一种NK细胞保护运输液的制作方法

一种nk细胞保护运输液
技术领域
1.本发明涉及免疫细胞技术领域，具体涉及一种nk细胞保护运输液。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)作为机体固有免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，在机体的免疫监视中扮演着非常重要的角色，在抗肿瘤及抗病毒的免疫应答中发挥重要作用。nk细胞识别靶细胞无mhc限制性，不需抗原激活，更不需抗体的协助，就可以直接识别，非特异性地杀伤靶细胞，例如杀伤被病毒感染的细胞和肿瘤细胞，且这种抗感染和抗肿瘤的杀伤作用是广谱的，属于天然免疫系统的重要细胞组成成分，具有免疫监视和免疫清除功能，是人体防御体系的第一道屏障。同时，还可以产生一系列的细胞因子，进而对机体的适应性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和特异性免疫的桥梁。
3.近年来，随着对nk细胞活化及功能的深入研究，nk细胞免疫治疗肿瘤在临床上具有良好的应用前景，nk细胞过继免疫疗法也成为肿瘤治疗的新策略。
4.制备培养好的nk细胞在回输前一般有个运输的过程，如不回输给患者，一般则需冷冻保存。nk细胞制备扩增后如何保存运输是个问题，因为nk细胞从制备到使用需要一段时间，细胞处理完以后需马上输注(12小时内)，否则时间过长会影响细胞活性与品质。
5.nk细胞体外培养与临床使用时间节点有时不能有效衔接，如果延长培养时间会导致成本增加，同时培养时间超过最佳对数生长期后细胞的生长状态及活性会下降，从而影响细胞的活性与后续治疗质量，因此培养后的nk细胞如何保存成了必须考虑并解决的问题。
6.目前nk细胞运输方式通常有两种。一种是在冻结状态下，液氮冻存状态下进行运输，另一种是非冻结运输。两种方法都存在一些弊端。
7.液氮冻存状态下可维持细胞稳定性，冻存液中通常加入二甲基亚砜(dimathylsulfoxide，dmso)。dmso是一种细胞高毒性的化学试剂，会导致人体产生恶心，头痛，呕吐甚至休克的反应，在常规细胞培养中被严格控制在1％以下。但是，为了保护细胞，冻存液中的dmso比例高达10％。
8.比如中国专利申请cn110100812a公开了一种免疫细胞的冻存回输液，此冻存回输液由0.9％的氯化钠生理盐水溶液和以下组分组成：5％-10％的二甲基亚砜(dmso)，1％-3％的右旋糖酐，1％-5％的葡萄糖，5％-10％的人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)，50μg/ml-250μg/ml的维生素c和50μg/ml-150μg/ml的维生素e，0.5％的葡萄糖酸钠，0.03％-0.04％的氯化钾和0.03％-0.04％的氯化镁。
9.虽然在低温冻存条件下dmso可以起到保护作用，但是复苏过程中，一旦细胞复温则会遭受不良环境，这也是细胞冻存和复苏过程中细胞死亡的一个主要原因。并且液氮状态下进行运输危险性高(液氮温度为-196℃)，细胞经过冻存后复苏过程中会引起细胞活性下降、对后续治疗造成影响。
10.非冻结运输。常温培养基下运输，但是培养液晃动，会导致细胞发生机械损伤。为
保护细胞，需把培养瓶灌满培养液，才能安全运输，这样耗费培养基过多，体积较大，成本就会增加。对技术人员、操作环境及仪器的要求较高，使其应用受到限制。
11.为了降低运输成本，使操作简单化，同时保证细胞的活性和安全性，急需一种新的nk细胞运输方式——低温保存细胞。
12.低温保存细胞，通过降低或抑制细胞新陈代谢程度达到延长细胞在体外寿命的目的。理论上来说，低温下细胞代谢活动水平更低，保存时间比常温下长的多。同时可应用普通冰箱保存，生产运输成本和操作技术与常温保存基本相同，提高细胞的保存量、利用度，扩大细胞供应范围，具有很广的应用前景，但是目前低温保存、运输nk细胞的时间较短，限制了低温保存方式的广泛应用。
13.nk细胞在临床的应用是大势所趋，所以研发一种有效的nk细胞保护运输液是非常必要的。


技术实现要素：

14.本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种适用于低温保存、细胞活性高、保存时间长、安全性高、运输成本低、操作简单的nk细胞保护运输液。本发明提供了一种nk细胞保护运输液，用于4℃保存细胞，而不需冷冻保存，从而可以很好地保护细胞的活性。
15.本发明是通过以下技术方案予以实现的：
16.一种nk细胞保护运输液，包括如下组分：hepes缓冲液、葡萄糖注射液、海藻糖溶液、人血白蛋白、芒果提取物和甘氨酸。
17.优选地，所述的nk细胞保护运输液，按照体积份数计，包括如下组分：hepes缓冲液60-96份、葡萄糖注射液1-10份、海藻糖溶液1-15份、人血白蛋白1-10份、芒果提取物溶液1-15份和甘氨酸溶液1-15份。
18.优选地，述的nk细胞保护运输液，按照体积份数计，包括如下组分：hepes缓冲液60-96份、5wt％葡萄糖注射液1-10份、50wt％海藻糖溶液1-15份、20wt％人血白蛋白1-10份、0.5wt％芒果提取物溶液1-15份和1wt％甘氨酸溶液1-15份。
19.优选地，所述的nk细胞保护运输液，按照体积份数计，包括如下组分：hepes缓冲液65-80份、5wt％葡萄糖注射液3-8份、50wt％海藻糖溶液5-10份、20wt％人血白蛋白2-8份、0.5wt％芒果提取物溶液5-10份和1wt％甘氨酸溶液5-10份。
20.优选地，所述50wt％海藻糖溶液是经过0.22μm滤膜过滤除菌的。
21.本发明还涉及上述的nk细胞保护运输液的制备工艺，将hepes缓冲液、葡萄糖注射液、海藻糖溶液、人血白蛋白、芒果提取物和甘氨酸混合均匀后即得。
22.本发明还涉及上述的nk细胞保护运输液的使用方法，包括如下步骤：将nk细胞采用所述nk细胞保护运输液重悬，调整细胞密度，装入细胞保存运输袋中保存即可。
23.优选地，所述保存的温度为4-10℃。
24.优选地，调整细胞密度为1
×
107～5
×
107个/ml。
25.本发明还涉及上述的nk细胞保护运输液在保护nk细胞中的应用。
26.nk细胞保护运输液不是冷冻细胞液，而是将制备好的细胞加入保护运输液中，置于4-10℃保存或运输，避免了使用冷冻保护剂对细胞的伤害和毒性。
27.低温保存运输有助于降低细胞代谢而延长细胞保存时间。nk细胞处于低代谢状
态，仍需要一定的营养物质进行代谢，因此，本发明中特别添加以下成分：
28.人血清白蛋白，主要作用为稳定剂，防止细胞在悬液中接团，细胞结团后输注会引起小血管的栓塞，也影响细胞的活率，可以为细胞提供营养，并可以维持细胞正常渗透压，保持细胞膜完整性。
29.海藻糖，由两个葡萄糖分子以a,a,1,1-糖苷键构成非还原性糖，自身性质非常稳定，在低温环境下与蛋白质形成足够的空隙或者氢键，形成局部疏水环境，可在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，进而抵抗在保存过程中的细胞所遭受的破坏力，有效地保护蛋白质分子不变性、不失活，对细胞具有保护作用。
30.芒果提取物，自由基清除剂，抗氧化能力甚至超过vc。自由基过多，会使正常细胞加速衰老死亡。芒果提取物，在保护细胞和组织免受氧化损伤中具有重要作用。
31.甘氨酸在保存过程中起到维持溶液ph的功能，在温度变化时可以抑制ph的变化从而保护蛋白质。
32.hepes，一种优良的缓冲剂，缓冲作用强，对细胞无毒性作用，添加hepes的细胞保护液能在较长时间内保持溶液稳定的ph范围，有效防止保护液ph波动对细胞造成的伤害。而且，相比通常采用磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液作为ph缓冲剂而言，本发明中采用hepes液，不仅能维持保护液ph值在较长时间内的稳定，而且能在较长时间内满足细胞所需的co2浓度需求。
33.葡萄糖注射液，主要为细胞提供基础的能量供给。
34.上述成分协同配合，可以更好地保护nk细胞，有效延长细胞的保存时间至10天以上，保证nk细胞存活率(活性)和数量。
35.本发明的有益效果是：
36.本发明将hepes缓冲液、葡萄糖注射液、海藻糖溶液、人血白蛋白、芒果提取物和甘氨酸组合制备nk保护运输液，效果优良，协同作用明显，尤其是芒果提取物与海藻糖之间、以及芒果提取物、海藻糖与甘氨酸之间协同作用显著，具有适用于低温保存、细胞活性高、保存时间长、安全性高、运输成本低、操作简单的特点。
37.本发明使用hepes缓冲液和葡萄糖注射液，简化了配制步骤，操作简单，降低了污染的概率。
38.本发明延长了nk细胞的体外保存时间，可长达10天以上，间接降低了成本。
附图说明
39.图1表示实施例1-3和对比例1-7保存第0，5，10天的nk细胞活率。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
41.以下各实施例和对比例中，50wt％海藻糖溶液具体制备步骤为：将50g海藻糖加入100ml灭菌注射用水中，充分溶解，使用前用0.22μm滤膜进行过滤除菌。
42.hepes缓冲液浓度为10mmol/l；芒果提取物购自宁夏香草生物技术有限公司。
43.实施例1
44.一种nk细胞保护运输液，按下述体积比，
45.hepes缓冲液 76ml
46.20wt％的人血白蛋白 5ml
47.0.5wt％芒果提取物溶液 5ml
48.1wt％的甘氨酸溶液 5ml
49.5wt％的葡萄糖注射液 6ml
50.50wt％的海藻糖溶液 3ml
51.混合均匀，即得所述nk细胞保护运输液。
52.实施例2
53.一种nk细胞保护运输液，按下述体积比，
54.hepes缓冲液 70ml
55.20wt％的人血白蛋白 5ml
56.0.5wt％芒果提取物溶液 5ml
57.1wt％的甘氨酸溶液 5ml
58.5wt％的葡萄糖注射液 10ml
59.50wt％的海藻糖溶液 5ml
60.混合均匀，即得所述nk细胞保护运输液。
61.实施例3
62.一种nk细胞保护运输液，按下述体积比，
[0063][0064]
混合均匀，即得所述nk细胞保护运输液。
[0065]
对比例1
[0066]
按下述体积比配制保护液：
[0067][0068]
对比例2
[0069]
按下述体积比配制保护液：
[0070][0071][0072]
对比例3
[0073]
按下述体积比配制保护液：
[0074]
hepes缓冲液 81ml
[0075]
20wt％的人血白蛋白 5ml
[0076]
0.5wt％芒果提取物溶液 5ml
[0077]
5wt％的葡萄糖注射液 6ml
[0078]
50wt％的海藻糖溶液 3ml。
[0079]
对比例4
[0080]
按下述体积比配制保护液：
[0081]
0.9％nacl溶液 76ml
[0082]
20wt％的人血白蛋白 5ml
[0083]
0.5wt％芒果提取物溶液 5ml
[0084]
5wt％的葡萄糖注射液 6ml
[0085]
50wt％的海藻糖溶液 3ml
[0086]
1wt％甘氨酸溶液 5ml。
[0087]
对比例5
[0088]
按下述体积比配制保护液：
[0089]
hepes缓冲液 76ml
[0090]
20wt％的人血白蛋白 5ml
[0091]
0.5wt％维生素c 5ml
[0092]
5wt％的葡萄糖注射液 6ml
[0093]
50wt％的海藻糖溶液 3ml
[0094]
1wt％甘氨酸溶液 5ml。
[0095]
对比例6
[0096]
按下述体积比配制保护液：
[0097]
hepes缓冲液 76ml
[0098]
20wt％的人血白蛋白 5ml
[0099]
1wt％的甘氨酸 8ml
[0100]
5wt％的葡萄糖注射液 6ml
[0101]
50wt％的海藻糖溶液 5ml。
[0102]
对比例7
[0103]
按下述体积比配制保护液：
[0104]
hepes缓冲液 76ml
[0105]
20wt％的人血白蛋白 5ml
[0106]
0.5wt％芒果提取物溶液 13ml
[0107]
5wt％的葡萄糖注射液 6ml。
[0108]
使用方法
[0109]
将制备好的nk细胞采用实施例1-3或对比例1-7任一nk细胞保护运输液重悬，调整细胞密度为3
×
107个/ml，总体积为100ml，将制备得到的nk细胞悬液放置于4℃冰箱存放或使用生物疫苗冷藏箱进行运输，温度设定为4℃。
[0110]
测试例
[0111]
1.台盼蓝染色法检测nk细胞保存前后的活率
[0112]
取实施例1-3和对比例1-7保存第0，5，10天的nk细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以体积比9:1混合混匀，染色3min后，分别计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率。结果如图1所示。
[0113]
2.细胞杀伤毒性
[0114]
使用cck-8kit进行细胞杀伤活性的检测。
[0115]
取各组培养第0，5，10天的细胞悬液，离心后pbs洗涤2遍，调整细胞密度为1.0
×
106个/ml，作为效应细胞。取对数生长期的人慢性髓系白血病细胞k562，调整细胞密度为5.0
×
104个/ml，作为靶细胞。按照效靶比为10:1比例混合细胞，培养于96孔板内，每孔总体积200ul，作为实验孔。同时，设置效应细胞孔、靶细胞孔，每组设3个复孔。置于37℃、5％co2细胞培养箱内培养24h后，加cck-8试剂20μl，置入培养箱继续孵育4h后于450nm测定吸光度(a)值。
[0116]
按如下公式计算细胞杀伤活性：
[0117]
杀伤率(％)＝[1-(实验孔a值-效应细胞孔a值)/靶细胞孔a值]
×
100％。结果如表1所示。
[0118]
表1
[0119]
[0120][0121]
3.nk细胞表型流式检测
[0122]
取实施例1-3和对比例1-7第0，5，10天的细胞悬液，离心重悬，调整细胞浓度为1.0
×
106个/ml，每管100μl。分别加入抗体cd3-fitc、cd56-apc各5μl，于暗处孵育30min。洗涤后行流式细胞表型检测，nk检测cd3-cd56 细胞的比例。结果如表2所示。
[0123]
表2
[0124][0125]
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。