一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种灭活疫苗及其制备方法和应用，更具体一点说，涉及一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗及其制备方法和应用，属于免疫佐剂技术领域。


背景技术：

2.随着人民生活水平的提高，国内家禽养殖量日益增多，疫病防控也越来越需要得到重视。尤其是常见的新城疫和高致病性禽流感的时有爆发，急需便宜有效、可大规模应用的灭活疫苗。目前常用动物疫苗主要有：(1)弱毒疫苗；(2)灭活疫苗；(3)代谢产物疫苗；(4)亚单位疫苗；(5)活载体疫苗；(6)基因缺失苗。而油乳剂灭活疫苗是其中综合因素考虑下最适合生产使用的疫苗种类。疫苗的生产会受到诸多因素的影响，例如生产用抗原效价的稳定，不同生产批次的差异，制备过程的复杂程度和精细程度，因各原料的成本高低而做的取舍。高品质的疫苗需要有高效的佐剂配合才能达到很好的免疫效果，所以能稳定生产又高效的佐剂配方尤为重要。本专利提出了芸苔素内酯作为增强剂主要成分，其获取简单，质量稳定，免疫效果好。
3.佐剂是一类非特异性免疫刺激剂，其主要作用是配合疫苗抗原使用，主要功能有增强疫苗抗原的免疫原性；促进细胞免疫和体液免疫，优化免疫应答；增进抗原与黏膜之间的传递以及免疫接触；减少疫苗成分中抗原的需求量以及在实施过程中的免疫接种次数；优化抗原结构，维持抗原构象等。
4.佐剂最广泛的用途就是用来提高人和畜禽疫苗的抗体水平预防传染性疾病发生。将抗原与佐剂混合后，一起注射于动物体内可增强免疫系统对抗原的免疫抗性。目前常用的佐剂包括以下种类：(1)铝佐剂；(2)弗氏佐剂；(3)免疫刺激复合物；(4)细胞因子佐剂；(5)天然来源免疫佐剂；(6)微生物来源的佐剂；(7)其他种类的疫苗佐剂，例如脂质体、纳米粒子佐剂、粘膜免疫佐剂等。上述佐剂种类繁多，但其特性各不相同。例如，一些佐剂制备简单，但有一定的副作用缺陷，如铝盐佐剂和弗氏佐剂；某些佐剂的制备复杂且昂贵，如细胞因子佐剂和微生物佐剂；有些药物安全性高，可能需要改进，如天然免疫佐剂。
5.灭活疫苗尤其是病毒灭活疫苗因其抗原分子小、免疫原性不强，不能引起足够强的免疫应答，需要佐剂辅助刺激机体才能产生较强的免疫应答，矿物油佐剂加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答，效果远远优于水质佐剂，这也是口蹄疫灭活疫苗、禽流感灭活疫苗等一直使用油佐剂的原因所在。
6.新城疫(newcastle disease,nd)是一种高致病性禽类病毒性传染性疾病。nd是全球家禽业的主要威胁。这种疾病在许多以农业为国民收入主要来源的国家流行，它是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织(office international des epizooties,oie)将其列为a类疫病。新城疫病毒(newcastle disease virus,ndv)可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤
的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。ndv的破坏性影响可以通过使用疫苗来限制。目前，研究重点是改进诊断方法和更好的疫苗开发。由于减毒活疫苗、灭活疫苗以及正在兴起的亚单位疫苗均未能有效遏制多种全球主要病原体的威胁。如众所周知的灭活疫苗，由于其非复制性，它们非常安全，但通常免疫原性较差，不会引起持久的免疫力。因此，共同要求开发可能克服疫苗弱点的新型佐剂策略。
7.禽流感是禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)是引起的一种禽类烈性传染病，而h9n2亚型属于其低致病性的禽流感病毒，感染低致病性aiv的家禽会导致严重的经济后果。由于疾病导致鸡蛋或肉类产量下降、死亡率、疫苗接种成本和贸易受限，生产力可能会直接或间接降低。鸡群在感染h9n2亚型后主要呈现呼吸、消化、生殖系统和全身组织器官轻度出血等症状和病变；可破环免疫系统，导致严重的免疫抑制，继而引起大肠杆菌或其它病原的的感染。aiv控制方法千差万别，但消除家禽中的这种疾病是一个共同的目标。其中生物安全和疫苗接种是预防家禽感染的最普遍方法。为了让疫苗充分发挥其免疫作用，研发疫苗及其制备方法已经是必然的趋势待。


技术实现要素：

8.为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有具有制备简单、成本低、不良反应小、疫苗免疫效果好等技术特点的一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗及其制备方法和应用。
9.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
10.本发明一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗，所述免疫增强剂含有1-1000μg/ml的芸苔素内酯。实际取值包括端点值以及中间值。
11.优选的，包含有灭活的抗原溶液。
12.优选的，还包括水相溶液、油相溶液，所述水相溶液包括免疫增强剂与灭活的抗原溶液，所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积之比为1:1.5-4；并且所述水相溶液与油相溶液的体积之比为6:8-16。
13.一种具体的：所述水相溶液与油相溶液的体积之比能够为6:8、6:9、6:10、6:11、6:12、6:13、6:14、6:15、6:16中任一种；所述水相溶液中免疫增强剂与灭活的抗原溶液的体积之比可以为1:1.5、1:1.75、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.75、1:3、1:3.25、1:3.5、1:3.75、1:4。
14.优选的，所述油相溶液包括油相油剂、油相乳化剂，所述油相乳化剂可以为司班85、司班83、司班80、司班65、司班60、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸铝中任一种或多种，所述油相油剂可以为药用级白油、花生油、矿物油、植物油中任一种。
15.优选的，所述水相溶液还包括水相乳化剂，所述水相乳化剂可以为司班85、司班83、司班80、司班65、司班60、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、吐温85、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸铝中任一种或多种。
16.优选的，所述灭活的抗原溶液为灭活的鸡新城疫与h9亚型禽流感病毒。
17.本发明一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗的制备方法，先将免疫增强剂、灭活抗原溶液、水相乳化剂混合，制备成水相溶液；再将油相油剂、油相乳化剂混合，得到油相溶液；将油相溶液与水相溶液混合，得到灭活疫苗。
18.本发明一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
19.步骤1)将芸苔素内酯溶解于生理盐水中，制成母液，用注射器过滤膜以过滤除菌；
20.步骤2)将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感h9n2亚型病毒液和吐温80按照预设的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温80后立即水浴约5min，振荡、混匀；
21.步骤3)将司班80和白油按照预设的体积比混合，并另外加入硬脂酸铝制备获得油相溶液；
22.步骤4)将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机搅拌5min，得到基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗。
23.优选的，灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：
24.步骤1)称取30mg的芸苔素内酯，溶解于含10％乙醇的10ml生理盐水中，制成浓度为3mg/ml的母液，用注射器过0.22μm的滤膜，过滤除菌；
25.步骤2)将免疫增强剂、灭活的新城疫病毒液、灭活的禽流感h9n2亚型病毒液和吐温80按照2：1.88：1.8：0.24的体积比混合制备水相溶液，并且在混合加入吐温80后立即水浴约5min，振荡、混匀；
26.步骤3)将司班80和白油按照1：19的体积比混合，并另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备获得油相溶液；
27.步骤4)将油相溶液与水相溶液混合，通过高速乳化机13000rmp/min搅拌5min，得到基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗。
28.本发明一种基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗的应用。
29.有益效果：具有制备简单，成本低，不良反应小，疫苗免疫效果好，具有非常高的应用价值等优点；本技术疫苗的佐剂(芸苔素内酯)，在肉类食品中没有有害物质残留，更有利于保证肉类食品的安全，具有广阔的应用前景。
附图说明
30.图1是本发明实施例中新城疫抗体效价图。
31.图2是本发明实施例中h9n2禽流感抗体效价图。
具体实施方式
32.以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
33.芸苔素内酯简称br，1970年美国科学家首先米歇尔(mitchell 1970)首先报道从油菜花粉中提取出来的一种甾醇类物质，具有极强的促生长作用，1979年确定了芸苔素内酯的分子结构，正式命名为芸苔素内酯，由于这种物质首先从油菜中发现，又称为油菜素内酯，是继生长素、细胞分裂素、赤霉酸、脱落酸、乙烯之后发现的又一个植物内源激素，由于它兼具乙烯、赤霉素、生长素和细胞分裂素的多种作用，因此被称为第六类植物激素。作为植物生长调节剂，芸苔素内酯有诸多功效，例如减轻植物病害，增强植物抗病性。
34.本技术试验了基于免疫增强剂芸苔素内酯的灭活疫苗在白羽肉鸡上的免疫作用。
35.禽苗用免疫增强剂评价试验方案，具体如下:
36.1.实验目的
37.评价不同浓度的芸苔素内酯对h9亚型禽流感和新城疫灭活疫苗的增强效果。
38.2.实验材料
39.2.1免疫增强剂
40.芸苔素内酯配置成合适的浓度，按照合适的剂量添加至抗原中，配制水相。
41.2.2抗原
42.h9禽流感灭活抗原及新城疫灭活抗原灭活前的病毒滴度均大于109eid
50
/ml。
43.2.3试验动物14日龄普通白羽肉鸡。
44.生理盐水组(阴性对照组)，常规疫苗组(白油 抗原组)，免疫增强剂 常规疫苗组(白油 抗原组)，每组10只普通白羽肉鸡，共3组。
45.2.4其它试验物品
46.白油、吐温80、司班80、硬脂酸铝、生理盐水等均购自上海迈宏公司提供。
47.2.5检测试剂
48.h9亚型禽流感病毒及ndv灭活抗原血凝抑制试验标准抗原购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。
49.3.试验方法
50.3.1免疫增强剂的制备
51.称取30mg的芸苔素内酯，溶解于10ml的乙醇中，制成浓度为3mg/ml的母液，用注射器过0.22um的滤膜过滤除菌。
52.3.2疫苗制备
53.参考常规配方配制添加与不添加免疫增强剂的疫苗，各组分配方详见表3。
54.表3疫苗组成
[0055][0056]
乳化取2份油相(12ml，含0.6ml司班 0.06mg硬脂酸铝 11.4ml白油)，11000rpm/min搅拌1min，同时徐徐加入1份水相(6ml)，再以13000rpm/min搅拌5min。加盖密封，贴签标记后置2～8℃保存。
[0057]
3.3检验
[0058]
3.3.1性状：
[0059]
外观白色均匀乳状液体
[0060]
剂型油包水型
[0061]
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000rmp/min离心15min，未出现分层现象。
[0062]
3.3.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
[0063]
3.4h9n2禽流感-新城疫灭活苗效力评价
[0064]
用14日龄白羽肉鸡，分别编号后随机分为到3组中，每组10只，每只鸡经皮下注射
疫苗0.3ml。分组详见表4。
[0065]
表4疫苗ai部分效力检验试验分组与免疫
[0066][0067]
免疫后7天、14天、21天和28天分别采血。分离血清，测定血清的ai hi抗体效价。所有血清均分为2份，每份100-200μl，均保存于-20℃。然后按照国标gb/t 17999.2-2008的方法进行测定血清中的血凝抑制效价。
[0068]
4.试验结果及分析
[0069][0070]
试验结论：
[0071]
参见图1，由数据可得，添加br(芸苔素内酯)的增强剂对于新城疫疫苗有增强效果。在免疫后14天，21天，28天，第一组的鸡血清平均抗体滴度比疫苗对照分别提高了1.0log2、1.3log2和1.1log2，完全符合至少增强抗体滴度0.5log2的行业要求。
[0072]
参见图2，由数据可得，添加br的增强剂对于h9n2禽流感有增强效果，在免疫后14天，21天，28天，第一组的鸡血清平均抗体滴度比疫苗对照分别提高了0.6log2、1.0log2和1.2log2，完全符合至少增强抗体滴度0.5log2的行业要求。以上数据可得，br是免疫增强效果略高的增强剂，因此添含br的增强剂是一款非常具有实际应用价值免疫增强剂。
[0073]
实例1
[0074]
1.实验材料
[0075]
灭活的新城疫病毒液和灭活的禽流感h9n2亚型病毒液，经1％甲醛溶液灭活。
[0076]
14日龄健康白羽肉鸡。
[0077]
2.疫苗的配制
[0078]
称取30mg的芸苔素内酯，溶解于10ml的生理盐水中，制成浓度为3mg/ml的母液，用
注射器过0.22um的滤膜过滤除菌。
[0079]
将免疫增强剂与灭活的新城疫病毒液和灭活的禽流感h9n2亚型病毒液和tween-80(吐温80)按照2：1.88：1.8：0.24的体积比制备水相溶液，加入吐温后立即水浴约5min，振荡即可混匀。将司班-80和白油按照1：19的体积比，另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备油相。通过高速乳化机13000rmp/min搅拌5min，得到实验组1。
[0080]
将灭活的禽流感h9n2亚型病毒液和tween-80按照1.8：0.24的体积比制备水相溶液，加入吐温后立即水浴约5min，振荡即可混匀。将司班-80和白油按照1：19的体积比，另外加入0.06mg的硬脂酸铝制备油相。通过高速乳化机13000rmp/min搅拌5min，得到实验组2。
[0081]
直接加入同等体积的生理盐水，得到实验组3。
[0082]
3.分组、免疫和抗体检测
[0083]
将健康的白羽肉鸡随机分组，每组10只鸡，共3组。将组1、组2、组3、各免疫一组，免疫剂量为0.3ml。
[0084]
免疫前随机采血15只鸡，免疫后第7、14、21、28天，对各组健康的白羽肉鸡采血分离血清，通过血凝抑制效价实验测定抗体是否合格。或者换成合格率，但效价达到多少为合格。
[0085]
免疫前及免疫后第7、14、21、28天抗体效价如表1所示。
[0086]
表1平均抗体效价数据
[0087][0088]
4.1％红细胞制备
[0089]
将从spf鸡采集的血液集中到50ml的离心管中，1％pbs缓冲液加至50ml，1800rmp离心10min，重复2次。将红细胞沉淀转移至15ml离心管，1％pbs缓冲液加至15ml，1500rmp离5min。将离心得到的红细胞按照1：100的比例加入到1％pbs缓冲液中混匀，即可得到1％的红细胞。
[0090]
5.抗原血凝效价测定
[0091]
于96孔微量血凝板的第1孔-第12孔加入1 x pbs 30ul(排枪最小量程30ul)。每排第一孔加入30ul抗原，第一孔至第十一孔做梯度稀释，吹吸混匀十次，第十一孔吸走30ul，第十二孔做对照孔。每孔加1xpbs 30ul(这一步是为了替代血清)。每孔加1％红细胞悬液30ul。轻微震荡，室温静置20min后读数。将血凝板倾斜70度，出现红细胞完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，一个就是1单位。
[0092]
6.四单位抗原制备和验证
[0093]
将买到的抗原干粉，一安瓿用2ml的1 x pbs稀释，多余的分装保存于-80℃，干粉保存于-20℃。以4个血凝单位抗原的配制为例，如果抗原原液血凝效价为9log2，稀释倍数为2^9/2^2＝2^7＝128倍，也就是取生理盐水11.8ml，加入1比10稀释的抗原1ml。此次实验原液效价为10，则稀释256倍，也就是76.8ml的1 x pbs，加入1比10稀释的抗原3ml(0.3原液 2.7 1 x pbs)。于96孔微量血凝板的第1孔-第12孔加入1 x pbs 30ul(排枪最小量程30ul)。每排第一孔加入30ul四单位抗原，第一孔至第十二孔做梯度稀释，吹吸混匀十次，第十二孔吸走30ul。每孔加1 x pbs 30ul(这一步是为了替代血清)。每孔加1％红细胞悬液30ul。轻微震荡，室温静置20min后读数。将血凝板倾斜70度观察，第一孔为2^1第二孔为2^2第三孔为2^3，理想结果为第一孔和第二孔完全凝集，第三孔开始流下来，也就是刚好4单位。
[0094]
7.血凝抑制实验
[0095]
一个样一排，160只鸡也就是160排，一个血凝板8排，也就是20板。所有孔加入30ul的1 x pbs。吸取血清至每排第一孔，梯度稀释至第十一孔，弃去30ul，第十二孔作为空白对照(稀释到十二孔，阴性对照最后单独做)。每孔加入四单位抗原30ul，轻微震荡，室温静置半小时。每孔加入1％红细胞悬液30ul，注意加第一板的时间和最后一板的时间，20个板大约6min，按顺序来，每个板刚好20min读取最好，刚好流下来的稀释倍数最高的孔就是抑制价。阴性对照全凝集为正常，禽流感和新城疫的血清血凝抑制效价≥2^4为阳性。
[0096]
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。