一种基于超分子自组装的细胞粘附材料及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于超分子自组装的细胞粘附材料及其制备方法。


背景技术：

2.在众多多细胞生物体内，细胞粘附行为是一种普遍存在的生命现象。细胞粘附直接影响着细胞的运动行为和生理功能，包括细胞增殖和分化，肿瘤细胞生长和迁移，干细胞分化，组织再生以及血栓的形成。细胞粘附根据粘附现象分为细胞间粘附以及细胞与细胞外基质粘附，其中，细胞与细胞外基质的粘附在组织工程学中有着重要的应用。用作细胞粘附的材料必须具备以下性质：一是良好的生物相容性；二是无毒；三是优良的表面活性。细胞粘附与机体内的生理活动息息相关，例如体内平衡的调节、细胞的吞噬外排作用、细胞信号传导和通讯，因此关于细胞粘附的研究也是渗透到了多个研究学科，如化学、医学和生物。关于细胞粘附现已经在疾病诊断，组织工程学癌细胞耐药性以及传感器等方面有着广泛应用。因此提供一种良好的细胞粘附材料具有重要的生物学研究意义。
3.申请号为201710327542.3的专利提供了一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法，该方法是将壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇等医用高分子材料与多肽、蛋白、羟基磷灰石等促进成骨细胞粘附和增殖的活物复合，制得具有三维结构的薄膜实现体相混合改性，之后在其表面自组装形成聚多巴胺层，之后采用胶原、生长因子或明胶等具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物对其进行表面改性，制得。上述细胞粘附材料虽然能在一定程度上提高成骨细胞的粘附和三维生长，但是其机械性能较差，而且不能很好的避免细菌在材料表面的粘附。申请号为202010958838.7的专利提供了一种具有物理杀菌和促进细胞粘附的仿生材料及制作方法，该方法以硅片为基板的材料，在基板表面刻蚀有呈正方形排列的圆柱状结构，具有纳米针状结构的纳米氧化锌、二氧化钛涂覆层涂覆于圆柱状结构表面。上述发明利用纳米结构物理杀菌的原理来杀死材料表面粘附的细菌，不会带来任何产生细菌耐药性的风险，且制备氧化锌纳米柱超高的长径比，使其具有高达99％以上的杀菌率；利用多级微纳米结构共存的表面，不仅可有效杀死细菌，同时微米尺度阵列的存在，能很大程度增加正常细胞在材料表面的粘附面积，并可有效促进正常细胞的增殖分化，与平面相比，其细胞增殖数量得到大幅度提升。上述发明提供的材料虽然具有良好的抗菌作用，但是其表面细胞亲和性较差。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题之一是：针对现有技术存在的不足，提供一种基于超分子自组装的细胞粘附材料，该细胞粘附材料不仅具有良好的细胞亲和性，且机械性能好，具有一定的抗菌粘附性。
5.本发明所要解决的技术问题之二是，提供一种基于超分子自组装的细胞粘附材料的制备方法，该方法操作简单，制备成本低。
6.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
7.一种基于超分子自组装的细胞粘附材料的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)在干净的硅基底上沉积聚苯乙烯纳米球薄膜；
9.(2)将沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅片置于含钛凝胶中浸涂处理，取出后进行干燥如此反复2-3次，最后置于马弗炉内进行煅烧处理，之后依次进行超声处理、紫外线处理，制得沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底；
10.(3)将上述制得的沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底置于含有多巴胺的tris-hcl缓冲溶液中，常温下超声处理，之后取出干燥，制得细胞粘附材料。
11.作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述聚苯乙烯纳米球单层膜的制备方法为：以苯乙烯作为单体，以过硫酸铵作为引发剂，以聚乙烯吡咯烷酮为分散剂，以去离子水为溶剂，氮气气氛下升温反应，反应结束后冷却至室温，将过滤得到的固体进行冷冻干燥重新分散至去离子水中制得单分散聚苯乙烯纳米微球乳液；将干净的硅基底置于单分散聚苯乙烯纳米微球乳液中浸提处理，干燥，制得沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅基底。
12.作为上述技术方案的优选，所述苯乙烯、过硫酸铵、聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：(0.01-0.03)：0.25。
13.作为上述技术方案的优选，所述升温反应的温度为70-80℃，反应时间为8-10h。所述浸提处理时，硅基底的提拉速率为4cm/min，控制静置浸渍的时间为2-3min。
14.作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述含钛凝胶的制备方法为：将钛酸四丁酯和乙醇混合均匀后加入冰醋酸混合搅拌处理，然后加入乙醇的水溶液，搅拌反应制得含钛凝胶。
15.作为上述技术方案的优选，所述乙醇的水溶液是由乙醇和去离子水以体积比为5:(3-4)的比例混合而成；钛酸四丁酯、乙醇、冰醋酸、乙醇的水溶液的体积比为9：(35-40)：5:10。
16.作为上述技术方案的优选，所述搅拌处理的时间为30min，所述搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为1-2h。
17.作为上述技术方案的优选，浸涂处理时，硅基底的提拉速度为20mm/min，并控制静置浸涂的时间为2-5min；所述超声处理是将样品置于去离子水中室温下，在500w下超声处理20-40min；所述煅烧处理是在430-450℃下煅烧2-3h。
18.作为上述技术方案的优选，所述紫外线处理是将样品置于光刻机中采用紫外线照射处理；所述紫外线的强度为10mw/cm2，照射时间为30-40min。
19.作为上述技术方案的优选，所述含有多巴胺的tris-hcl缓冲溶液的ph为8.5，多巴胺的浓度为0.001-0.002g/ml。所述超声处理的功率为200-300w，时间为1-2h。
20.由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
21.本发明提供的细胞粘附材料包括硅基底，依次沉积在硅基底上的蜂窝状纳米氧化钛、聚多巴胺层，本发明提供的细胞粘附材料不仅具有很好的细胞亲和性，且具有一定的抗细菌粘附性。在制备时，本发明首先在硅基底上沉积聚苯乙烯纳米微球薄膜作为模板，然后在其表面沉积含钛凝胶，并进行煅烧除去聚苯乙烯纳米微球模板，然后超声处理，制得具有蜂窝结构的纳米氧化钛层，蜂窝结构层纳米孔的平均直径为800-900nm，高度为100nm，经过紫外线光处理后，改善了蜂窝结构氧化钛层的亲水性，最后在其表面原位自组装一层聚多
巴胺，进一步改善了材料的亲水性和细胞粘附性。
具体实施方式
22.下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
23.实施例1
24.(1)将5g苯乙烯和100ml去离子水混合，加入0.05g过硫酸铵和1.25g聚乙烯吡咯烷酮，氮气气氛下升温至70℃反应8h，反应结束后冷却至室温，将过滤得到的固体进行冷冻干燥重新分散至去离子水中制得单分散聚苯乙烯纳米微球乳液；将直径为7
×
7mm的干净的硅基底置于单分散聚苯乙烯纳米微球乳液中以为4cm/min的速度浸提处理，保持静置浸渍2min，取出在100℃下干燥2h，制得沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅基底；
25.(2)将9ml钛酸四丁酯和35ml乙醇混合均匀后加入5ml冰醋酸混合搅拌处理30min，然后加入6ml乙醇和4ml去离子水的混合液，室温下搅拌反应1h，制得含钛凝胶；将沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅片置于含钛凝胶中控制浸提速率为20mm/min，静置浸涂时间为3min，取出干燥，如此反复2次，最后置于马弗炉内450℃下煅烧2h，之后置于100ml去离子水中500w下超声处理30min，取出干燥后置于光刻机中采用强度为10mw/cm2的紫外线照射处理30min，制得沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底；
26.(3)将上述制得的沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底置于100ml浓度为0.0015g/ml多巴胺的tris-hcl缓冲溶液中，常温、200w下超声处理1h，之后取出干燥，制得细胞粘附材料。
27.实施例2
28.(1)将5g苯乙烯和100ml去离子水混合，加入0.05g过硫酸铵和1.25g聚乙烯吡咯烷酮，氮气气氛下升温至70℃反应8h，反应结束后冷却至室温，将过滤得到的固体进行冷冻干燥重新分散至去离子水中制得单分散聚苯乙烯纳米微球乳液；将直径为7
×
7mm的干净的硅基底置于单分散聚苯乙烯纳米微球乳液中以为4cm/min的速度浸提处理，保持静置浸渍3min，取出在100℃下干燥3h，制得沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅基底；
29.(2)将9ml钛酸四丁酯和40ml乙醇混合均匀后加入5ml冰醋酸混合搅拌处理30min，然后加入6ml乙醇和4ml去离子水的混合液，室温下搅拌反应1h，制得含钛凝胶；将沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅片置于含钛凝胶中控制浸提速率为20mm/min，静置浸涂时间为3min，取出干燥，如此反复2次，最后置于马弗炉内450℃下煅烧2h，之后置于100ml去离子水中500w下超声处理30min，取出干燥后置于光刻机中采用强度为10mw/cm2的紫外线照射处理30min，制得沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底；
30.(3)将上述制得的沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底置于100ml浓度为0.0015g/ml多巴胺的tris-hcl缓冲溶液中，常温、200w下超声处理1h，之后取出干燥，制得细胞粘附材料。
31.实施例3
32.(1)将5g苯乙烯和100ml去离子水混合，加入0.05g过硫酸铵和1.25g聚乙烯吡咯烷酮，氮气气氛下升温至70℃反应8h，反应结束后冷却至室温，将过滤得到的固体进行冷冻干燥重新分散至去离子水中制得单分散聚苯乙烯纳米微球乳液；将直径为7
×
7mm的干净的硅
基底置于单分散聚苯乙烯纳米微球乳液中以为4cm/min的速度浸提处理，保持静置浸渍3min，取出在100℃下干燥3h，制得沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅基底；
33.(2)将9ml钛酸四丁酯和36ml乙醇混合均匀后加入5ml冰醋酸混合搅拌处理30min，然后加入6ml乙醇和4ml去离子水的混合液，室温下搅拌反应1h，制得含钛凝胶；将沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅片置于含钛凝胶中控制浸提速率为20mm/min，静置浸涂时间为3min，取出干燥，如此反复2次，最后置于马弗炉内450℃下煅烧2h，之后置于100ml去离子水中500w下超声处理30min，取出干燥后置于光刻机中采用强度为10mw/cm2的紫外线照射处理30in，制得沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底；
34.(3)将上述制得的沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底置于100ml浓度为0.0015g/ml多巴胺的tris-hcl缓冲溶液中，常温、200w下超声处理1h，之后取出干燥，制得细胞粘附材料。
35.实施例4
36.(1)将5g苯乙烯和100ml去离子水混合，加入0.05g过硫酸铵和1.25g聚乙烯吡咯烷酮，氮气气氛下升温至70℃反应8h，反应结束后冷却至室温，将过滤得到的固体进行冷冻干燥重新分散至去离子水中制得单分散聚苯乙烯纳米微球乳液；将直径为7
×
7mm的干净的硅基底置于单分散聚苯乙烯纳米微球乳液中以为4cm/min的速度浸提处理，保持静置浸渍2-3min，取出在100℃下干燥2.5h，制得沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅基底；
37.(2)将9ml钛酸四丁酯和37ml乙醇混合均匀后加入5ml冰醋酸混合搅拌处理30min，然后加入6ml乙醇和4ml去离子水的混合液，室温下搅拌反应1h，制得含钛凝胶；将沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅片置于含钛凝胶中控制浸提速率为20mm/min，静置浸涂时间为3min，取出干燥，如此反复2次，最后置于马弗炉内450℃下煅烧2h，之后置于100ml去离子水中500w下超声处理30min，取出干燥后置于光刻机中采用强度为10mw/cm2的紫外线照射处理30min，制得沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底；
38.(3)将上述制得的沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底置于100ml浓度为0.0015g/ml多巴胺的tris-hcl缓冲溶液中，常温、200w下超声处理1h，之后取出干燥，制得细胞粘附材料。
39.实施例5
40.(1)将5g苯乙烯和100ml去离子水混合，加入0.05g过硫酸铵和1.25g聚乙烯吡咯烷酮，氮气气氛下升温至70℃反应8h，反应结束后冷却至室温，将过滤得到的固体进行冷冻干燥重新分散至去离子水中制得单分散聚苯乙烯纳米微球乳液；将直径为7
×
7mm的干净的硅基底置于单分散聚苯乙烯纳米微球乳液中以为4cm/min的速度浸提处理，保持静置浸渍3min，取出在100℃下干燥2h，制得沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅基底；
41.(2)将9ml钛酸四丁酯和38ml乙醇混合均匀后加入5ml冰醋酸混合搅拌处理30min，然后加入6ml乙醇和4ml去离子水的混合液，室温下搅拌反应1h，制得含钛凝胶；将沉积有聚苯乙烯纳米球薄膜的硅片置于含钛凝胶中控制浸提速率为20mm/min，静置浸涂时间为3min，取出干燥，如此反复2次，最后置于马弗炉内450℃下煅烧2h，之后置于100ml去离子水中500w下超声处理30min，取出干燥后置于光刻机中采用强度为10mw/cm2的紫外线照射处理30min，制得沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底；
42.(3)将上述制得的沉积有光功能化的蜂窝状纳米氧化钛材料的硅基底置于100ml
浓度为0.0015g/ml多巴胺的tris-hcl缓冲溶液中，常温、200w下超声处理1h，之后取出干燥，制得细胞粘附材料。
43.对比例
44.不进行紫外线光功能化处理，其他条件和实施例5相同。
45.将5
×
104个人骨肉瘤mg-63(atcc crl-1427)细胞分别在上述实施例1-实施例5制得的细胞粘附材料表面培养3天，培养结束后，采用自动细胞计数器来计算样品表面活细胞的个数。
46.将上述实施例中制得的细胞粘附材料置于2ml浓度为1
×
106cfu/ml的金黄色葡萄球菌悬浮液浸泡3h，之后将样品进行细菌表面形态固定处理，并测试细胞粘附材料的细菌截留率。测试结果如表1所示。
47.表1
[0048] 活细胞个数/个细菌截留率，％实施例19
×
10492实施例29
×
10493实施例39
×
10492实施例49
×
10492实施例59
×
10493对比例7
×
10488
[0049]
从上述测试结果可以看出，本发明提供的细胞粘附材料不仅具有很好的细胞亲和性，可有效提高细胞增殖效率，且具有一定的抗细菌粘附性。
[0050]
此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。