一种用于治疗难治性iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物
技术领域
1.本发明属于医药领域，涉及一种用于治疗iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物。
背景技术：
2.胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，大约占颅内肿瘤的80%，在我国发病率为 (5 ~8)/10万。脑胶质瘤恶性程度高，5年病死率在全身各系统肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌；2016年who根据病理学上的细胞恶性程度，可以将胶质瘤分为i、ii、iii、iv 四个级别，通常把i/ ii 级胶质瘤视为低级别胶质瘤，iii/iv级胶质瘤多视为高级别胶质瘤。对于低级别胶质瘤患者，早期发现时给予积极治疗预后较好，而高级别胶质瘤患者，发病时常处于疾病发展后期，已有明显的占位进而影响患者的生理功能，即使给予治疗预后也不佳，部分患者的生存期＜2年，5年生存率不足5%。
3.目前已有多个分子标志物被证实与胶质瘤的预后及放化疗的敏感性相关，目前已经发现 idh-1、hmgb1、mgmt、tert、atrx、vegf 等和胶质瘤的发生发展有密切关系，在胶质瘤的演变过程中有重要作用；从既往文献上看，胶质瘤tmz的耐药性主要与idh-1突变和mgmt甲基化水平有关，异柠檬酸脱氢酶1(idh1)编码的蛋白质，将异柠檬酸催化氧化脱羧的为α-酮戊二酸，在三羧酸循环中起重要作用，异柠檬酸脱氢酶 (idh)突变是胶质瘤中的常见突变，idh1突变被认为是胶质瘤发生和发展的早期事件，许多研究表明idh1突变的存在或缺失有助于脑胶质瘤的预后，idh1突变可影响胶质瘤术后放化疗的敏感性，与idh1野生型患者相比，idh1突变患者手术后进行放疗和化疗可明显延长无进展生存期(p《0.001)，在同一级别脑胶质瘤中伴有idh1突变患者的存活时间明显长于野生型 idh1患者，idh1基因突变能够引起高甲基化的发生。
4.o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶 (o6
‑ꢀ
alkylguanine dna alkyltransferase, mgmt)基因由5个外显子组成，位于染色体10q26上，正常情况下其主要功能是表达dna修复蛋白，该蛋白在体内的作用是去除鸟嘌呤上的烷基加和物，保护细胞免受损伤；同时对替莫唑胺造成的损伤也具有修复作用，在某些条件下，或者说在idh1突变后诱导cpg岛甲基化，造成mgmt 表达的沉默，进而造成 dna 修复蛋白的生成障碍；同时可使替莫唑胺等化疗药物对胶质瘤的敏感性增高，造成对肿瘤的杀伤作用增强。有临床数据显示，患有idh1突变/mgmt甲基化的患者存活时间较长，而没有idh1突变/没有mgmt甲基化 （即双阴性）的患者存活时间较短。
5.经研究，阿帕替尼可能通过调控thbsi基因抑制人胶质瘤细胞的体外增殖、细胞周期，进而影响了胶质瘤的生长。但是单用阿帕替尼对于高级脑胶质瘤的治疗疗效不好。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一种用于治疗iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物，对难治性iii~iv级脑胶质瘤有较好的疗效。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于治疗iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物，所述联合用药物组合物包括，人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液、甲磺酸阿帕替尼。
8.作为一种优选方式，所述人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的用药比例为1.25:1。
9.作为一种优选方式，所述联合用药组合物中，每份药物组合物中，甲磺酸阿帕替尼的含量为250mg。
10.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明所述的人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液、甲磺酸阿帕替尼联合用药药物组合物能起到协同效应，对于治疗iii~iv级脑胶质瘤有较好效果。
具体实施方式
11.为更进一步阐述本发明所采用的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案。
12.实验材料：120只4周龄的balb/c无胸腺裸鼠、人源性iii级胶质瘤细胞、人源性iv级胶质瘤细胞、人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液、甲磺酸阿帕替尼；实验方法：细胞制备：取对数生长期细胞，制成2
×ꢀ
个/ ml的单细胞悬液，37℃保存；动物接种：动物接种腹腔注射 aldrich（0.2m/10g）麻醉后，左手固定裸鼠头部；选择头颅的顶枕区域（人字缝前3mm，中线右侧旁开2mm），右手持抽取100μl胶质瘤细胞悬液的微量加样器，垂直颅骨外板，旋转缓慢进针，落空感后，继续进针2mm，回抽有阻力、无脑脊液吸出，10min内缓慢注入，注射完毕留针5min，待细胞沉积，缓慢拔针，透过透明的骨板观察颅内是否出血，若出血，可去少许骨瓣减压；动物组分为2组，每组60只，一组接种人源性iii级胶质瘤细胞、另一组接种人源性iv级胶质瘤细胞。pd-1（shr-1210）10-20mg，甲磺酸阿帕替尼25-50mg，给药干预实验：实验组1（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的联合用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；实验组2（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的联合用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；对照组1（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；对照组2（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼35mg，一周一次，持续三周；对照组3（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，一周一次，持续三周；对照组4（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）35mg，一周一次，持续三周；
对照组5（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；对照组6（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼35mg，一周一次，持续三周；对照组7（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，一周一次，持续三周；对照组8（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）35mg，一周一次，持续三周；空白组1（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠注射生理盐水；用量是：甲生理盐水35mg，一周一次，持续三周；空白组2（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠注射生理盐水；用量是：甲生理盐水35mg，一周一次，持续三周；瘤细胞接种20d后给药，四周后处死小鼠，获取肿瘤。
13.标本处理：10%（体积分数）甲醛固定4h后取材，继续固定24h。依次加入梯度乙醇，透明、浸蜡，制作蜡块。
14.切片染色和图像分析：3μm厚的切片，脱蜡至水，常规he染色，然后以抗人gfap单克隆抗体为一抗，二抗为鼠抗人抗体，用 evisiontm的两步法行免疫组化染色。
15.双盲阅片，在10（目镜）
×
20（物镜）倍镜下，同台仪器采集jpeg格式病理图片；用图像分析软件测定肿瘤相对面积，a/10（a，检测程序实际测得的肿瘤范围光点数），单位mm2；肿瘤直径为 ，单位mm;脑胶质瘤体积=解剖显微镜下实际面积*病理切片下肿瘤直径。
16.实验结果：表1 裸鼠体重变化组别接种前平均重量接种后平均重量实验组120.2223.12实验组221.1223.56对照组120.2320.95对照组221.1421.23对照组320.3021.14对照组420.0820.68对照组520.1320.96对照组621.5922.06对照组721.0321.68对照组820.9521.48空白组120.8818.76空白组221.3617.92结果分析：实验组中，裸鼠荷瘤后活动减少，但是体重均有上升，说明药物在一定程度上控制住了肿瘤细胞，对照组中体重变化不大，说明药物控制程度一般，空白组体重大
量减少，说明肿瘤细胞有较大影响。
17.表2 解剖镜下组织形态统计组别平均体积（mm2）微血管数平均值实验组14.2
±
3.15.9
±
4.3实验组24.8
±
3.56.0
±
3.1对照组15.3
±
4.17.2
±
5.1对照组25.8
±
3.28.4
±
6.3对照组35.6
±
3.77.2
±
4.4对照组45.3
±
4.28.2
±
4.2对照组55.0
±
4.17.6
±
5.7对照组65.2
±
3.98.8
±
7.5对照组75.9
±
4.27.2
±
3.6对照组85.1
±
3.27.9
±
6.1空白组16.2
±
4.19.3
±
5.4空白组26.8
±
5.29.9
±
8.7结果分析：通过不同的联合用药方式，实验组的裸鼠肿瘤的体积相对较小，同时微血管数量也相对较少，由于脑胶质瘤一旦完成神经血管化，病理血管形成，肿瘤细胞就具有向周围正常脑组织浸润、侵袭，因此，相对较少的微血管也说明的采用人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的联合用药物组合物具有抑制脑胶质瘤发展的效果。
18.值得说明的是，基于上述技术方案的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。
技术领域
1.本发明属于医药领域，涉及一种用于治疗iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物。
背景技术：
2.胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤，大约占颅内肿瘤的80%，在我国发病率为 (5 ~8)/10万。脑胶质瘤恶性程度高，5年病死率在全身各系统肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌；2016年who根据病理学上的细胞恶性程度，可以将胶质瘤分为i、ii、iii、iv 四个级别，通常把i/ ii 级胶质瘤视为低级别胶质瘤，iii/iv级胶质瘤多视为高级别胶质瘤。对于低级别胶质瘤患者，早期发现时给予积极治疗预后较好，而高级别胶质瘤患者，发病时常处于疾病发展后期，已有明显的占位进而影响患者的生理功能，即使给予治疗预后也不佳，部分患者的生存期＜2年，5年生存率不足5%。
3.目前已有多个分子标志物被证实与胶质瘤的预后及放化疗的敏感性相关，目前已经发现 idh-1、hmgb1、mgmt、tert、atrx、vegf 等和胶质瘤的发生发展有密切关系，在胶质瘤的演变过程中有重要作用；从既往文献上看，胶质瘤tmz的耐药性主要与idh-1突变和mgmt甲基化水平有关，异柠檬酸脱氢酶1(idh1)编码的蛋白质，将异柠檬酸催化氧化脱羧的为α-酮戊二酸，在三羧酸循环中起重要作用，异柠檬酸脱氢酶 (idh)突变是胶质瘤中的常见突变，idh1突变被认为是胶质瘤发生和发展的早期事件，许多研究表明idh1突变的存在或缺失有助于脑胶质瘤的预后，idh1突变可影响胶质瘤术后放化疗的敏感性，与idh1野生型患者相比，idh1突变患者手术后进行放疗和化疗可明显延长无进展生存期(p《0.001)，在同一级别脑胶质瘤中伴有idh1突变患者的存活时间明显长于野生型 idh1患者，idh1基因突变能够引起高甲基化的发生。
4.o6-甲基鸟嘌呤dna甲基转移酶 (o6
‑ꢀ
alkylguanine dna alkyltransferase, mgmt)基因由5个外显子组成，位于染色体10q26上，正常情况下其主要功能是表达dna修复蛋白，该蛋白在体内的作用是去除鸟嘌呤上的烷基加和物，保护细胞免受损伤；同时对替莫唑胺造成的损伤也具有修复作用，在某些条件下，或者说在idh1突变后诱导cpg岛甲基化，造成mgmt 表达的沉默，进而造成 dna 修复蛋白的生成障碍；同时可使替莫唑胺等化疗药物对胶质瘤的敏感性增高，造成对肿瘤的杀伤作用增强。有临床数据显示，患有idh1突变/mgmt甲基化的患者存活时间较长，而没有idh1突变/没有mgmt甲基化 （即双阴性）的患者存活时间较短。
5.经研究，阿帕替尼可能通过调控thbsi基因抑制人胶质瘤细胞的体外增殖、细胞周期，进而影响了胶质瘤的生长。但是单用阿帕替尼对于高级脑胶质瘤的治疗疗效不好。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一种用于治疗iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物，对难治性iii~iv级脑胶质瘤有较好的疗效。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于治疗iii~iv级脑胶质瘤的联合用药组合物，所述联合用药物组合物包括，人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液、甲磺酸阿帕替尼。
8.作为一种优选方式，所述人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的用药比例为1.25:1。
9.作为一种优选方式，所述联合用药组合物中，每份药物组合物中，甲磺酸阿帕替尼的含量为250mg。
10.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明所述的人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液、甲磺酸阿帕替尼联合用药药物组合物能起到协同效应，对于治疗iii~iv级脑胶质瘤有较好效果。
具体实施方式
11.为更进一步阐述本发明所采用的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案。
12.实验材料：120只4周龄的balb/c无胸腺裸鼠、人源性iii级胶质瘤细胞、人源性iv级胶质瘤细胞、人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液、甲磺酸阿帕替尼；实验方法：细胞制备：取对数生长期细胞，制成2
×ꢀ
个/ ml的单细胞悬液，37℃保存；动物接种：动物接种腹腔注射 aldrich（0.2m/10g）麻醉后，左手固定裸鼠头部；选择头颅的顶枕区域（人字缝前3mm，中线右侧旁开2mm），右手持抽取100μl胶质瘤细胞悬液的微量加样器，垂直颅骨外板，旋转缓慢进针，落空感后，继续进针2mm，回抽有阻力、无脑脊液吸出，10min内缓慢注入，注射完毕留针5min，待细胞沉积，缓慢拔针，透过透明的骨板观察颅内是否出血，若出血，可去少许骨瓣减压；动物组分为2组，每组60只，一组接种人源性iii级胶质瘤细胞、另一组接种人源性iv级胶质瘤细胞。pd-1（shr-1210）10-20mg，甲磺酸阿帕替尼25-50mg，给药干预实验：实验组1（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的联合用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；实验组2（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的联合用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；对照组1（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；对照组2（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼35mg，一周一次，持续三周；对照组3（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，一周一次，持续三周；对照组4（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）35mg，一周一次，持续三周；
对照组5（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼10mg，一周一次，持续三周；对照组6（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：甲磺酸阿帕替尼35mg，一周一次，持续三周；对照组7（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）25mg，一周一次，持续三周；对照组8（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠接受甲磺酸阿帕替尼用药；用药剂量是：人源化抗体pd-1（shr-1210）35mg，一周一次，持续三周；空白组1（n=10）：接种人源性iii级胶质瘤细胞的小鼠注射生理盐水；用量是：甲生理盐水35mg，一周一次，持续三周；空白组2（n=10）：接种人源性iv级胶质瘤细胞的小鼠注射生理盐水；用量是：甲生理盐水35mg，一周一次，持续三周；瘤细胞接种20d后给药，四周后处死小鼠，获取肿瘤。
13.标本处理：10%（体积分数）甲醛固定4h后取材，继续固定24h。依次加入梯度乙醇，透明、浸蜡，制作蜡块。
14.切片染色和图像分析：3μm厚的切片，脱蜡至水，常规he染色，然后以抗人gfap单克隆抗体为一抗，二抗为鼠抗人抗体，用 evisiontm的两步法行免疫组化染色。
15.双盲阅片，在10（目镜）
×
20（物镜）倍镜下，同台仪器采集jpeg格式病理图片；用图像分析软件测定肿瘤相对面积，a/10（a，检测程序实际测得的肿瘤范围光点数），单位mm2；肿瘤直径为 ，单位mm;脑胶质瘤体积=解剖显微镜下实际面积*病理切片下肿瘤直径。
16.实验结果：表1 裸鼠体重变化组别接种前平均重量接种后平均重量实验组120.2223.12实验组221.1223.56对照组120.2320.95对照组221.1421.23对照组320.3021.14对照组420.0820.68对照组520.1320.96对照组621.5922.06对照组721.0321.68对照组820.9521.48空白组120.8818.76空白组221.3617.92结果分析：实验组中，裸鼠荷瘤后活动减少，但是体重均有上升，说明药物在一定程度上控制住了肿瘤细胞，对照组中体重变化不大，说明药物控制程度一般，空白组体重大
量减少，说明肿瘤细胞有较大影响。
17.表2 解剖镜下组织形态统计组别平均体积（mm2）微血管数平均值实验组14.2
±
3.15.9
±
4.3实验组24.8
±
3.56.0
±
3.1对照组15.3
±
4.17.2
±
5.1对照组25.8
±
3.28.4
±
6.3对照组35.6
±
3.77.2
±
4.4对照组45.3
±
4.28.2
±
4.2对照组55.0
±
4.17.6
±
5.7对照组65.2
±
3.98.8
±
7.5对照组75.9
±
4.27.2
±
3.6对照组85.1
±
3.27.9
±
6.1空白组16.2
±
4.19.3
±
5.4空白组26.8
±
5.29.9
±
8.7结果分析：通过不同的联合用药方式，实验组的裸鼠肿瘤的体积相对较小，同时微血管数量也相对较少，由于脑胶质瘤一旦完成神经血管化，病理血管形成，肿瘤细胞就具有向周围正常脑组织浸润、侵袭，因此，相对较少的微血管也说明的采用人源化抗体pd-1（shr-1210）注射液与甲磺酸阿帕替尼的联合用药物组合物具有抑制脑胶质瘤发展的效果。
18.值得说明的是，基于上述技术方案的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。
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