寡糖标志物及其在燕窝鉴定中的应用的制作方法

1.本发明涉及质控标志物，以及应用这类标志物鉴定燕窝的方法。具体而言，本发明涉及寡糖标志物，以及其在快速、专属、高效、低成本鉴定燕窝原材料及其相关产品中的应用和鉴定方法。


背景技术：

2.燕窝(edible bird’s nest，ebn)是雨燕科金丝燕属(aerodramus或 collocalia)的多种鸟类分泌的唾液与其羽绒混合凝结而筑成的巢。其中主要成分为糖蛋白，包含62-63％的蛋白质，25-27％的碳水化合物。现代研究表明，其具有免疫促进作用、抗病毒、促有丝分裂、强心等广泛药理学作用。因此，燕窝，作为一种在亚洲享有盛誉的功能性食品，深受消费者喜爱，具有较高的市场价值。但是，随着需求市场的增长，频频出现燕窝伪劣产品，常常以猪皮、银耳、琼脂等外观及口感类似的物质作为替代品，损害消费者权益，对燕窝市场及相关的质量监管带来巨大冲击。
3.目前关于燕窝的鉴定，开发了一系列方法，但所涉及方法均存在特异性差、耗时长、操作繁琐等缺点。例如，通过测定燕窝中的唾液酸含量进行鉴定，也有文献报道通过测定单糖进行鉴定。然而，唾液酸、甘露糖、n-乙酰基-半乳糖胺等单糖特异性均低，在鸡蛋，牛奶等动物制品中广泛存在，其鉴定结果的准确性偏低。再如，通过采用实时荧光pcr(血纤蛋白原和nadh 脱氢酶的靶向基因)和sds-page二维凝胶电泳等测定氨基酸组成、多肽谱进行鉴定。然而，这些方法灵敏度较低，不适用于蛋白含量较低的燕窝样品。同时，这些方法涉及提取、表征、酶解等多个步骤，操作繁琐耗时，在大批量样品的检测中，产生较高成本。在红外光谱、lc-ms结合统计学等其他手段中均存在类似的局限性。
4.因此，迫切需要发展对燕窝中独有的标志性成分的筛选和鉴定，建立具有简单快速、准确、低成本、高灵敏度、高特异性、高重复性，并且适用于大批量样本的商业应用的鉴定方法。


技术实现要素：

5.本发明涉及用于燕窝鉴别的寡糖标志物、寡糖标志物的制备方法、通过寡糖标志物鉴定燕窝的方法，以及寡糖标志物在快速、专属、高效、低成本鉴定燕窝原材料及其相关产品中的应用。
6.本发明所述的寡糖标志物及其在燕窝快速鉴定中的应用具有如下特点：特异性强、灵敏度高、操作简单、30min内可完成检测、实用性强，在燕窝原材料与相应产品均适用，具有广阔的市场前景和较大的经济和社会效益。
7.在本发明的一个方面，本发明涉及一种鉴别燕窝的方法，包括：
8.a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
9.b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物。
10.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述检测方法选自色谱分析法、
光谱分析法、质谱分析法、色谱联用分析法、色谱-光谱联用分析法、色谱-质谱联用分析法、毛细管电泳分析法、免疫分析法、核酸适配子结合分析法及其组合；优选地，所述检测方法为液相色谱-质谱联用法，特别优选lc-dad-q-tof-ms法和液相色谱-三重四极杆串联质谱(lc-qqq
‑ꢀ
ms/ms)。
11.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的色谱柱选自硅胶基质色谱柱、聚合物基质色谱柱、或者其他无机填料色谱柱，优选地，使用c18十八烷基键合硅胶液相色谱柱、 c8辛烷键合硅胶液相色谱柱、nh2氨基键合硅胶色谱柱、二醇基键合硅胶色谱柱、苯基键合硅胶色谱柱、离子交换色谱柱或者酰胺基键合硅胶色谱柱。
12.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈、异辛烷、正己烷、正葵烷、环己烷、二硫化碳、四氯化碳、苯、二甲苯、甲苯、氯苯、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、氯仿、苯胺、吡啶、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或其组合，优选地，所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈或其组合。
13.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述质谱为q-tof质谱。
14.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，还包括在进行样品鉴定前将燕窝样品制备为样品溶液的步骤，优选地，采用水性溶剂制备样品溶液，更优选地，所述水性溶剂为甲醇或水，尤其优选地，所述水性溶剂是甲醇：水体积比为0％～70％的水性溶剂。
15.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，还包括将燕窝样品进行柱前衍生化的步骤，优选地，采用具有生色团的衍生化试剂如2-aa、2
‑ꢀ
ab、pmp、2-ap、abp、abme、hoa、amac、3-(乙酰氨基)-6-氨基
‑ꢀ
吖啶(aa-ac)，ants、苯肼、丹磺酰肼等进行衍生化，更优选地，采用abee (氨基苯甲酸乙酯,4-aminobenzoic acid ethyl ester,benzocaine)进行衍生化的步骤。
16.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，其包括以下步骤：
17.(1)制备样品溶液；
18.(2)将步骤(1)中的样品溶液用abee进行衍生化；
19.(3)使用液相色谱-质谱联用法对衍生化样品进行分离与检测，得到样品的保留时间与质荷比；
20.(4)将样品的保留时间与质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。
21.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱-质谱联用法的图谱中，所述寡糖标志物为：保留时间为4.26min，质荷比为619.2403 的寡糖标志物；保留时间为5.38min，质荷比为822.3202的寡糖标志物；或者保留时间为6.49min，质荷比为660.2664的寡糖标志物。
22.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述燕窝样品为燕窝原材料或燕窝产品，其中，优选地，所述燕窝原材料包括燕盏、燕角、燕丝、燕饼、燕碎或燕条，更优选地，所述燕窝原材料包括白燕盏、黄燕盏、血燕盏或毛燕盏；所述燕窝产品包括即食燕窝、浓稠型燕窝或燕窝饮品。
23.在本发明的一个方面，本发明涉及一种鉴别燕窝的方法，包括：
24.a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
25.b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物；
26.其中，所述检测方法为液相色谱-质谱联用法，所述色谱条件为：使用 c18十八烷基键合硅胶液相色谱柱；所述液相色谱的流动相为：0.1％～0.5％甲酸水溶液和0.1％～0.5％甲酸乙腈溶液；
27.质谱为q-tof质谱；
28.所述寡糖标志物为下列的一种或多种：保留时间为4.26min，质荷比为 619.2403的寡糖标志物；保留时间为5.38min，质荷比为822.3202的寡糖标志物；或者保留时间为6.49min，质荷比为660.2664的寡糖标志物；
29.优选为保留时间为4.26min，质荷比为619.2403的寡糖标志物；
30.任选的，燕窝样品采用abee进行柱前衍生化。
31.在本发明的另一方面，本发明涉及一种制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法，其包括：
32.a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
33.b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物；
34.c.分离该一种或多种寡糖标志物；
35.d.分析分离的一种或多种寡糖标志物。
36.在本发明的又一方面，本发明涉及上述寡糖标志物在燕窝鉴别中的应用。
附图说明
37.图1.燕窝鉴定流程图。
38.图2.不同形态燕窝与市场常用替代品图。
39.图3.abee(氨基苯甲酸乙酯,4-aminobenzoic acid ethyl ester,benzocaine) 标记的燕窝与掺杂替代品糖的uplc-uv图谱(λ＝305nm)。色谱图，其为检测多批次样品来重叠图(燕窝n＝134；琼脂n＝8；鸡蛋白n＝5；鱼胶粉n ＝7；牛奶n＝6；猪皮n＝4；米粉n＝4；淀粉n＝3；鱼鳔n＝3；银耳n＝ 6)。
40.图4.选择特异性标志物的谱图，其中：
41.a：典型燕窝的abee标记糖uplc-uv谱图(λ＝305nm)，其中信号明显的色谱峰用1～9号标识；
42.b：燕窝和相关掺假物中9个峰的提取离子色谱图(eic)的比较谱图，其中，燕窝为ebn；掺假物包括：琼脂(a)，鸡蛋白(b)，鱼胶粉(c)，牛奶(d)，猪皮(e)，米粉(f)，淀粉(g)，鱼鳔(h)和银耳(i)。
43.图5.燕窝的3个特异性abee标记的标志物的负离子模式提取离子流对比色谱图与相应质谱图，其中：
44.a：abee-bnm001:m/z＝619.2409
±
0.050,rt＝4.26min；
45.b：abee-bnm002:m/z＝822.3216
±
0.050,rt＝5.38min；
46.c：abee-bnm003:m/z＝660.2590
±
0.050,rt＝6.49min；
47.d：abee-bnm001,abee-bnm002和abee-bnm003的质谱图。
48.图6.燕窝的代表性标志物bnm001的负离子模式多反应监测对比色谱图。
49.图7a-图7e为abee-bnm001的化学结构鉴定，其中：
50.图7a.abee-bnm001化学结构式；
51.图7b.1hnmr，
13
c-nmr和dept135谱；
52.图7c.hsqc谱；
53.图7d.1h-1
h cosy谱；和
54.图7e.hmbc谱。
55.图8.样品制备与abee衍生化条件优化结果柱状图。
56.图9.特异性abee标记的标志物bnm001在不同形态燕窝中的峰面积对比图。
57.图10a-图10b为燕窝产品鉴定结果，其中：
58.图10a为特异性标志物abee标记的标志物bnm001在不同产品类型中检测出与未检出的批次数量对比图；
59.图10b为特异性标志物abee标记的标志物bnm001在不同产品类型中的峰面积对比图，
60.数据表示为平均值
±
sd。与另一组相比，*p《0.05，**p《0.01，***p 《0.001和****p《0.0001有显著差异。
具体实施方式
61.定义
62.除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
63.如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“该(所述)”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
64.如无特殊说明，本说明书中的百分比(％)均为重量百分比(重量％)。
65.在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。术语“约”当指数量或数值范围时，意思是所指数量或者数值范围是试验变异性内(或统计学实验误差内)的近似值，因此该数量或者数值范围可以在所述数量或数值范围的例如 5之间变化。
66.涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的，因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是，本技术引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
67.当本发明针对物理性质例如分子量或者针对化学性质以范围定义时，应包括范围的所有组合和亚组合以及其内的具体实施方式。术语“包含”(以及相关术语例如“含有”或“含”或“具有”或“包括”)包括这样一些实施方式，该实施方式为例如，物质、组合物、方法或过程等的任何组合，其“由所描述的特征组成”或者“基本上由所描述的特征组成”。
68.本说明书和权利要求中使用的“和/或”，应当理解为相关联的组分“二者择一或二者”，即组分在一些情况中联合存在而在另一些情况中分开存在。多个用“和/或”列出的组分应当以同样的方式理解，即“一种或多种”相关联的组分。除了“和/或”从句具体确定的组分，其它组分可任选地存在，无论与那些具体确定的组分相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，提及“a和/或 b”，当用于连接开放式结尾的文字如“包括”，在一个实施方案中，可仅指a(任选地包括除b外的组分)；在另一实施方案，可仅指b(任选地包括除a外的组分)；
在再一实施方案中，指a和b(任选的包括其它组分)等。
69.应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文要求保护的包括多于一步或一个行为的任何方法中，该方法的步骤和行为的顺序不必限制于所叙及的方法的步骤和行为的顺序。
70.本发明使用的缩写具有在化学、生物学和药学领域的通常含义。
71.术语“色谱法”包括用于分离化学物质的方法，并且通常涉及以下过程：通过移动液体或气体流(“流动相”)携带分析物的混合物并当它们流过或在固定液或固相(“固定相”)上流动时由于分析物在流动相和所述固定相之间的差异分配而分成不同组分。所述固定相通常可以是细碎的固体、过滤材料片层或位于固体表面上的液体薄膜等。
72.色谱可以是柱色谱(即其中固定相沉积或装填成柱)，例如液相色谱、高效液相色谱(hplc)或超高效液相色谱(uhplc)。色谱法的详细资料在本领域中是熟知的(bidlingmeyer,practical hplc methodology and applications,johnwiley&sonsinc.,1993)。色谱的示例性类型无限制地包括高效液体色谱 (hplc)、uhplc、正相hplc(nphplc)、反相hplc(rp-hplc)、离子交换色谱(iec)，如阳离子或阴离子交换色谱法、亲水相互作用色谱(hilic)、疏水性相互作用色谱(hic)、尺寸排阻层析(sec)，包括凝胶过滤色谱或凝胶渗透色谱、色谱焦聚、亲和色谱法，如免疫亲和、固定化金属亲和色谱等。可以将色谱(包括一维、二维或多维色谱)与其他分析方法(例如质谱分析)一起使用。
73.术语“质谱法”(ms)是指用于鉴定和/或定量样品中分子的技术。ms包括将样品中的分子电离，形成带电分子；根据质荷比分离带电分子；并检测带电分子。ms可以对样品中的分子进行定性和定量检测。分子可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法离子化和检测。质谱的一些示例是“串联质谱”或“ms/ms”，这是其中发生多轮质谱的技术，所述多轮质谱同时使用一个以上的质量分析器，或者依次使用单个质量分析器。
74.术语“质谱仪”是指能够使分析物挥发/电离以形成气相离子并确定它们的绝对或相对分子量的装置。适合的挥发/电离方法是基质辅助激光解吸电离 (maldi)、电喷雾、激光/光、热、电、雾化/喷雾等，或它们的组合。适合的质谱形式包括(但不限于)离子阱仪器、四极仪器、静电和磁性扇形场仪器、飞行时间仪器、飞行时间串联质谱仪(tof ms/ms)、傅里叶变换质谱仪、 orbitraps以及由这些类型的质谱分析仪的不同组合组成的混合仪器。反过来，这些仪器可以与多种其他仪器连接，所述其他仪器分离样品(例如，液相色谱或基于化学或生物性质的固相吸附技术)并且使样品电离以引入到质谱仪中，其包括基质辅助激光解吸(maldi)、电喷雾或纳喷雾电离(esi)或它们的组合。
75.术语“衍生化”(derivitization)是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质的方法。样品的衍生化的作用主要是把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。当需要检测物质不容易被检测时，如无紫外吸收等，可以将其进行处理，如加上生色团等，生成可被检测的物质。衍生化方法在仪器分析中被广泛应用。一般化学衍生法主要有以下几个目的：提高样品检测的灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外或核磁共振等。
76.应当理解本文采用的术语用于描述具体实施方案的目的，而不意在进行限制。此外，在本发明的实践或试验中可以使用与本文描述的那些类似或等价的任何方法、装置和材料，下文描述了优选的方法、装置和材料。
77.在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种基于燕窝样品中的寡糖标志物的燕窝鉴别方法，包括鉴定燕窝样品中分子量为471.4299的寡糖标志物bnm001、分子量为674.3202的寡糖标志物bnm002或分子量为512.2664 的寡糖标志物bnm003中的一种或多种。
78.在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种鉴别燕窝的方法，包括：
79.a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
80.b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物。
81.在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法，其包括：
82.a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
83.b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物；
84.c.分离该一种或多种寡糖标志物；
85.d.分析分离的一种或多种寡糖标志物。
86.任何检测方法均可用于上述鉴别燕窝样品中的一种或者多种寡糖标志物的方法或制备方法。
87.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法中，在一些实施方案中，至少一种检测方法选自显微镜、宏观检查、光谱法、光谱法、质谱法、色谱法及其组合。优选的，所述检测方法选自色谱分析法、光谱分析法、质谱分析法、色谱联用分析法、色谱-光谱联用分析法、色谱-质谱联用分析法、毛细管电泳分析法、免疫分析法、核酸适配子结合分析法及其组合。示例性鉴别方法包括但不限于：质谱法、高性能薄层色谱法、傅里叶变换红外光谱法、紫外可见光谱法、薄层色谱法、气液色谱法(gc)、高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱(lc-ms)、气相色谱-质谱(gc-ms)、核磁共振(nmr)、抗体检测方法、拉曼光谱、毛细管电泳、液相色谱、凝胶渗透色谱、离子色谱、及其组合。
88.更优选地，所述检测方法为液相色谱-质谱联用法，特别优选lc-dad
‑ꢀ
q-tof-ms法。
89.在一些实施方案中，lc-ms法包括超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱(uplc-esi-qtof-ms)、超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(uplc-esi-ms/ms)、反相液相色谱-质谱(rplc-ms)、亲水作用液相色谱-质谱(hilic-ms)、液相色谱-三重四极杆串联质谱(lc-qqq-ms/ms)、亲水作用液相色谱-三重四极杆串联质谱(hilic-qqq-ms/ms)、静电排斥
‑ꢀ
亲水相互作用液相色谱-质谱(erlic-ms)、液相色谱-四极杆飞行时间质谱(lc-qtof-ms)、液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)、多维液相色谱与串联质谱联用(lc/lc-ms/ms)。在一些优选实施方案中，液相色谱-质谱联用法是液相色谱飞行时间质谱(lc-qtof-ms)或液相色谱-三重四极杆串联质谱 (lc-qqq-ms/ms)。在一些更优选实施方案中，液相色谱-质谱联用法是液相色谱-极管阵列检测器(dad)-飞行时间质谱(lc-dad-qtof-ms)。在一些实施方案中，本说明书中的lc-ms方法通过本领域众所周知的标准技术进行。
90.在本发明的一个实施方案中，在上述鉴别燕窝的方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法中，所述液相色谱的色谱条件为：所述液相色谱的色谱柱选自硅胶基质色谱柱、聚合物基质色谱柱、或者其他无机填料色谱柱，优选地，使用c18十八烷基键合硅胶液相色谱柱、c8辛烷键合硅胶液相色谱柱、nh2氨基键合硅胶色谱柱、二醇基键合硅胶色谱柱、苯
基键合硅胶色谱柱、酰胺基(amide)键合硅胶色谱柱、离子交换色谱柱。
91.示例性色谱柱包括但不限于：
92.c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱250
×
4.6mm,5μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱200
×
4.6mm,5μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱150
×
4.6mm,5μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱250
ꢀ×
10mm,5μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱250
×
22mm,5μm； c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱250
×
4.6mm,10μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱200
×
4.6mm,10μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱150
×
4.6mm,10μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱250
×
10mm, 10μm；c18十八烷基键合球形硅胶液相色谱柱250
×
22mm,10μm；c8辛烷键合球形硅胶；nh2氨基键合球形硅胶；二醇基键合球形硅胶；苯基键合球形硅胶；球形硅胶kromasil tm填装柱/填料装填液相色谱柱；离子交换色谱柱(强阳离子交换柱，强阴离子交换柱scx强阳离子交换硅胶100
×
4.6mm, 5μm；sax强阴离子交换硅胶150
×
4.6mm,5μm；手性柱(配体交换、环糊精、多糖类手性柱)；lec涂覆型配体交换手性柱50
×
4.6mm,5μm；le键合型配体交换手性柱；cad淀粉三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂覆硅胶柱； cod纤维素三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)涂覆硅胶柱；cob纤维素三苯甲酸酯涂覆硅胶柱；cdβ-环糊精键合硅胶柱；melamine三聚氰胺专用柱；“ps大孔聚苯乙烯微球250
×
4.6mm 8μm”；“uf大孔脲醛树脂微球250
×
4.6mm 8μm”；球形硅胶液相色谱填料(球形5μm)；c18十八烷基键合球形硅胶4
‑ꢀ
5μm；c8辛烷键合球形硅胶4-5μm；nh2氨基键合球形硅胶4-5μm；diol二醇基键合球形硅胶4-5μm；phenyl苯基键合球形硅胶4-5μm；sil球形硅胶4
‑ꢀ
5μm；sh巯基键合球形硅胶4-5μm；cho醛基键合球形硅胶4-5μm；prepline 制备色谱填料(球形10μm、无定形)；s sil全多孔球形硅胶10μm；c18十八烷基键合球形硅胶10μm；c8辛烷键合球形硅胶10μm；nh2氨基键合球形硅胶10μm；diol二醇基键合球形硅胶10μm；phenyl苯基键合球形硅胶 10μm。苯基柱、氰基柱、氨基柱、酰胺基柱、二醇基柱、季氨基硅胶强阴离子交换柱、丙氨基硅胶弱阴离子交换柱、磺酸基硅胶强阳离子交换柱、羧酸基硅胶弱阳离子交换柱、硅胶柱、聚合物基质固相萃取柱交联聚苯乙烯基质强阴离子交换柱、wax交联聚苯乙烯基质弱阴离子交换柱、scx交联聚苯乙烯基质强阳离子交换柱、wcx交联聚苯乙烯基质弱阳离子交换柱、mcx 交联聚苯乙烯基质混合型阳离子交换柱、max交联聚苯乙烯基质混合型阴离子交换柱、ps非极性交联聚苯乙烯柱、hlb极性嵌入交联聚苯乙烯柱、非硅胶基质固相萃取柱、ms硅酸镁柱、al氧化铝柱、gpc石墨化碳柱、专用固相萃取柱、pd钯离子吸附柱、ida亚氨基二乙酸柱、pba苯基硼酸柱、ida-ni组氨酸标记蛋白柱、ida-fe磷酸化蛋白柱、prs孔雀石绿柱、 psa丙基乙烯二氨、mel三聚氰胺柱。
93.优选的，硅胶基质固相萃取柱，例如c18碳十八柱；c8碳八柱；c4碳四柱；酰胺基柱。
94.更优选的，acquity uplc beh c18色谱柱或者waters uplc xbridgebeh amide色谱柱。
95.任何常用的流动相均可用于本发明的色谱分析法中，在一些实施方案中，液相色谱的流动相选自：水、甲酸、乙酸、乙腈、异辛烷、正己烷、正葵烷、环己烷、二硫化碳、四氯化碳、苯、二甲苯、甲苯、氯苯、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、氯仿、苯胺、吡啶、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇及其组合。优选地，所述液相色谱的流动相选自水、甲酸、乙酸、乙腈或其组合。
96.在一些实施方案中，液相色谱的流动相(洗脱液)为甲酸水溶液和甲酸乙腈水溶
液。在一些具体实施方案中，洗脱液为0.1％～0.5％甲酸水溶液a和 0.1％～0.5％甲酸乙腈溶液b。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.1％～0.4％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.1％～0.3％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.1％～0.2％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.1％～0.2％甲酸水溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b为0.1％～0.4％甲酸乙腈溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b 为0.1％～0.3％甲酸乙腈溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b为 0.1％～0.2％甲酸乙腈溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.5％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.4％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.3％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.2％甲酸水溶液。在一些具体实施方案中，洗脱液a为0.1％甲酸水溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b为0.5％甲酸乙腈溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b为0.4％甲酸乙腈溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b为0.3％甲酸乙腈溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液 b为0.2％甲酸乙腈溶液。在另一些具体实施方案中，洗脱液b为0.1％甲酸乙腈溶液。
97.在一些实施方案中，洗脱液流速范围为0.3
±
0.05ml/min。在一些具体实施方案中，洗脱液流速范围为0.3
±
0.04ml/min。在一些具体实施方案中，洗脱液流速范围为0.3
±
0.03ml/min。在一些具体实施方案中，洗脱液流速范围为0.3
±
0.02ml/min。在一些具体实施方案中，洗脱液流速范围为 0.3
±
0.01ml/min。在一些优选实施方案中，洗脱液流速为0.3ml/min。
98.在一些实施方案中，液相色谱的色谱柱柱温为30℃～50℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为30℃～45℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为30℃～40℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为30℃～35℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为50℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为45℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为40℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为35℃。在一些具体实施方案中，色谱柱柱温为30℃。
99.在一些实施方案中，极管阵列检测器(dad)的检测波长为190nm～760 nm，优选305nm。
100.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法中，所述质谱为q-tof质谱。
101.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法中，还包括在进行样品鉴定前将燕窝样品制备为样品溶液的步骤，优选地，采用水性溶剂制备样品溶液，更优选地，所述水性溶剂为甲醇或水，尤其优选地，所述水性溶剂是甲醇：水体积比为0％～70％的水性溶剂。
102.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，其包括以下步骤：
103.(1)制备样品溶液，其中所述样品溶液不经衍生化直接用于后续步骤；
104.(2)使用液相色谱-质谱联用法对样品进行分离与检测，得到样品的保留时间与质荷比；
105.(3)将样品的保留时间与质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。
106.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法中，还包括将燕窝样品进行柱前衍生化的步骤，优选地，采用具有生色团的衍生化试剂如2-aa、2-ab、pmp、2-ap、abp、abme、 hoa、amac、3-(乙酰氨基)-6-氨基-吖啶(aa-ac)、
ants、苯肼、丹磺酰肼等进行衍生化，更优选地，采用abee进行衍生化的步骤。
107.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，其包括以下步骤：
108.(1)制备样品溶液；
109.(2)将步骤(1)中的样品溶液用abee进行衍生化；
110.(3)使用液相色谱-质谱联用法对衍生化样品进行分离与检测，得到样品的保留时间与质荷比；
111.(4)将样品的保留时间与质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。
112.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法中，所述液相色谱-质谱联用法的图谱中，所述abee衍生化的寡糖标志物为下列的一种或多种：保留时间为4.26min，质荷比为619.2403的abee衍生化的寡糖标志物；保留时间为5.38min，质荷比为822.3202的abee衍生化的寡糖标志物；或者保留时间为6.49min，质荷比为660.2664的abee衍生化的寡糖标志物。
113.在本发明的一个方面，本发明涉及一种鉴别燕窝的方法，包括：
114.a.对燕窝样品中的碳水化合物进行检测；
115.b.鉴定燕窝样品中碳水化合物的一种或者多种寡糖标志物。
116.其中，在上述鉴别燕窝的方法中，所述一种或者多种寡糖标志物为 471.4299的寡糖标志物bnm001、分子量为674.3202的寡糖标志物bnm002 和/或分子量为512.2664的寡糖标志物bnm003。
117.在本发明的一个方面，在上述鉴别燕窝的方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法中，所述燕窝样品为燕窝原材料或燕窝产品，其中，优选地，所述燕窝原材料包括燕盏、燕角、燕丝、燕饼、燕碎或燕条，更优选地，所述燕窝原材料包括白燕盏，黄燕盏，血燕盏，毛燕盏；所述燕窝产品包括即食燕窝、浓稠型燕窝或燕窝饮品。
118.在一些实施方案中，所述燕窝鉴定方法或制备用于鉴别燕窝的寡糖标志物的方法包括在进行样品鉴定前提取标志物，所述标志物的提取包括在进行样品鉴定前用水性溶剂将燕窝样品制备为样品溶液，离心，取上清液备用。
119.在一些实施方案中，如果待检测的燕窝样品为燕窝原材料，样品溶液的制备包括向干燥的燕窝样品粉末中加入水性溶剂，涡旋混匀，然后超声。在一些具体实施方案中，超声条件为在室温超声1-15分钟。在一些更具体实施方案中，超声时间为1-10分钟。在一些更具体实施方案中，超声时间为1-5 分钟。在一些更具体实施方案中，超声时间为5-15分钟。在一些更具体实施方案中，超声时间为5-10分钟。在一些更具体实施方案中，超声时间选自： 1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、 10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟或15分钟。在一些更具体实施方案中，超声时间为5分钟。在另一些实施方案中，如果待检测的燕窝样品为燕窝产品，样品溶液的制备包括直接取燕窝产品中的溶液或将燕窝产品直接溶解于水性溶剂中。
120.在一些实施方案中，所述水性溶剂为醇的水溶液。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇水溶液。在一些实施方案中，水性溶剂为乙醇水溶液。在一些实施方案中，水性溶剂为丙醇水溶液。在一些实施方案中，水性溶剂为丁醇水溶液。在一些实施方案中，水性溶剂为戊醇水溶液。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为0％～70％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为0％～60％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为
甲醇：水体积比为0％～50％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为0％～40％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为0％～30％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为 0％～20％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为0％～10％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为70％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为60％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为50％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为40％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为30％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为 20％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为甲醇：水体积比为10％的溶剂。在一些实施方案中，水性溶剂为水。
121.在一些实施方案中，所述燕窝鉴定方法包括在进行样品鉴定前将燕窝样品衍生化，所述衍生化方法选自：使用具有生色团的衍生化试剂abee、2
‑ꢀ
aa、2-ab、pmp、2-ap、abp、abme、hoa、amac、3-(乙酰氨基)
‑ꢀ
6-氨基-吖啶(aa-ac)，ants、苯肼或丹磺酰肼进行衍生化或甲基化、乙酰化或还原法等。在一些具体实施方案中，衍生化方法为使用具有生色团的衍生化试剂abee、2-aa、2-ab、pmp或2-ap对样品进行衍生化。在一些具体实施方案中，衍生化方法为使用具有生色团的衍生化试剂abee对样品进行衍生化。
122.在一些实施方案中，衍生化反应温度为60℃-90℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为60℃-85℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为60℃
‑ꢀ
80℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为65℃-90℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为65℃-85℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为 65℃-80℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为70℃-90℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为70℃-85℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为70℃-80℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为75℃-90℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为75℃-85℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为75℃-80℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为60℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为65℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为70℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为75℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为80℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为85℃。在一些实施方案中，衍生化反应温度为90℃。
123.在一些实施方案中，衍生化反应时间为1-30分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为1-25分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为1-20 分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为1-15分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为1-10分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5
‑ꢀ
30分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5-25分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5-20分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5-15分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5-10分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为30分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为 25分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为20分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为15分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5
‑ꢀ
10分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为5分钟。在一些实施方案中，衍生化反应时间为1分钟。
124.在一些实施方案中，本发明的燕窝鉴定方法包括以下步骤：
125.(1)制备样品溶液，其中所述样品溶液不经衍生化直接用于后续步骤；
126.(2)使用液相色谱-质谱联用法对样品进行分离与检测，得到样品的保留时间和/
或质荷比；
127.(3)将样品的保留时间和/或质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。
128.在一些实施方案中，本发明涉及一种基于寡糖标志物燕窝样品鉴别方法，其包括以下步骤：
129.(1).样品制备
130.将样品粉末，加入50％甲醇水溶液处理并超声处理后，取出上清液不经衍生化步骤直接用于进一步分析；
131.(2).lc-qqq-ms/ms分析
132.液相色谱条件：使用色谱柱waters uplc xbridge beh amide(2.1 mm
×
100mm，3.5μm，waters，milford，usa)，并用0.1-0.5％，优选0.1％甲酸水溶液a和0.1-0.5％，优选0.1％的甲酸乙腈溶液b线性梯度洗脱；
133.优选地，洗脱液流速为0.4ml/min，柱温为30℃；
134.优选地，溶剂梯度如下：0
–
4分钟，78-50％b；4
–
5分钟，50
–
100％b； 5.1分钟，100-78％b；5.1
–
7分钟，78％b。进样体积为6μl；
135.优选地，质谱条件为：负离子模式，多反应监测(mrm)下的最佳运行；
136.更优选地，质谱参数如下：定性离子对为470.1/87.0，雾化气体(n2) 流量7.0l/min，雾化气体温度300℃；鞘气流速8.0l/min；鞘气温度350℃；碰撞电压为10v；碎片电压为220v；
137.进行上述分析后获得燕窝样品的图谱信息；
138.(3).燕窝样品中标志物的确认
139.将步骤2中获得的燕窝样品的图谱信息中各物质的保留时间与标志物 bnm001的保留时间2.143min进行对比。
140.在一些实施方案中，本发明的燕窝鉴定方法包括以下步骤：
141.(1)制备样品溶液；
142.(2)将步骤(1)中的样品溶液用abee进行衍生化；
143.(3)使用液相色谱-质谱联用法对衍生化样品进行分离与检测，得到样品的保留时间与质荷比；
144.(4)将样品的保留时间与质荷比与标志物对比，进行样品的鉴定。
145.在本发明的一些实施方案中，本发明提供一种或多种可用于燕窝样品鉴定的寡糖标志物。在一些具体实施方案中，寡糖标志物为分子量为471.4299 的寡糖标志物bnm001、分子量为674.3202的寡糖标志物bnm002或分子量为512.2664的寡糖标志物bnm003中的一种或多种。
146.在一些实施方案中，本发明涉及一种基于寡糖标志物燕窝样品鉴别方法，其包括以下步骤：
147.(1).样品制备
148.将样品粉末，加入蒸馏水处理并超声处理后，取出上清液用于进一步分析；
149.(2).样品衍生化
150.取上述的上清溶液或燕窝产品溶液，加入abee、冰醋酸和nabh3cn 混合均匀反应；冷却后，向溶液中加入水和乙醚，将混合物充分混合并离心；除去上层abee溶液，干燥下层
horn)、8种燕条(large strip)、8种燕丝(small strip)、6种燕饼(pieces)和15种燕碎(the broken)购于中国香港市场，依据行业标准snt3644-2013进行唾液酸的检测，结果均含有唾液酸。
168.83种燕窝产品(pd01～pd83)，依据产品说明书进行分类，包括44种即食燕窝，18种浓稠型燕窝和21种燕窝饮品，分别购自泰国、越南、中国内地和中国香港市场。
169.常见替代品包括琼脂(a1～a8)、鸡蛋白(ew1～ew8)、鱼胶粉 (ge1～ge7)、牛奶(m1～m6)、猪皮(p1～p4)、米粉(rf1～rf4)、淀粉 (st1～st3)、鱼鳔(sb1～sb3)和银耳(sf1～sf6)(见图2b)。
170.乙腈(质谱)、甲酸(质谱纯)，甲醇(分析纯)，冰醋酸(分析纯)和乙醚(分析纯)均购于thermo fisher。氰基硼化钠(sodium cyanoborohydride， nabh3cn)，对氨基苯甲酸乙酯(4-aminobenzoic acid ethyl ester,benzocaine, abee)，唾液酸(sialic acid)购于sigma。
171.仪器：agilent 1290uhplc系统，配备有二元泵、恒温柱室、自动进样器、脱气器和二极管阵列检测器(dad，λ＝305nm)；四极杆飞行时间(q
‑ꢀ
tof)质谱仪、三重四极杆串联质谱和jetstream电喷雾离子(esi)源的agilent 6540q-tof质谱仪。该系统由mass hunter b.06软件控制。
172.实施例1特异性标志物的筛选与检测
173.依据图1所示的检测流程，将燕窝原材料与各替代品样品平行超声处理，衍生化后进行lc-dad-qtof-ms负离子模式全扫描分析。得到色谱图如图 3所示。具体实验步骤如下：
174.1.样品制备
175.称取25mg干燥的样品粉末，加入0.5ml蒸馏水处理，涡旋混匀，室温超声处理5分钟。将超声处理完的样品以15,000rpm离心5分钟。取出上清液用于进一步分析。
176.2.样品衍生化
177.取100μl上述的上清溶液或产品溶液于2ml离心管中，加入400μl0.6mol/l abee，80μl冰醋酸和80μl1.4 mol/l nabh3cn混合均匀，在80℃反应5分钟。冷却后，向溶液中加入水和乙醚，将混合物充分混合并以 15,000rpm离心5分钟。除去上层(abee溶液)，干燥下层水相，复溶在 200μl 70％(v/v)甲醇水溶液中，并进行lc-dad-qtof-ms分析。
178.3.lc-dad-qtof-ms分析
179.液相色谱条件：使用色谱柱acquity uplc beh c18(2.1mm
×
100mm， 1.7μm，waters，milford，usa)，并用0.1％甲酸水溶液(a)和0.1％甲酸乙腈溶液(b)线性梯度洗脱，流速为0.3ml/min，柱温为30℃。溶剂梯度如下：0
–
7分钟，15％b；7
–
9分钟，15
–
100％b；9-9.1分钟，100-15％b；9.1
–ꢀ
12分钟，15％b。进样体积为2μl。
180.质谱条件：采用esi源，负离子全扫描模式下的最佳运行参数如下：雾化气体(n2)流量7.0l/min，雾化气体温度300℃；鞘气流速8.0l/min；鞘气温度350℃；雾化器40psi；毛细管电压3000v；锥孔电压65v；倍增电压750v；碎片电压为150v。质量扫描范围设置为100-2000的荷电质量 (m/z)。
181.由图3可知，采用该方法，各样品展现出丰富的糖类指纹信息，并且各种样品之间信息一致性良好。
182.为进一步寻找燕窝中特有的标志物，将燕窝的指纹信息与替代品进行详细对比。
在燕窝样品，结果如图4a所示，共发现9个明显共有峰，质荷比分别为619.2403(1号峰)、457.1882(2号峰)、822.3202(3号峰)、659.3143 (4号峰)、457.1882(5号峰)、660.2664(6号峰)、415.1768(7号峰)、 443.2092(8号峰)、415.1768(9号峰)。按照质荷比逐一提取代替品相应的离子色谱图与燕窝进行对比，考察各峰的特异性，结果如图4b和表1所示，其中2、4、5、7和9号峰为非特异性峰：2、5号同分异构峰在鱼胶粉、牛奶、猪皮中均存在；4号峰在鸡蛋白与银耳中存在；7、9号同分异构体峰在鸡蛋白、牛奶、猪皮、鱼鳔和银耳中均存在，故此5个峰不能作为燕窝的特异性标志物。而8号峰虽然具有良好特异性，然而其在部分燕窝样品中未检测出，故该峰为非共有峰。
183.其余三个峰，1号，3号和6号峰均呈现良好特异性与共有性，提取离子流色谱及质谱信号如图5所示。
184.另外此三个峰的检测具有良好的重复性，同一批次样品平行制备6份，进行测定，分别记录三个峰的峰面积，结果显示1号峰的相对标准偏差(rsd％)为4.13％，2号峰rsd％为5.04％，3号峰rsd％为5.67％，可作为潜在标志物。而其中1号峰响应信号最大，检测限可达0.03μg/ml，可满足不同燕窝产品的鉴定分析。
185.综上，1号，3号和6号峰代表的物质均可作为燕窝鉴定的标志物。优选地，特异性好、灵敏度高、重复性好的1号峰代表的物质，即保留时间为 4.26min，质荷比为619.2403的物质为abee标记后的代表性标志物。
186.表1.基于保留时间、质荷比、特异性和共有性的燕窝天然标志物的筛选结果
[0187][0188]a替代品是指琼脂、鸡蛋白、鱼胶粉、牛奶、猪皮、米粉、淀粉、鱼鳔、银耳；
[0189]b共有峰是指该峰在多批次(n≥100)燕窝原材料样品中均存在；
[0190]
c“ ”为阳性结果，即可检测出该峰或满足特异性、共有峰的条件，
“‑”
为阴性结果，即不可检测出该峰或不满足特异性、共有峰的条件。
[0191]
实施例2代表性标志物不经abee标记的检测
[0192]
将燕窝原材料与各替代品样品平行超声处理，吸取燕窝产品溶液进行 lc-qqq-ms/ms负离子模式mrm分析。得到色谱图如图6所示。具体实验步骤如下：
[0193]
1.样品制备
[0194]
称取50mg干燥的样品粉末，加入0.4ml 50％甲醇水溶液处理，涡旋混匀，室温超声处理5分钟。将超声处理完的样品以15,000rpm离心5分钟。取出上清液进样分析。另，吸取燕窝产品溶液100μl加入100μl甲醇，涡旋混匀，混匀后的样品以15,000rpm离心5分钟。取出上清液进样分析。
[0195]
2.lc-qqq-ms/ms分析
[0196]
液相色谱条件：使用色谱柱waters uplc xbridge beh amide(2.1 mm
×
100mm，3.5μm，waters，milford，usa)，并用0.1％甲酸水溶液(a) 和0.1％甲酸乙腈溶液(b)线性梯度洗脱，流速为0.4ml/min，柱温为30℃。溶剂梯度如下：0
–
4分钟，78-50％b；4
–
5分钟，50
–
100％b；5.1分钟，100
‑ꢀ
78％b；5.1
–
7分钟，78％b。进样体积为6μl。
[0197]
质谱条件：采用esi源，负离子模式，多反应监测(mrm)下的最佳运行参数如下：bnm001定性离子对为470.1/87.0，雾化气体(n2)流量7.0l /min，雾化气体温度300℃；鞘气流速8.0l/min；鞘气温度350℃；碰撞电压为10v；碎片电压为220v。
[0198]
由图6可知，采用该方法，可在燕窝原材料与产品中检测出代表性标志物bnm001，而在常见替代品中未检出，说明未经abee标记亦可完成鉴定，本发明涉及标志物具有较强特异性。
[0199]
实施例3代表性标志物的分离与结构鉴定
[0200]
由上述结果可知，bnm001是ebn中含量最高的标志物，通过半制备液相色谱仪与高效液相色谱仪分离出abee-bnm001，并通过一维(1d-nmr) 与二维核磁(2d-nmr)和高分辨质谱(ms)表征其确切的化学结构。将 abee-bnm001溶解在d2o中，并将tms用作内标。1h和
13
c-nmr谱分别在400mhz和100mhz下测试。
[0201]
高分辨率质谱数据(图7b)显示负离子esi：m/z 619.2409,推测abee
‑ꢀ
bnm001是abee标记的唾液酸化二糖，bnm001为唾液酸化二糖。通过 nmr分析(图7b-7e)获得更多的结构信息。结构式见图7a。
[0202]
实施例4样品制备与衍生化方法优化
[0203]
为建立快速鉴定的方法，本发明对样品制备过程，以及处理过程进行了优化。
[0204]
针对样品制备，即标志物提取过程，根据实施例1中的标志物提取步骤，考察不同溶剂(0.5ml蒸馏水、50％甲醇(v:v)水溶液、70％甲醇(v:v)水溶液)，不同超声处理时间(1、5、10分钟)，以取得最优条件。如图8所示，随着有机溶剂比例增加，标志物信号逐渐降低，说明标志物在水溶液中溶解度最优、50％甲醇(v:v)溶液次优。同时超声处理至1min、5min、10min，标志物峰面积在5min后无显著性增加，超声5min最优、10min次优。
[0205]
针对生色团试剂衍生化过程，根据实施例1中的样品衍生化步骤，考察不同反应温度(60℃、70℃、80℃、90℃)及反应时间(1、5、10、30分钟)。结果如图8所示，随着反应温度的增加，标志物峰面积呈现增加趋势，在90℃时有所降低，因而80℃为反应的最优温度，70℃次之。同时，我们发现反应 5min、10min，标志物峰面积无明显差异，故选择最短时间5分钟为最佳反应时间，10min次之。在条件优化过程中，发现温度过高或/且反应时间过长可能会破坏衍生物的稳定性。
[0206]
综上，采用水溶液提取，超声处理5min，在80℃下衍生化5min为最优条件。
[0207]
实施例5在不同形态燕窝中的均含有标志物bnm001
[0208]
将收集到的134种不同形态燕窝原材料，平行处理，进行lc-dad-qtof
‑ꢀ
ms测试，记录特异性标志物峰面积，在完成称样量校正后，根据不同形态燕窝分类进行统计。结果如图9所示，虽然各种燕窝之间存在一定差异，但均含有标志物bnm001，其与依据行业标准snt 3644-2013进行唾液酸的检测一致。
[0209]
实施例6寡糖标志物bnm001在燕窝相关产品鉴定中的应用
[0210]
将从不同市场收集的83种不同类型的燕窝产品，平行处理，进行lc
‑ꢀ
dad-qtof-ms测试，提取特异性标志物的离子流色谱图，对比保留时间与质谱信息。
[0211]
测定结果如图10a和图10b所示。83种产品中，分别有14种即食燕窝与5种燕窝饮品未检出寡糖标志物bnm001。检视原产品，未检出寡糖标志物bnm001的产品中均无明显燕窝泡发状物质，有部分产品样品呈现啫喱状浑浊样，疑似琼脂或其他不明胶状物质。为进一步确认该检测结果，将产品冻干后，取100mg进行相同处理方法，进行复检，依然未检测出标志物，确认此19种样品为伪品。
[0212]
同时，采用行业出口标准(gacs-000-1017-19(0))，对产品中的唾液酸进行检测。对比检测结果如表3所示。结果显示，上述19种伪品中有18种样品中均未检测到唾液酸，一种样品(pd-40)中的唾液酸含量高于检测限，可能与人工添加唾液酸有关。其余64种样品，标志物bnm001(采用abee
ꢀ‑
bnm001表示)含量总体趋势为浓稠燕窝＞即食燕窝＞燕窝饮品。其中即食燕窝不同厂家之间差异较大，这正说明了燕窝产品市场无统一的质量等级标准，因此不同厂家对产品的划分不同，即标识为即食燕窝的可能为浓稠型燕窝，也可为燕窝饮品。
[0213]
表3.83批燕窝产品中特有标志物bnm001与唾液酸(sialic acid)的检测结果
[0214]
[0215][0216]
备注:a依据本发明中的标志物bnm001进行测定；b依据燕窝行业出口标准(gacs-000-1017
‑ꢀ
19(0))，对唾液酸进行测定；c
“‑”
为燕窝中bnm001峰面积小于检测限(0.03μg/ml)或唾液酸峰面积小于检测限(7.50μg/ml)。