一种肿瘤靶向性的复合纳米药物及其制备方法和用途

1.本发明属于制药领域，具体涉及一种肿瘤靶向性的复合纳米药物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.脂质体是由磷脂双分子层和胆固醇组成的类似细胞膜的一种封闭性囊泡，具有安全性、大小可控性和易于功能化等优点，早在上个世纪末就被作为一种理想的药物递送载体。但是传统的脂质体进入人体血液循环后易被血浆蛋白粘附，激发单核巨噬细胞系统对其的吞噬作用；此外，由于其倾向富集于肝、脾等网状内皮系统(reticuloendothelial system,res)丰富的组织，加速了脂质体在血液中的清除。南京绿叶思科药业公司生产的紫杉醇脂质体(英文名称：ptx-liposome，商品名：力扑素)是我国第一个批准上市的脂质体化疗药物制剂，它将疏水性化疗药紫杉醇(paclitaxel，ptx)包封在了磷脂双分子层中。虽然力扑素已经广泛应用于临床恶性肿瘤的治疗，但其半衰期短以及缺乏靶向性的问题依然存在，传统脂质体的半衰期通常在10小时左右，肿瘤患者需要加大紫杉醇脂质体的使用频率才能达到抑制肿瘤生长的效果。此外，使用传统ptx-liposome化疗伴随着众多副作用，如出现骨髓抑制、神经毒性、也血管毒性、肝脏毒性等一系列严重的不良反应，使肿瘤治疗效果大打折扣。以上问题使脂质体作为化疗药物载体的应用受到了一定限制，因此如何提高紫杉醇脂质体的疗效并减少其副作用是该领域的研究热点之一。
3.克服传统紫杉醇脂质体局限性的方法之一是对脂质体进行配体靶向修饰，即应用特异性配体与脂质体表面偶联，选择性地将紫杉醇脂质体递送到所需的作用位点(如肿瘤组织)。所使用的特异性配体通常是肽、碳水化合物、糖蛋白或受体配体等分子，这些分子可以选择性地识别并结合肿瘤细胞表达的目标抗原，增加紫杉醇脂质体的靶向性以及药物递送量。但是，功能基团的直接引入往往使制备过程复杂化，而且通常会降低脂质体对ptx的包封率。这可能是因为修饰过程中涉及的化学反应、纯化等步骤导致ptx的释放。此外，有文献报道，脂质体表面修饰的功能基团不能超过10个，否则容易导致免疫清除等问题。更为重要的是，功能基团对于人体来说都是免疫原性极强的外来物质，进入循环系统后极易激活机体免疫系统，不仅会引起巨噬细胞的吞噬加速其清除，甚至会引起严重的过敏反应，危及患者生命，因此目前这种方法都还停留在实验室阶段。
4.外泌体(exosome，简称exo)是一种细胞主动分泌的纳米级小囊泡，直径为30～150nm。最初，这种复杂的小囊泡结构在网织红细胞成熟过程中被发现，随后研究人员又陆续发现树突细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等不同种类的细胞都可释放出外泌体。外泌体并不是简单的细胞脱落碎片，它能运载细胞内源性蛋白质、核酸等生物信息分子，通过辨认、黏附、融合靶细胞将携带的信息物质传递给靶细胞，进而影响靶细胞生物代谢。外泌体作为内源性的纳米尺寸囊泡，其具有免疫原型和毒性较低的优点。
5.文献(macrophage-derived exosome-mimetic hybrid vesicles for tumor targeted drug delivery,acta biomaterialia 94(2019)482
–
494)报道了一种制备抗肿
瘤药物的方法：1.将磷脂溶解在有机溶剂，通过薄膜法制备磷脂薄膜；2使用巨噬细胞来源的外泌体溶液水化磷脂(1ml样品中的投料比为200μg外泌体蛋白：1000μg磷脂)磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体；3通过超声法处理多层囊泡结构脂质体，通过挤出机将多层囊泡结构脂质体制备成单层结构的脂质体-外泌体杂合体(hybrid exosomes，he)；4.通过电穿孔的方式将多柔比星负载进入he，得到抗肿瘤药物。该方法以巨噬细胞来源的外泌体，磷脂和多柔比星为原料制得了一种抗肿瘤药物，但是，该方法存在以下不足：(1)负载多柔比星时采用了高压条件，高压放热可能会降解蛋白，降低外泌体的靶向性；(2)该方法制得的he在保存期间不稳定，易聚集，所得抗肿瘤药物多分散指数较大；(3)该方法采用的外泌体量较大，增加了生产成本；(4)由于该方法难以提高紫杉醇的包封率，不适合用于包载紫杉醇。
6.开发出一种合成条件温和、成本更低、对紫杉醇的包封率更高的方法来制备具有优异的抗肿瘤作用的紫杉醇复合纳米药物具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种粒径均匀且具有高紫杉醇负载量的肿瘤靶向性的复合纳米药物及其制备方法和用途。
8.本发明提供了一种复合纳米药物，它是以肿瘤细胞来源的外泌体、紫杉醇、磷脂和胆固醇为原料制得的，其中，磷脂和肿瘤细胞来源的外泌体的质量比为100：(0.1～2.5)。
9.进一步地，所述磷脂和肿瘤细胞来源的外泌体的质量比为100：(1～2)。
10.进一步地，所述磷脂和肿瘤细胞来源的外泌体的质量比为100：2。
11.进一步地，所述紫杉醇、磷脂、胆固醇的质量比为4：(100～140)：(5～20)；
12.所述磷脂为蛋黄卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或两种以上的混合。
13.进一步地，所述紫杉醇、磷脂、胆固醇的质量比为4：120：10；
14.所述磷脂为蛋黄卵磷脂。
15.进一步地，所述肿瘤细胞来源的外泌体是按照以下方法制得的：将肿瘤细胞用无外泌体胎牛血清培养基培养后，收集培养上清，先用切向流超滤法浓缩上清，然后用超速离心法富集外泌体，即得。
16.进一步地，所述超速离心的速度为100000g，时间为70分钟。
17.进一步地，所述肿瘤细胞为肺癌细胞。
18.进一步地，所述复合纳米药物的粒径为100-200nm，多分散指数《0.15，紫杉醇包封率为88％以上。
19.本发明还提供了一种制备上述复合纳米药物的方法，所述方法包括以下步骤：
20.(1)将紫杉醇、磷脂和胆固醇溶解于有机溶剂，成膜得到薄膜；
21.(2)在薄膜中加入肿瘤细胞来源的外泌体的溶液，水化形成多层囊泡结构脂质体；
22.(3)将多层囊泡结构脂质体通过微射流均质机、高压挤出机或者高压匀质机，得到复合纳米药物。
23.进一步地，步骤(1)中，所述有机溶剂为乙醇、三氯甲烷中的一种或两种；所述紫杉醇与有机溶剂的质量体积比为4：(3～5)mg/ml；所述成膜的方法为薄膜法；
24.步骤(2)中，所述肿瘤细胞来源的外泌体的溶液由肿瘤细胞来源的外泌体与水或
缓冲液组成；所述水化是在搅拌和/或超声下进行的。
25.进一步地，所述缓冲液为pbs缓冲液、dpb缓冲液或hepes缓冲液。
26.本发明还提供了上述的复合纳米药物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤优选为肺癌。
[0027]“肺癌细胞外泌体”指肺癌细胞来源的外泌体。
[0028]
本发明将紫杉醇-磷脂薄膜与癌细胞来源的外泌体融合后得到了一种复合纳米药物，该复合纳米药物的粒径均匀，多分散指数(pdi)低。该复合纳米药物同时拥有脂质体和外泌体的优势，不仅具有高ptx负载量，还具有优异的肿瘤靶向性和低免疫原性，对同源性肿瘤具有优异的抑制效果，应用前景广阔。
[0029]
本发明制备复合纳米药物的方法避免了高压条件，合成条件温和，同时还降低了外泌体的使用量，节约了成本，适合扩大化生产。
[0030]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0032]
图1为实施例1制备肿瘤靶向性复合纳米药物的流程示意图。
[0033]
图2为体内抗肿瘤测试结果。图中，
↑
表示通过尾静脉给药的时间，control为对照组(不给药组)，hybrid为复合纳米药物组，ptx-liposome为紫杉醇脂质体组，n＝3。
[0034]
图3为小动物活体成像结果，其中a图为复合纳米药物组，b图为紫杉醇脂质体组，图中的红色圆圈内为肺癌移植瘤。
具体实施方式
[0035]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0036]
其中，肺癌细胞外泌体的制备方法如下：
[0037]
方法一：培养瓶培养肺癌细胞，待细胞密度为80～90％时使用无外泌体胎牛血清培养基培养48h，48h后收集细胞培养上清，切向流超滤法浓缩上清(mwco：10k，30k，100k)，超速离心法(100000g，70分钟)富集肺癌细胞外泌体，得到的外泌体用pbs或hepes缓冲液重悬，使用0.22μm过滤上述液体并保存于-80℃。
[0038]
方法二：为了获得更多的癌细胞外泌体，通过饥饿法培养肺癌细胞，使用无胎牛血清培养基培养48h，48h后收集细胞培养上清，切向流超滤法浓缩上清(mwco：10k，30k，100k)，超速离心法(100000g，70分钟)富集肺癌细胞外泌体，得到的外泌体用pbs/hepes等缓冲重悬，使用0.22μm过滤上述液体并保存于-80℃。
[0039]
磷脂：蛋黄卵磷脂(epc)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)，二油酰基卵磷脂(dopc)，二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)。
[0040]
实施例1、制备肿瘤靶向性的复合纳米药物
[0041]
按照图1所述流程示意图，制备肿瘤靶向性的复合纳米药物：
[0042]
第一步：将4mg紫杉醇、120mg蛋黄卵磷脂(epc)和10mg胆固醇溶解在3-5ml乙醇中，通过薄膜法制备紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)；其中，薄膜法的具体操作为将溶液在旋转蒸发仪上旋转，挥干溶剂成膜。
[0043]
第二步：向紫杉醇-磷脂薄膜中加入肺癌细胞外泌体的pbs溶液(控制1ml溶液中外泌体含量为20μg，对应采用的磷脂的量为1000μg)，在250rpm转速下搅拌以水化磷脂，磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体(multilaminar vesicles，简称mlv)；
[0044]
第三步：将mlv通过挤出机(先通过400nm的滤膜挤出，再通过200nm的滤膜挤出)，得到单层结构的复合纳米药物(粒径：100-200nm，pdi《0.15)。ptx包封率为92％。
[0045]
实施例2、制备肿瘤靶向性的复合纳米药物
[0046]
按照图1所述流程示意图，制备肿瘤靶向性的复合纳米药物：
[0047]
第一步：将4mg紫杉醇、120mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)和10mg胆固醇溶解在3-5ml乙醇中，通过薄膜法制备紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)；
[0048]
第二步：向紫杉醇-磷脂薄膜中加入肺癌细胞外泌体的pbs溶液(控制1ml溶液中外泌体含量为20μg，对应采用的磷脂的量为1000μg)，在250rpm转速下搅拌以水化磷脂，磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体(简称mlv)；
[0049]
第三步：将mlv通过挤出机(先通过400nm的滤膜挤出，再通过200nm的滤膜挤出)，得到单层结构的复合纳米药物(粒径：100-200nm,pdi《0.15)。ptx包封率为88％。
[0050]
实施例3、制备肿瘤靶向性的复合纳米药物
[0051]
按照图1所述流程示意图，制备肿瘤靶向性的复合纳米药物：
[0052]
第一步：将4mg紫杉醇、100mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、20mg二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)和10mg胆固醇溶解在3-5ml乙醇中，通过薄膜法制备紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)；
[0053]
第二步：向紫杉醇-磷脂薄膜中加入肺癌细胞外泌体的pbs溶液(控制1ml溶液中外泌体含量为20μg，对应采用的磷脂的量为1000μg)，在250rpm转速下搅拌以水化磷脂，磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体(简称mlv)；
[0054]
第三步：将mlv通过挤出机(先通过400nm的滤膜挤出，再通过200nm的滤膜挤出)，得到单层结构的复合纳米药物(粒径：100-200nm，pdi《0.15)。ptx包封率为90％。
[0055]
实施例4、制备肿瘤靶向性的复合纳米药物
[0056]
按照图1所述流程示意图，制备肿瘤靶向性的复合纳米药物：
[0057]
第一步：将4mg紫杉醇、100mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、20mg二油酰基卵磷脂(dopc)和10mg胆固醇溶解在3-5ml乙醇中，通过薄膜法制备紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)；
[0058]
第二步：向紫杉醇-磷脂薄膜中加入肺癌细胞外泌体的pbs溶液(控制1ml溶液中外泌体含量为20μg，对应采用的磷脂的量为1000μg)，在250rpm转速下搅拌以水化磷脂，磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体(简称mlv)；
[0059]
第三步：将mlv通过挤出机(先通过400nm的滤膜挤出，再通过200nm的滤膜挤出)，得到单层结构的复合纳米药物(粒径：100-200nm,pdi《0.15)。ptx包封率为90％。
[0060]
实施例5、制备肿瘤靶向性的复合纳米药物
[0061]
按照图1所述流程示意图，制备肿瘤靶向性的复合纳米药物：
[0062]
第一步：将4mg紫杉醇、120mg蛋黄卵磷脂(epc)和10mg胆固醇溶解在3-5ml乙醇中，通过薄膜法制备紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)；
[0063]
第二步：向紫杉醇-磷脂薄膜中加入肺癌细胞外泌体的pbs溶液(控制1ml溶液中外泌体含量为10μg，对应采用的磷脂的量为1000μg)，在250rpm转速下搅拌以水化磷脂，磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体(简称mlv)；
[0064]
第三步：将mlv通过挤出机(先通过400nm的滤膜挤出，再通过200nm的滤膜挤出)，得到粒径均一的单层结构的复合纳米药物(粒径：150nm,pdi《0.15)。ptx包封率为90％。
[0065]
以下为对照复合纳米药物的制备方法。
[0066]
对照例1、制备对照复合纳米药物
[0067]
第一步：将4mg紫杉醇、120mg蛋黄卵磷脂(epc)和10mg胆固醇溶解在3-5ml乙醇中，通过薄膜法制备紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)；
[0068]
第二步：向紫杉醇-磷脂薄膜中加入肺癌细胞外泌体的pbs溶液(控制1ml溶液中外泌体含量为30μg，对应采用的磷脂的量为1000μg)，在250rpm转速下水化磷脂，并进一步超声破碎三分钟，磷脂自组装形成多层囊泡结构脂质体(简称mlv)；
[0069]
第三步：将mlv通过挤出机(先通过400nm的滤膜挤出，再通过200nm的滤膜挤出)，大量mlv堵塞200nm滤膜，得到单层结构的复合纳米药物(粒径：300nm,pdi》0.3)。该复合纳米药物的粒径不均一，ptx包封率小于70％。
[0070]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0071]
实验例1、复合纳米药物的体内抗肿瘤测试
[0072]
1、实验方法
[0073]
测试样品：实施例1第三步制得的复合纳米药物，以实施例1第二步制得的紫杉醇-磷脂薄膜(简称ptx-liposome)为对照。
[0074]
动物模型：雌性6-8周龄c57bl/6j小鼠，建立肺癌皮下移植瘤模型。
[0075]
给药：以ptx 5mg/kg的剂量尾静脉注射药物，每两天一次，共5次。
[0076]
肿瘤大小测量：每天使用游标卡尺测量小鼠肿瘤短径与长径，计算肿瘤大小：肿瘤大小(mm3)＝长径(mm)
×
短径(mm)2/2。
[0077]
小动物活体成像：(1)将制备好的脂质体溶液，取1ml脂质体溶液加入12μl，10μm的dii(细胞膜红色荧光探针，激发波长549nm，发射波长565nm)，在室温染色30分钟。
[0078]
(2)荷瘤小鼠模型建成后，经尾静脉注射染有荧光的脂质体。
[0079]
(3)给药后4小时，用0.5％的戊巴比妥经腹腔注射麻醉小鼠，置于ivis(小动物活体成像)下拍摄荧光成像图。
[0080]
(4)通过荧光图像分析其靶向性。
[0081]
2、实验结果
[0082]
肿瘤大小测试结果如图2所示，可以看出，本发明制得的复合纳米药物对同源性肿瘤具有优异的抑制效果。并且，与紫杉醇-磷脂薄膜组相比，本发明复合纳米药物组的肿瘤显著减小(p＜0.05)。
[0083]
小动物活体成像结果如图3所示，可以看出，本发明制得的复合纳米药物对同源性肿瘤具有优异的靶向作用，并且靶向效果优于紫杉醇-磷脂薄膜。
[0084]
上述实验结果表明，本发明制得的复合纳米药物对同源性肿瘤具有优异的靶向作
用，具有优异的肿瘤抑制效果。
[0085]
综上，本发明提供了一种肿瘤靶向性的复合纳米药物及其制备方法和用途。该复合纳米药物的粒径均匀，多分散指数低。该复合纳米药物同时拥有脂质体和外泌体的优势，不仅具有高紫杉醇负载量，还具有优异的肿瘤靶向性和低免疫原性，对同源性肿瘤具有优异的抑制效果，应用前景广阔。本发明制备复合纳米药物的方法避免了高压条件，合成条件温和，同时还降低了外泌体的使用量，节约了成本，适合扩大化生产。