0g饲料粉末置于50ml离心管中，再分别向其中添加ola标准溶液，使其添加量相当于0.1μg/kg、
10.0 μg/kg、50.0μg/kg和100.0μg/kg。将所有样品放冰箱中避光过夜，使ola与样品充分混合。分别向离心管中加入30ml的5％甲醇提取液，置于摇床振荡1小时进行提取，然后以8000 转/分钟的转速离心10分钟，收集上清。再分别向离心管中加入15ml的5％甲醇提取液，操作同上，收集两次上清液。向上述收集的上清液中加入10ml正己烷，混合均匀后，以8000 转/分钟的转速离心10分钟，弃去油脂层，然后再加入10ml正己烷，重复上述操作。将上述提取液加入圆底烧瓶中，旋转蒸发。最后，用5ml的pbs溶液将残留物充分溶解，用于电化学免疫传感器方法的测定。
82.将实施例一步骤(2)制备的bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极分别与含有不同浓度ola的饲料样品在37℃下孵育75分钟，然后将该修饰电极取出，以其为工作电极，与铂丝电极和饱和甘汞电极搭配构建电化学免疫传感器。
83.将上述工作电极、铂丝电极和饱和甘汞电极浸入pbs检测液中，利用差分脉冲伏安法进行检测，以得到的电流信号作为检测值，以bsa/anti-ola/aunps/go-pei-ag-nf修饰电极的电流信号作为空白值，计算空白值与检测值的差值(δi)，带入实施例一的标准曲线得到ola 的检测浓度。每个样品检测三次，计算其回收率的平均值和标准偏差。
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以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。