免疫微泡复合物及其用途的制作方法

1.本发明涉及免疫微泡复合物及其用途，该免疫微泡复合物包含微泡；以及缀合在微泡的表面上的免疫检查点抑制抗体。
2.本技术要求于2019年9月2日提交的韩国专利申请号10-2019-0108278的优先权和权益，其公开内容通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

3.癌症是人类必须解决的不治之症之一，全世界都在投入巨资开发以治愈它，并且在韩国，作为疾病引起的死亡原因中的1号疾病，每年超过10万人被诊断出患该病并且有超过60,000人死亡。
4.目前临床上使用的癌症治疗方法包括化学疗法、放射疗法、靶向疗法和通过手术去除病灶的方法，目前用于癌症治疗的化学治疗剂的代表性示例包括广泛用于癌症治疗化学疗法的多柔比星、阿霉素、顺铂、紫杉醇和5-氟尿嘧啶。然而，由于这些方法具有局限性，并且伴随着对患者来说严重的副作用和痛苦，而非使病例完全治愈，因此开发能够使副作用最小化的癌症治疗技术是非常重要的。
5.因此，已经开发了癌症免疫疗法。这些方法是通过活化癌症特异性免疫细胞来杀死癌细胞的方法，并且由于记忆免疫细胞的生成而具有很高的完全治愈的可能性，预期能够抑制复发，并且不需要手术，所以与传统的癌症治疗方法相比能够使副作用最小化。目前的癌症免疫疗法市场大约为4万亿韩元(krw)，预计到2024年将激增至10万亿韩元(krw)。截至目前，大约有15种已获得fda批准的癌症免疫治疗药物正积极进行应用。在癌症免疫治疗方法中，代表性方法包括疫苗治疗和免疫检查点抑制剂治疗，目前被称为显示良好临床结果的癌症免疫治疗药物。然而，目前使用的癌症免疫治疗方法具有这样的现象，其中癌细胞产生其自身的干扰抗体并降低癌症免疫治疗剂的功效，因此治疗效果因损耗一定量的施用的癌症免疫治疗剂而下降。此外，癌症免疫疗法由于药物的全身循环而具有各种副作用和药物损耗。
6.同时，诊断剂是能够同时诊断和治疗疾病的物质。这些剂一般由小尺寸物质组成，并通常具有这样的形式：在脂质体、聚合物或纳米颗粒中承载有荧光染料、放射性分子等，并且将药物或诊断标志物引入到外部。最近，主要进行了关于治疗剂合成的研究，该治疗剂由具有优异生物相容性的脂质结构组成。特别是，使用由脂质结构组成的微米级微泡(mb；微泡超声波剂)的生物图像分析研究正在积极进行，并且关于微泡、纳米颗粒药物递送系统和使用它们的组合疗法的治疗方法的各种研究也已经进行。
7.暴露于超声波的微泡引起空化，该空化导致周围细胞的细胞膜暂时形成孔，并因此，显示出癌细胞附近的淋巴细胞增加，并且由于肿瘤消融活化了树突状细胞，因而显示出借此活化免疫系统的效果。因此，预计作为间接治疗方法的使用超声波的免疫治疗方法与单独使用癌症免疫治疗剂的治疗方法相比具有更窄的范围或更低的治疗效果，但当独特的超声波物理机制与传统的免疫治疗方法组合使用时，能够表现出协同作用。
8.因此，本发明人通过将超声波技术与免疫疗法组合，通过应用微泡复合物和超声波开发出一种新型免疫治疗方法，该方法在癌症相关研究和开发领域(如癌症诊断和治疗)中尚不为人所知。


技术实现要素：

[技术问题]
[0009]
本发明人证实，通过将超声波技术与癌症免疫治疗方法组合，对抗体缀合微泡进行超声波处理时，与不进行超声波处理时相比，表现出优异的抗肿瘤效果，并基于此完成了本发明。
[0010]
因此，本发明旨在提供一种免疫微泡复合物及其用途，该免疫微泡复合物包含微泡；以及缀合在微泡的表面上的免疫检查点抑制抗体。
[0011]
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员通过以下描述将充分理解本文未描述的其他问题。[技术方案]
[0012]
为实现本发明的目的，本发明提供了一种免疫微泡复合物，其包含微泡；以及缀合在微泡的表面上的免疫检查点抑制抗体，该免疫检查点抑制抗体在通过超声波超音导入术促进免疫反应的环境中通过抑制肿瘤细胞的免疫逃避来活化t细胞。
[0013]
在本发明的一个实施方案中，微泡与抗体的缀合可以是酰胺键、硫醇键或生物素-亲和素键。
[0014]
在本发明的另一个实施方案中，微泡可包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dspc)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)。
[0015]
在本发明的又一个实施方案中，dspe可以是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰基(聚乙二醇)-2000](dspe-peg2000-nhs)。
[0016]
此外，本发明提供一种制备免疫微泡复合物的方法，该方法包含：(a)将磷脂与有机溶剂混合，然后将所得混合物水合；(b)通过将步骤(a)中得到的水合脂质体前体分散和搅拌来制备微泡；以及(c)将免疫检查点抑制抗体与微泡缀合。
[0017]
在本发明的一个实施方案中，磷脂可以包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dspc)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)。
[0018]
在本发明的另一个实施方案中，dspc和dspe的摩尔比率可以为6至9:1至4(mol)。
[0019]
在本发明的又一个实施方案中，免疫检查点抑制抗体可以是选自由抗程序性死亡配体-1(pd-l1)抗体、抗b7-1抗体和抗b7-2抗体组成的群组中的一种或多种。
[0020]
此外，本发明提供了一种药物递送载体，其包含该免疫微泡复合物。
[0021]
此外，本发明提供一种用于癌细胞特异性超声波、磁共振成像或荧光分析的对比剂组合物，其包含该免疫微泡复合物。
[0022]
此外，本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该免疫微泡复合物。
[0023]
在本发明的一个实施方案中，免疫微泡复合物可以与超声波治疗组合使用。
[0024]
在本发明的另一个实施方案中，超声波可以是高强度聚焦超声波(hifu)。
[0025]
在本发明的又一个实施方案中，免疫微泡复合物可以通过超声波空化以将淋巴细胞集中在癌细胞附近。
[0026]
此外，本发明提供了一种提供癌症诊断信息的方法，该方法包括用免疫微泡复合物处理生物样本；以及进行超声波治疗。
[0027]
此外，本发明提供一种诊断癌症的方法，该方法包括用免疫微泡复合物处理生物样本；以及进行超声波治疗。
[0028]
此外，本发明提供一种预防或治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的对象施用包含免疫微泡复合物的组合物；以及进行超声波治疗。
[0029]
此外，本发明提供包含该免疫微泡复合物的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
[0030]
此外，本发明提供了免疫微泡复合物在制备用于癌症治疗的药物中的用途。[有利效果]
[0031]
根据本发明的免疫微泡复合物(imc)包含缀合有抗体的微泡，其中微泡具有优异的稳定性和优异的抗体结合强度，并且证实，当免疫微泡复合物用高强度聚焦超声波(hifu)处理时，抗肿瘤效果显著增加并表现出免疫增强效果。因此，根据本发明的免疫微泡复合物有望提高缀合抗体的递送效率，可用于癌症的诊断和治疗，并在免疫疗法领域中表现出多种功能，包括对比效应、半衰期改善、改善的药物递送、淋巴细胞集中效应、癌症免疫疗法和使用超声波的诱导免疫疗法。
附图说明
[0032]
图1显示了根据本发明的一个实施方案，根据dspc:dspe-peg2k-nhs的比率制备的微泡(mb)的尺寸和数量。
[0033]
图2显示了根据本发明的一个实施方案，根据dspc:dspe-peg2k-nhs的比率制备的微泡随时间的稳定性的观察结果。
[0034]
图3显示了根据本发明的一个实施方案，根据dspc:dspe-peg2k-nhs的比率制备的微泡的尺寸分布。
[0035]
图4显示了根据本发明的一个实施方案，以9:1的dspc:dspe-peg2k-nhs比率制备的微泡的dspe-peg-nhs结构和尺寸分布。
[0036]
图5显示了根据本发明的一个实施方案的取决于时间和温度的微泡的数量。
[0037]
图6显示了合成根据本发明的一个实施方案的免疫微泡复合物(imc)后剩余溶液中抗pd-l1抗体和抗pd-l1抗体 胶束的浓度。
[0038]
图7显示了根据本发明的一个实施方案的免疫微泡复合物的一组共焦图像。
[0039]
图8显示了根据本发明的一个实施方案的免疫微泡复合物的共焦图像及dic图像。
[0040]
图9显示了根据本发明的一个实施方案用于验证b16f10细胞中pd-l1表达的实验设计。
[0041]
图10显示了根据本发明的一个实施方案验证b16f10细胞中pd-l1表达的结果。
[0042]
图11显示了通过高强度聚焦超声波(hifu)处理根据本发明的一个实施方案的微泡和免疫微泡复合物的抗肿瘤效果。
[0043]
图12显示了根据本发明的一个实施方案的微泡和免疫微泡复合物的hifu处理后的ifn-γ和溶细胞性t细胞活性。
具体实施方式
[0044]
本发明提供一种免疫微泡复合物，其包含微泡；以及缀合在微泡的表面上的免疫检查点抑制抗体，该免疫检查点抑制抗体在通过超声波超音导入术促进免疫反应的环境中通过抑制肿瘤细胞的免疫逃避来活化t细胞。
[0045]
根据本发明，微泡可以通过超声波超音导入术促进免疫反应，并且免疫检查点抑制抗体可以让免疫细胞识别靶标疾病细胞。
[0046]
在本发明中，微泡可包含1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(dspc)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(dspe)。
[0047]
在本发明中，抗体可以通过微泡的表面上的接头或活化官能团与微泡缀合。官能团可以是硫醇基或胺基，并且接头可以是包含官能团的化合物，并且抗体与微泡的缀合可以是酰胺键、硫醇之间的键，或生物素-亲和素键。
[0048]
在本发明中，“接头”是指将抗体或药物与微泡连接的物质，并且可以是但不限于例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或马来酰亚胺。根据本发明的一个实施方案，dspe可以是作为接头的nhs所连接的1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[琥珀酰基(聚乙二醇)-2000](dspe-peg2000-nhs)。
[0049]
在本发明中，微泡的粒径可以为0.8至1.5μm，并且根据本发明的一个实施方案，微泡的平均直径可以为1.19
±
0.245μm。
[0050]
本发明中，dspc与dspe的摩尔比率可以为6至9:1至4(mol)、6.5至9:1至3.5(mol)，或7至9:1至3(mol)，以及优选7:3(mol)或9:1(mol)。最优选地，当以9:1(mol)的摩尔比率制备微泡时，所制备的微泡的稳定性可能最高，但本发明不限于此。
[0051]
本文使用的术语“超声波”是指人耳通常可听到的超过16hz至20khz频率的声波，并且高强度聚焦超声波(hifu)可通过引入聚焦超声波，从而向焦点提供连续的高强度超声波能量而表现出取决于能量和频率的瞬时热效应(65至100℃)、空化效应、机械效应和声化学效应。超声波在穿过人体组织时是无害的，但形成焦点的高强度超声波会生成足够的能量来引起凝固性坏死和热烧灼，而不管组织的类型如何。
[0052]
在本发明中，超声波可以是hifu，但本发明不限于此。在本发明中，用于hifu的频率可以是0.1至10mhz、0.1至9mhz、0.1至8mhz、0.1至7mhz、0.1至6mhz、0.1至5mhz、0.1至4mhz、0.1至3mhz或0.1至2mhz，并且根据本发明的一个实施方案是1.1mhz。在本发明中，hifu可以在1.1mhz、50到100w、1到10个占空比和40prf的条件下处理10到20秒，但本发明不限于此。
[0053]
本文使用的术语“超音导入术”是利用声波，通常是超声波的波能来改善物质通过液体介质的传输，并且是指利用超声波来增加药物吸收的药物递送方法。在这里，声波的压缩波在液体介质中引起“流动”和/或“空化”。当根据本发明的免疫检查点抑制抗体经超声波处理时，通过超音导入术表现出免疫反应促进作用，并且可进一步使该抗体靶向诸如癌细胞等靶标细胞。
[0054]
本文使用的术语“空化”是指这样一种现象，其中，当在流体中存在低压区域时，水中所含的气体从水中逸出并集中在低压区域中，从而导致没有水的空洞空间，并且随着本发明的免疫微泡复合体中发生超声波诱导的空化，在周围细胞的细胞膜中暂时形成空隙，并且物质通过空隙渗透到细胞中，由此使淋巴细胞聚集在癌细胞附近。
[0055]
此外，本发明提供一种制备免疫微泡复合物的方法，该方法包括：(a)将磷脂与有机溶剂混合，然后将所得混合物水合；(b)通过将步骤(a)中得到的水合脂质体前体分散和搅拌来制备微泡；以及(c)将免疫检查点抑制抗体与微泡缀合。
[0056]
在本发明中，磷脂可以包含dspc和dspe。
[0057]
在本发明中，磷脂中dspc和dspe的摩尔比率可以为6至9:1至4(mol)，6.5至9:1至3.5(mol)，或7至9:1至3(mol)，优选7:3(mol)或9:1，以及最优选9:1(mol)。
[0058]
术语“检查点”是在活化或灭活人体免疫细胞的程序中使用的蛋白质，其包含例如位于癌细胞的表面上的程序性死亡配体-1(pd-l1)、b7-1和b7-2。在本发明中，“检查点抑制”是指抑制免疫系统抑制检查点的能力，并且被抑制的免疫检查点的阻断活化免疫系统功能。在本发明中，与微泡缀合的抗体可以用作检查点抑制剂。
[0059]
本文使用的术语“抗体”是指包括源自通过特异性结合抗原或其片段而识别的免疫球蛋白基因的框架区的多肽。识别的免疫球蛋白基因包括喀帕(κ)、拉姆达(λ)、阿尔法(α)、伽马(γ)、德尔塔(δ)、艾普西龙(ε)和缪(μ)恒定结构域的基因以及免疫球蛋白可变结构域的众多基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ和ε，表示免疫球蛋白的类别，例如igg、igm、iga、igd和ige。通常，抗体的抗原结合区对于结合特异性和亲和力最为关键。在本发明中，抗体或其片段可以源自不同的受试者，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼和兔，但本发明不限于此。本发明的抗体可以包括在一个或多个氨基酸位置处被修饰或突变以改善或调节抗体的优选功能(例如糖基化、表达、抗原识别、效应器功能、抗原结合或特异性)的抗体。
[0060]
在本发明中，抗体可以是选自由抗pd-l1抗体、抗b7-1抗体和抗b7-2抗体组成的群组中的一种或多种，并且根据本发明的一个实施方案，抗体可以是抗pd-l1抗体，但本发明不限于此。
[0061]
在本发明中，抗pd-l1抗体可以特异性结合pd-l1，由此抑制pd-l1结合并防止对肿瘤的免疫反应的抑制。在这里，pd-l1的氨基酸序列可以用seq id no:1(ncbi genbank:adk70950.1)表示，并且购买了invivoplus抗小鼠pd-l1(b7-h1)(目录#bp0101，克隆10f.9g2)作为抗pd-l1抗体。
[0062]
此外，本发明提供了一种药物递送载体，其包含该免疫微泡复合物。
[0063]
本文使用的术语“药物”是指具有所需生物活性的任何化合物。所需的生物活性包括对诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其他动物的疾病有用的任何活性。
[0064]
此外，本发明提供一种用于癌细胞特异性超声波、磁共振成像或荧光分析的对比剂组合物，其包含该免疫微泡复合物。
[0065]
本文使用的术语“对比剂”是指施用于机体以有效且特异性地对体内癌细胞进行对比或成像的物质，并且现在广泛用于医学和诊断领域的组织和细胞的图像增强。本文使用的术语“对比剂”不限于常规已知的ct、pet和mri对比剂的范围，并且包括用于超声波成像和荧光成像的对比剂。
[0066]
此外，本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该免疫微泡复合物。
[0067]
本文使用的术语“癌症”是由细胞引起的疾病的总称，该细胞具有细胞分裂和生长不受正常生长限制的侵袭性、细胞穿透到周围组织的浸润性，以及细胞扩散到身体其他部
位的转移性。
[0068]
在本发明中，癌症没有特别限制，只要是本领域已知的恶性肿瘤即可，并且可以选自由以下项组成的群组：乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌症、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、cns肿瘤、原发性cns淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。
[0069]
在本发明中，“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制癌症或延缓其发作的所有作用。
[0070]
本文使用的“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变癌症症状所涉及的所有作用。
[0071]
本文使用的术语“药物组合物”是指制备用于预防或治疗癌症的药物组合物，并且可以进一步包括通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。赋形剂可以是选自由稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、膜包衣材料和控释添加剂组成的群组的一种或多种。
[0072]
根据本发明的药物组合物可以根据常规方法配制成以下形式：粉剂、颗粒剂、缓释型颗粒剂、肠溶颗粒剂、溶液和液体剂、滴眼剂、酏剂、乳剂、混悬液、醑剂、锭剂、芳香水剂、柠檬水剂、片剂、缓释型片剂、肠溶片、舌下片、硬胶囊、软胶囊、缓释型胶囊、肠溶胶囊、丸剂、酊剂、软提取物、干提取物、液体提取物、注射剂、胶囊、灌流剂、膏药、洗剂、糊剂、喷雾剂、吸入剂、贴剂、无菌注射剂或外用制剂，例如气雾剂，并且外用制剂可以具有霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、搽剂、糊剂或泥罨剂等剂型。
[0073]
作为可包含在根据本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂，可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、低聚糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
[0074]
该组合物可以与稀释剂或赋形剂如常规使用的填充剂、增稠剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂一起配制。
[0075]
作为片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂和锭剂的添加剂，可以使用赋形剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、小麦淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、二甘露醇、沉淀的碳酸钙、合成硅酸铝、磷酸一氢钙、硫酸钙、氯化钠、碳酸氢钠、纯化羊毛脂、微晶纤维素、糊精、海藻酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、高岭土、尿素、胶体硅胶、羟丙基淀粉；羟丙基甲基纤维素1928、2208、2906、2910；丙二醇、酪蛋白、乳酸钙和primojel；粘合剂，例如明胶、阿拉伯胶、乙醇、琼脂粉、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、葡萄糖、纯净水、酪蛋白酸钠、甘油、硬脂酸、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素钠、甲基纤维素、微晶纤维素、糊精、羟纤维素、羟丙基淀粉、羟甲基纤维素、纯化虫胶、淀粉粉末、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如羟丙基甲基纤维素、玉米淀粉、琼脂粉、甲基纤维素、膨润土、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钙、十二烷基硫酸钠、硅酸酐、1-羟丙基纤维素、葡聚糖、离子交换树脂、聚乙酸乙烯酯、经甲醛处理的酪蛋白和明胶、
海藻酸、直链淀粉、瓜尔胶、碳酸氢钠、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸钙、凝胶淀粉、阿拉伯胶、支链淀粉、果胶、多聚磷酸钠、乙基纤维素、白糖、硅酸铝镁、二山梨糖醇溶液和轻质无水硅酸；以及润滑剂，例如硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酸、氢化植物油、滑石粉、石灰石高岭土、矿脂、硬脂酸钠、可可脂、水杨酸钠、水杨酸镁、聚乙二醇4000和6000、液体石蜡、氢化大豆油(lubri蜡)、硬脂酸铝、硬脂酸锌、十二烷基硫酸钠、氧化镁、聚乙二醇(macrogol)、合成硅酸铝、硅酸酐、高级脂肪酸、高级醇、硅油、石蜡油、聚乙二醇脂肪酸醚、淀粉、氯化钠、乙酸钠、油酸钠、双亮氨酸和轻质无水硅酸。
[0076]
用于根据本发明的液体的添加剂可以是水、稀盐酸、稀硫酸、柠檬酸钠、单硬脂酸蔗糖、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(吐温酯)、聚氧乙烯单烷基醚、羊毛脂醚、羊毛脂酯、乙酸、盐酸、醋酸、盐酸、氨水、碳酸铵、氢氧化钾、氢氧化钠、醇溶谷蛋白、聚乙烯基吡咯烷酮、乙基纤维素和羧甲基纤维素钠。
[0077]
对于根据本发明的糖浆，可以使用蔗糖溶液、其他类型的糖或甜味剂，并且根据需要，可以使用调味剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、混悬剂、乳化剂或增粘剂。
[0078]
对于根据本发明的乳液，可以根据需要使用乳化剂、防腐剂、稳定剂或调味剂。
[0079]
对于根据本发明的混悬液，可以使用混悬剂，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素1828、2906或2910，并且根据需要，可以使用表面活性剂、防腐剂、稳定剂、着色剂和调味剂。
[0080]
对于根据本发明的注射剂，可以使用：溶剂，例如可注射无菌水、注射用0.9％氯化钠、林格氏溶液、注射用葡萄糖、注射用葡萄糖 氯化钠溶液、peg、乳酸林格氏溶液、乙醇、丙二醇、非挥发性油-芝麻油、棉籽油、花生油、豆油、玉米油、油酸乙酯、异丙基肉豆蔻酸或苯甲酸苯酯；助溶剂，例如苯甲酸钠、水杨酸钠、乙酸钠、尿素、氨基甲酸酯、单乙基乙酰胺、苯基丁氮酮、丙二醇、吐温、烟酸酰胺、六胺或二甲基乙酰胺；缓冲剂，例如弱酸及其盐(乙酸和乙酸钠)、弱碱及其盐(氨和乙酸铵)、有机化合物、蛋白质、白蛋白、蛋白胨或树胶；等渗剂，例如氯化钠；稳定剂，例如亚硫酸氢钠(nahso3)、二氧化碳气体、焦亚硫酸钠(na2s2o3)、亚硫酸钠(na2so3)、氮气(n2)或乙二胺四乙酸；抗氧化剂，例如0.1％亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、硫脲、乙二胺四乙酸二钠或丙酮合亚硫酸氢钠等；镇痛剂，例如苯甲醇、氯丁醇、盐酸普鲁卡因、葡萄糖或葡萄糖酸钙；或者悬浮剂，例如cmc钠、海藻酸钠、吐温80或单硬脂酸铝。
[0081]
对于根据本发明的栓剂，可以使用基质，例如可可脂、羊毛脂、witepsol、聚乙二醇、甘油明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸盐和油酸盐的混合物、subanal、棉籽油、花生油、棕榈油、可可脂 胆固醇、卵磷脂、lanette蜡、单硬脂酸甘油酯、吐温或span、imhausen、单烯(单硬脂酸丙二醇酯)、甘油、adeps solidus、buytyrum tego-g、cebes pharma 16、hexalide base 95、cotomar、hydrokote sp、s-70-xxa、s-70-xx75(s-70-xx95)、hydrokote 25、hydrokote 711、idropostal、massa estrarium(a,as,b,c,d,e,i,t),masa-mf,masupol,masupol-15,neosuppostal-n,paramount-b,supposiro(osi,osix,a,b,c,d,h,l),栓剂基质iv型(ab,b,a,bc,bbg,e,bgf,c,d,299),suppostal(n,es),wecoby(w,r,s,m,fs)或者tegester甘油三酯基质(tg-95,ma,57)。
[0082]
用于口服施用的固体制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、或胶囊剂，并且此类固体制剂可以通过将诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶之类的赋形剂中的至少一种与活性成分混合来制备。而且，除了简单的赋形剂外，还可以使用诸如硬脂酸镁和滑石粉之类的润
7.4)中，并在25℃下进行5次测量。
[0111]
结果，以五种不同比率制备的微泡的尺寸和数量如图1所示。并且证实了，当dspc:dspe-peg2k-nhs的摩尔比率为9:1时，生成的微泡更小且数量更多。
[0112]
2-2.微泡稳定性比较
[0113]
观察根据实施例2-1中的dspc:dspe-peg2k-nhs的比率制备的微泡随时间的稳定性。
[0114]
具体而言，以如实施例2-1所示的5种摩尔比率制备微泡，并且在室温下目视确认微泡在0、3、6、24小时的消失程度。
[0115]
结果，如图2所示，随着时间的推移，随着溶液按照dspc:dspe-peg2k-nhs比率为3:7、5:5和6:4的顺序变得透明，观察到微泡消失，由此证实了当以7:3和9:1的比率制备时，微泡是稳定的。
[0116]
另外，如图3所示，作为以5种不同比率制备的微泡的尺寸分布的证实结果，在3:7和5:5比率的情况下，除了1h的峰值之外，由于低稳定性在ζ尺寸中没有显示出尺寸分布，并且在6:4比率的情况下，显示微泡在24h时不稳定。另一方面，可以证实，在7:3和9:1比率的情况下，微泡的尺寸分布是稳定的，特别是在9:1比率的情况下，微泡具有最高的稳定性。
[0117]
因此，在本发明中，以9:1的dspc:dspe-peg2k-nhs比率制备微泡，并将其用于实验。在这里，通过实施例2-1中描述的方法制备微泡，并且磷脂膜的浓度为0.5mg/ml。
[0118]
用于制备微泡的dspe-peg-nhs的结构和以9:1的dspc:dspe-peg2k-nhs比率制备的微泡的尺寸分布在图4中示出，微泡的尺寸为1.19
±
0.245μm并且微泡的数量平均为1.99x109。
[0119]
2-3.根据时间和温度确认微泡的稳定性
[0120]
为了测试微泡(mb)的根据时间和温度的稳定性，在光学显微镜下于4℃和25℃监测填充空气后制备的微泡(带空气的mb)和填充sf6气体后制备的微泡(带有sf6的mb)随时间变化的数量。
[0121]
结果，如图5所示，证实了在带有sf6(4℃)的mb的情况下，观察到数量最多的微泡，并且微泡是高度稳定的。
[0122]
实施例3.免疫微泡复合物的制备
[0123]
3-1.微泡抗体颗粒的条件
[0124]
通过将抗pd-l1抗体与实施例2-1中制备的微泡的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)缀合来制备免疫微泡复合物(imc)。在这里，假设抗pd-l1抗体与nhs以1:1反应，证实了用于制备imc的抗pd-l1抗体的条件。
[0125]
在这种情况下，如表1所示，nhs分子的数量大约是pd-l1抗体数量的100倍，因此，预计当单剂量的抗pd-l1抗体为100至200μg时，与mb结合的抗体将是足够的。
[0126]
[表1]
[0127]
3-2.免疫微泡复合物的制备
[0128]
在将实施例2-1中制备的微泡纯化后，将200μg的抗pd-l1抗体(以下称为pd-l1 ab；美国bioxcell)缀合至1.5x109个微泡。为了去除未缀合的pd-l1 ab，通过在300rpm下梯度离心5分钟来执行微泡抗体缀合物的纯化，并通过动态光扫描(英格兰malvern zetasizer nano series)测量尺寸和表面电荷。
[0129]
3-3.抗pd-l1抗体的结合效率的测量
[0130]
在imc合成后，考虑到由于滤液中残留的脂质体 抗体(ab)可能导致的结合强度测量误差，首先测量(1)脂质(胶束) ab和(2)ab的浓度。结果，如图6所示，证实了两组之间几乎没有差异，并且通过bradford测定方法测量imc合成后滤液中存在的未结合的抗体来确认抗体缀合效率。
[0131]
具体而言，在充分等待以尽可能多地避免将抗体混入滤液后，将滤液通过注射器分离，与bradford溶液混合并放置5分钟，然后测定抗体。
[0132]
结果，在std曲线中，与对照组(无ab)没有差异，并且如下表2所示，通过bradford测定法，抗体缀合效率为99.9％，并且滤液和对照之间没有差异，显示200μg的抗体被100％缀合。
[0133]
[表2]
[0134]
此外，作为使用bradford测定法检测与硫醇的缀合的结果，如下表3所示，在0.581nm和0.576nm处测量抗体。
[0135]
[表3]
[0136]
实施例4.免疫微泡复合物(imc)的共焦图像的确认
[0137]
4-1.根据抗体浓度确认共焦图像
[0138]
为了证实抗体与微泡的缀合，确认了imc的共焦图像。
[0139]
具体而言，将通过加入20至160μg一抗(小鼠pd-l1抗体)缀合10μl(0.01mg/ml)的mb制备的imc用fitc标记的二抗(结合到小鼠pd-l1抗体的fc区)以两倍于一抗的量在4℃下处理60分钟。通过以3,000rpm离心5分钟来纯化缀合有二抗的imc溶液，随后将纯化产物滴在载玻片上。然后，用共聚焦激光扫描显微镜(clsm)观察imc。
[0140]
结果，如图7所示，随着抗体浓度的增加，荧光变得更加明显，并且观察到抗pd-l1抗体对mb具有高结合强度。
[0141]
4-2.gfp和dic图像的比较
[0142]
将通过加入1mg一抗(抗pd-l1抗体)缀合1mg的mb制备的imc用1mg的gfp标记的二抗处理，然后通过实施例4-1中描述的方法观察其共焦图像。使用微分干涉对比(dic)显微镜观察到的图像和其中组合了gfp和dic的图像显示在图8中。
[0143]
如图8所示，通过观察微泡表面上的荧光，证实了在根据本发明的imc中，抗体缀合到微泡的表面。
[0144]
实施例5.imc和hifu造成的影响
[0145]
5-1.pd-l1在b16f10细胞中的表达的证实
[0146]
如图9所示，设计了一个实验，证实了pd-l1在b16f10细胞中的表达。
[0147]
具体而言，将b16f10细胞溶解在孔中，并且为了检测表达的pd-l1，加入50μg抗pd-l1抗体。随后，在用pbs或培养基洗涤两次后，并用共聚焦显微镜确认，加入50至100μg荧光标记的pd-l1二抗并放置大约2小时。之后，再次洗涤2或3次并进行共聚焦成像。
[0148]
结果，如图10所示，作为确认pd-l1的表达水平的结果，通过荧光pd-l1，通过观察到染成红色的pd-l1，证实了pd-l1在细胞表面上高表达。
[0149]
5-2.imc和hifu的抗肿瘤活性
[0150]
为了证实实施例3-2中制备的imc或当将imc用hifu处理时的抗肿瘤活性，使用通过携带ct26wt肿瘤的balb/c小鼠模型，该模型通过将ct26wt细胞悬浮液(每只小鼠1x106个细胞)皮下注射到4周龄balb/c雌性小鼠右侧胁腹而建立。在肿瘤体积达到50mm3后，将小鼠随机分组进行处理。实验组定义如下：g1：仅同种型ab(0.3mg)g2：仅pd-l1 ab(0.3mg)g3：pbsg4：仅hifug5：同种型ab mb(0.3mg)g6：同种型ab mb hifu(0.3mg)g7:pd-l1 mb(0.3mg)g8:imc hifu(0.3mg)
[0151]
作为同种型ab，将没有pd-l1 ab功能的同源igg2 ab用作对照。
[0152]
用数字卡尺测量肿瘤尺寸，并在实验结束时切除肿瘤组织以进行组织学分析。
[0153]
结果，如图11所示，与g2相比，g1的肿瘤尺寸略小，但没有显著差异(图11的上图)，与g3相比，g4的肿瘤尺寸略小(图11的中图)，并且当同种型ab mb组(g5)和pd-l1 ab mb组(g7)两者均用hifu处理时，肿瘤尺寸显著减小，特别是在用hifu处理pd-l1 ab mb(imc)的g8组中，显示了肿瘤尺寸的最大减小(图11的下图)。
[0154]
因此，由以上结果发现，对本发明中制备的免疫微泡复合物(imc)进行hifu处理导致优异的抗肿瘤效果。
[0155]
5-3.对ifn-γ和溶细胞性t细胞的活性
[0156]
通过从小鼠中提取血浆或腹水并使用quantikine小鼠ifn-γ测定试剂盒(明尼苏达州明尼阿波利斯的r&d systems)通过elisa评估它们来进行ifn-γ测定。
[0157]
此外，对于溶细胞性t细胞，在用pbs重悬癌细胞后，向所得的悬浮液中加入10μm羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)，在37℃下与细胞反应10分钟，并在室温下用等量的fcs处理2分钟以停止反应。随后，在用aim-v( 5％人a/b血清)洗涤两次后，将所得细胞用aim-v il2、il-7和il-15( 5％人a/b血清)重悬，并在37℃下用树突状细胞(dc)和细胞毒性t细胞(ctl)的1:10混合物孵育6小时。之后，加入1μg/ml碘化丙啶，并在测量前加入10μl的校准
珠。
[0158]
结果，如图12所示，与实施例5-2的结果类似，证实了用hifu处理pd-l1 ab mb(imc)的g8组显示出最高的ifn-γ特异性点，以及最高的溶细胞性t细胞活性。
[0159]
因此，可以证实用hifu处理根据本发明的免疫微泡复合物导致免疫增强效果。
[0160]
本领域普通技术人员应当理解，以上对本发明的描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下，本文公开的示例性实施方案可以容易地修改为其他具体形式。因此，上述示例性实施方案应被解释为说明性的而不是在任何方面进行限制。工业适用性
[0161]
根据本发明的免疫微泡复合物可提高缀合抗体的递送效率并可用于癌症的诊断和治疗，有望用于免疫治疗的领域，包括对比效应、半衰期改善、改善药物递送、淋巴细胞集中效应、癌症免疫疗法和使用超声波诱导免疫疗法。