检测氯诺昔康有关物质的方法与流程

1.本发明属于物质检测技术领域，具体涉及一种检测氯诺昔康有关物质的方法。


背景技术：

2.氯诺昔康(lornoxicam,chlortenoxicam)化学名称：6-氯-4-羟基-2-甲基-n-2-吡啶基-2h-噻吩并[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，是一种新型的非甾体抗炎药(nsaid)，具有镇痛、抗炎、解热等作用。氯诺昔康原料在溶剂中的溶解度差，目前，市售氯诺昔康均依据中国药典2020年版二部氯诺昔康原料中的有关物质方法进行测定，该方法检测灵敏度低，且针对注射用原料的杂质分离效果不好，已知杂质、未知杂质间均有相互干扰的情况，不利于各杂质含量的计算。中国药典2020年版二部检测氯诺昔康原料中的有关物质的方法不能满足杂质的有效分离。
[0003]
因此，亟需开发一种适用于氯诺昔康中有关物质测定的方法，以满足杂质检出灵敏度和杂质间的分离度，并能达到增强方法的适用性及耐用性的目的。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种检测氯诺昔康有关物质的方法，通过色谱条件的筛选及优化，能够保证氯诺昔康样品中各杂质的良好检出和有效分离，能够用于氯诺昔康中各杂质的定量；本发明适用性及耐用性均良好。
[0005]
本发明所述的检测氯诺昔康有关物质的方法，采用液相色谱进行检测，其流动相为流动相a和流动相b的混合物，流动相a为0.025mol/l醋酸铵溶液，用氨水调ph至8.0；流动相b为甲醇。
[0006]
其中：
[0007]
检测时，采用如下的梯度洗脱程序进行洗脱：
[0008]
时间/分钟流动相a/％流动相b/％07822135545353565453565507822657822。
[0009]
检测时，供试品溶液进样浓度为2mg/ml。波长为280nm；进样量为10μl；柱温为30
±
2℃；流速为0.9-1.1ml/min；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，4.6
×
250mm，5μm。
[0010]
优选柱温为30℃；优选流速为1.0ml/min。
[0011]
检测时，稀释剂为0.025mol/l醋酸铵溶液和甲醇的混合物，两者体积比为50:50；醋酸铵溶液用氨水调ph值至8.0。
[0012]
空白溶液为0.025mol/l醋酸铵溶液和甲醇的混合物，两者体积比为50:50；醋酸铵溶液用氨水调ph值至8.0。
[0013]
对照品溶液制备过程如下，分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，加稀释剂制成每1ml含各物质2μg的混合溶液。
[0014]
供试品溶液制备过程如下，称取氯诺昔康供试品20mg，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0015]
本发明所述的检测氯诺昔康有关物质的方法：将空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各取10μl注入液相色谱仪中，得到结果，按照面积归一法计算供试品溶液中有关物质的含量。
[0016]
本发明所述的检测氯诺昔康有关物质的方法还包括供试品 杂质混合溶液，将供试品 杂质混合溶液取10μl注入液相色谱仪中，得到hplc图谱。
[0017]
供试品 杂质混合溶液制备：称取氯诺昔康供试品20mg，再精密移取杂质混合贮备溶液1ml共同置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0018]
所述杂质混合贮备溶液的配制：分别称取替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质20μg的混合溶液。
[0019]
本发明的有益效果如下：
[0020]
中国药典2020年版二部氯诺昔康原料中的有关物质方法检测灵敏度低，且原料的杂质分离效果不好，已知杂质、未知杂质间均有相互干扰的情况，不能满足杂质的有效分离。而本发明通过色谱条件的筛选及优化，能够满足杂质检出灵敏度和杂质间的分离度，保证氯诺昔康样品中各杂质的良好检出和有效分离，能够用于氯诺昔康样品中各杂质的定量，精密度好；本发明适用性、重复性及耐用性均良好。
附图说明
[0021]
图1是本发明空白溶液的hplc图谱；
[0022]
图2是本发明对照品溶液的hplc图谱；
[0023]
图3是本发明供试品溶液的hplc图谱；
[0024]
图4是本发明供试品 杂质混合溶液的hplc图谱；
[0025]
图5是按照中国药典2020年版二部标准方法检测供试品 杂质混合溶液的hplc图谱；
[0026]
图6是按照中国药典2020年版二部标准方法检测杂质混合贮备溶液的hplc图谱；
[0027]
图7是方法1中氯诺昔康供试品 杂质混合溶液的hplc图谱；
[0028]
图8是方法2中氯诺昔康供试品 杂质混合溶液的hplc图谱；
[0029]
图9是专属性试验中空白溶液、供试品溶液、对照品溶液三种溶液的hplc图谱；
[0030]
其中从上至下依次是空白溶液的hplc曲线、供试品溶液的hplc曲线、对照品溶液的hplc曲线；
[0031]
图10是线性试验中杂质y0-z2的线性标准曲线；
[0032]
图11是线性试验中杂质y0-z3的线性标准曲线；
[0033]
图12是线性试验中氯诺昔康的线性标准曲线；
[0034]
图13是线性试验中杂质y0-z4的线性标准曲线；
[0035]
图14是线性试验中杂质2-氨基吡啶的线性标准曲线；
[0036]
图15是线性试验中杂质替诺昔康的线性标准曲线；
[0037]
图16是线性试验中杂质y1的线性标准曲线；
[0038]
图17是线性试验中杂质y0-z6的线性标准曲线；
[0039]
图18是线性试验中杂质y0-z5的线性标准曲线；
[0040]
图19是线性试验中杂质y1-z2的线性标准曲线。
具体实施方式
[0041]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0042]
实施例1
[0043]
1、色谱条件
[0044][0045][0046]
2、实验过程
[0047]
(1)稀释剂：0.025mol/l醋酸铵溶液(氨水调ph值至8.0)和甲醇的混合物，两者体积比为50:50。
[0048]
(2)供试品溶液制备：称取氯诺昔康供试品20mg，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0049]
(3)对照品溶液制备：分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质2μg的混合溶液。
[0050]
(4)空白溶液：0.025mol/l醋酸铵溶液(氨水调ph值至8.0)和甲醇的混合物，两者体积比为50:50。
[0051]
(5)供试品 杂质混合溶液制备：称取氯诺昔康供试品20mg，再精密移取杂质混合贮备溶液1ml共同置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0052]
所述杂质混合贮备溶液的配制：分别称取替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质20μg的混合溶液。
[0053]
(6)将空白溶液(空白溶剂)、对照品溶液(混标溶液)、供试品溶液、供试品 杂质混合溶液(供试品加标溶液)各取10μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，具体见图1-图4，按照面积归一法计算供试品溶液中有关物质的含量。
[0054]
通过对比对照品溶液与供试品 杂质混合溶液的谱图可以看出，供试品 杂质混合溶液中各物质能够良好检出和有效分离，所以采用本发明的色谱条件满足杂质检出灵敏度和杂质间的分离度，能够准确检测出供试品溶液中有关杂质的含量。
[0055]
(一)本发明对检测时的色谱条件做了以下研究，具体过程如下。
[0056]
1、根据氯诺昔康中国药典2020年版二部标准中公布的有关物质检测方法将杂质混合贮备溶液、供试品 杂质混合溶液按照表1中的色谱条件注入液相色谱仪中，记录色谱图，见图5和图6。
[0057]
表1 氯诺昔康中国药典2020年版二部标准中有关物质方法色谱条件
[0058][0059]
根据图5-图6可以看出，按照氯诺昔康中国药典2020年版二部标准中公布的有关物质检测方法进行试验后得到的结果并不能满足杂质的有效分离，较差的分离度会影响色谱峰积分，进而影响杂质含量测定的结果准确度；且供试品浓度低，导致方法灵敏度不高，从而影响成分含量的计算，该方法的等度洗脱中甲醇的初始比例为42％，占比较高，导致极性较大的杂质(杂质y0-z2与杂质y0-z3)没有保留，空白溶剂干扰极性较大的杂质检测，会影响杂质的计算结果，不能给产品中各物质含量的测定提供合理依据；而且该方法中供试品浓度低，导致限度浓度杂质检出能力差。所以重新开发、优化得到适用于该品种有关物质测定的方法，以满足杂质检出灵敏度，杂质间的分离，并能达到增强方法的适用性及耐用性的目的。
[0060]
表2 已知杂质保留时间汇总表
[0061][0062][0063]
2、对氯诺昔康有关物质检测条件进行筛选。由于杂质间极性差别较大，以等度的方式不能达到所有杂质的良好分离，需要根据杂质的极性差别，以梯度洗脱的方式进行考察，所以进行梯度洗脱来优化方法。选择醋酸盐(氨水调节ph)-甲醇体系可以用于液质分
析，选择体系稳定的0.025mol/l醋酸铵溶液，为使氯诺昔康在溶液中保持分子状态，流动相的ph值适当提高，故用氨水调ph至8.0，作为流动相a；对比甲醇和乙腈，乙腈的洗脱能力较强，由于部分杂质的极性较接近，使用乙腈作为流动相可能会不利于提高杂质间的分离度；选择应用梯度洗脱对其进行分离，为保证色谱峰峰型良好，保留时间相对稳定；选择洗脱能力适中的甲醇作为流动相b，尝试梯度的方式进行洗脱。
[0064]
(1)方法1：色谱条件如下表3所示，将氯诺昔康供试品 杂质混合溶液注入液相色谱仪中，氯诺昔康供试品 杂质混合溶液的结果如图7所示。
[0065]
表3 有关物质方法1的色谱条件
[0066][0067]
通过图7可知，各已知杂质分离得到明显改善，只有运行至20min时，两个杂质(杂质y0-z5与杂质y0-z6)的分离情况差，表明在该时间段的有机相比例占比稍高，故调整该时间段有机相的占比进行实验；如最先被洗脱出的杂质在4.3分钟处出峰，为缓解20min时间段有机相的占比，可稍增大初始有机相比例，使得20min时间段有机相比例可以缓慢增加，进而提高该时段杂质间的分离度。
[0068]
(2)方法2：色谱条件如下表4所示，将氯诺昔康供试品 杂质混合溶液注入液相色谱仪中，氯诺昔康供试品 杂质混合溶液的结果如图8所示。
[0069]
表4 有关物质方法2的色谱条件
[0070][0071]
通过图8可知，原方法1的分离度较差的两个杂质(杂质y0-z5与杂质y0-z6)在方法2中分离度得到明显改善，其他各杂质间的分离度，主峰与相邻峰间的分离度均满足要求。另外，考虑杂质y0-z5与杂质y0-z6分离度虽明显改善，满足检测要求，但是依然存在风险。
[0072]
(3)方法3：在方法2的基础上，调整甲醇初始比例，各色谱条件如下表5所示，将氯诺昔康供试品 杂质混合溶液注入液相色谱仪中，氯诺昔康供试品 杂质混合溶液的测定结果图谱如图4所示。
[0073]
表5 有关物质方法3的色谱条件
[0074][0075]
由图4可以看出，方法3中的条件均可保证已知杂质的检测不受干扰，且进样精密度良好，峰面积和保留时间的重现性良好。
[0076]
(二)本发明进行了专属性试验、检测限试验、重复性试验、线性试验、进样精密度试验，具体内容如下：
[0077]
1、专属性试验
[0078]
溶液配制：
[0079]
(1)稀释剂(空白溶液)：0.025mol/l醋酸铵溶液(氨水调ph值至8.0)和甲醇的混合物，两者体积比为50:50。
[0080]
(2)对照品溶液(混标溶液)制备：分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质2μg的混合溶液。
[0081]
(3)供试品溶液制备：称取氯诺昔康供试品20mg，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0082]
取上述空白溶液、供试品溶液、对照品溶液各10μl注入液相色谱仪中，记录色谱图，如图9所示。通过图9可以看出空白溶剂不干扰样品检测。
[0083]
2、进样精密度试验
[0084]
2.1溶液配制
[0085]
对照品贮备溶液(混标溶液)：分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质2μg的混合溶液。取样，并连续进样6次注入液相色谱仪进行检测。
[0086]
2.2测试结果见表6。
[0087]
表6 进样精密度测试结果
[0088]
[0089][0090]
3、检测限试验
[0091]
取本发明对照品溶液，用稀释剂稀释，以信噪比为3:1时的相应浓度确定为检测限，具体试验结果数据如表7。
[0092]
表7 检测限试验结果
[0093]
[0094][0095]
4、重复性试验
[0096]
重复性是通过配制6个供试品溶液并进行测试，每个溶液进样1次进行验证。要求6次测定结果已知杂质含量的相对标准偏差应符合《中国药典》2020年版四部通则9101中的相关要求，来证实方法具有良好的精密度。
[0097]
4.1溶液配制
[0098]
(1)稀释剂(空白溶液)：0.025mol/l醋酸铵溶液(氨水调ph值至8.0)和甲醇的混合物，两者体积比为50:50。
[0099]
(2)对照品贮备溶液：分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质20μg的混合溶液。
[0100]
(3)供试品加标溶液：称取氯诺昔康供试品20mg置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶，再加入上述对照品贮备溶液1ml置于该容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。将上述6份供试品加标溶液进行检测，具体数据见表8。
[0101]
表8 重复性测试结果-供试品加标溶液
[0102]
[0103][0104]
5、线性试验
[0105]
考察被测物质在限定范围内的线性变化情况。
[0106]
5.1溶液配制
[0107]
定量限贮备液：分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基-6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质2μg的混合溶液。
[0108]
对照品贮备溶液：分别称取氯诺昔康、替诺昔康、5-氯-3-亚磺基-2-噻吩-羧酸、5-氯-2-羧基-3-噻吩磺酸、2-氨基吡啶、6-氯-4-羟基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e]-1,2-噻嗪-3-甲酸甲酯-1,1-二氧化物、氧代(2-吡啶氨基)-乙酸、1,3-二吡啶-2-基脲、甲基6-氯-4-甲氧基-2-甲基-2h-噻吩[2,3-e][1,2]噻嗪-3-羧酸盐-1,1-二氧化物、6-氯-4-羟基-2-甲基-n-(吡啶-2-基)-2h-噻吩并[2,3-e][1,2]噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，置于10ml容量瓶中，加稀释剂超声助溶并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含各物质20μg的混合溶液。
[0109]
线性溶液1(定量限)：精密定量限贮备液2ml置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0110]
线性溶液2(50％)：精密量取对照品贮备溶液0.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0111]
线性溶液3(80％)：精密量取对照品贮备溶液0.8ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0112]
线性溶液4(100％)：精密量取对照品贮备溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0113]
线性溶液5(120％)：精密量取对照品贮备溶液1.2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0114]
线性溶液6(150％)：精密量取对照品贮备溶液1.5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0115]
线性溶液7(200％)：精密量取对照品贮备溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0116]
精密量取上述线性溶液1-7各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0117]
5.2试验结果见表9-表18。
[0118]
表9 线性-杂质y0-z2
[0119][0120]
表10 线性-杂质y0-z3
[0121][0122]
表11 线性-氯诺昔康
[0123][0124]
表12 线性-杂质y0-z4
[0125][0126]
表13 线性-杂质2-氨基吡啶
[0127]
[0128][0129]
表14 线性-杂质替诺昔康
[0130][0131]
表15 线性-杂质y1
[0132]
[0133][0134]
表16 线性-杂质y0-z6
[0135][0136]
表17 线性-杂质y0-z5
[0137][0138]
表18 线性-杂质y1-z2
[0139][0140]
上述结果表明：各已知杂质及氯诺昔康在定量限至4μg范围内线性关系良好，响应因子rsd均小于10％，相关系数r均大于0.9900，y轴截距偏差％均小于25％。