一种仿生肖特基结纳米药物及其制备方法与应用

1.本发明属于肿瘤治疗领域，具体涉及一种仿生肖特基结纳米药物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.肿瘤内淋巴缺失和致密的细胞外基质(ecm)导致的高肿瘤间质压力(tip)严重阻碍了纳米药物向瘤内的深层渗透，这是目前影响肿瘤化疗药效的最主要因素之一。由于缺乏淋巴回流和肿瘤细胞外大量的细胞外大分子，如纤维蛋白、胶原蛋白、酶和糖蛋白形成致密ecm，导致高的肿瘤间质固体压力(tisp)，使得肿瘤和血管之间形成正压差，阻碍了药物从血管向肿瘤中心的有效递送。此外，水在肿瘤间质中大约占90％，高肿瘤间质液压(tifp)限制了化疗药物向瘤内的渗透。因此，迫切需要设计一种针对肿瘤的促进药物递送的策略，通过降低tip来克服药物递送障碍，增加药物在肿瘤中心的积累。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种仿生肖特基结纳米药物及其制备方法与应用。
4.水在肿瘤间质中占90％，因此通过催化分解水反应，可以降低肿瘤中的水含量，下调肿瘤间质液压(tifp)。贵金属和半导体形成的肖特基结是增强肿瘤催化反应的良好选择，因为肖特基结不仅可以有效促进电荷分离，提高光催化效率，而且贵金属在光激发下产生等离子体共振，将光能转化为热能，可以提高蛋白酶的活性，降解特定肿瘤部位的ecm，并且热疗与化疗药物联合杀伤肿瘤细胞。基于此，本发明提供一种仿生肖特基结纳米药物，通过光催化降低肿瘤间质中的水含量，同时，远程激活肿瘤部位的蛋白酶，以实现对致密ecm的降解，从而降低了肿瘤间质固压(tisp)。受益于tifp和tisp的同时降低，仿生肖特基结可以渗透到肿瘤中心。同时，等离子体热效应和化疗联合可以有效地杀伤肿瘤深层的干细胞。此外，在纳米药物外面包覆一层免疫细胞膜更利于药物靶向肿瘤细胞，增加药物在肿瘤处的积累量。本发明的技术方案如下：
5.本发明第一方面提供肖特基结型光催化剂在抗肿瘤药物递送中的应用。
6.本发明第二方面提供一种仿生肖特基结纳米药物，所述仿生肖特基结纳米药物包括如下之一的组成：
7.(1)肖特基结型光催化剂；
8.(2)肖特基结型光催化剂和免疫细胞膜，所述肖特基结型光催化剂包覆于所述免疫细胞膜中；
9.(3)肖特基结型光催化剂和蛋白酶；
10.(4)肖特基结型光催化剂、蛋白酶和免疫细胞膜，所述肖特基结型光催化剂和蛋白酶包覆于所述免疫细胞膜中。
11.进一步地，所述肖特基结型光催化剂为贵金属与半导体复合形成的催化剂；
12.优选地，所述肖特基结型光催化剂选自氧化亚铜/银。
13.进一步地，所述免疫细胞膜选自巨噬细胞、t细胞或nk细胞的细胞膜；
14.所述蛋白酶选自菠萝蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。
15.进一步地，(2)中所述肖特基结型光催化剂和免疫细胞膜的质量比为1-2:2-4；
16.(3)中所述肖特基结型光催化剂和蛋白酶的质量比为1-2:1-1.5；
17.(4)中所述肖特基结型光催化剂、蛋白酶和免疫细胞膜的质量比为1-2:1-1.5:2-4。
18.本发明第三方面提供一种仿生肖特基结纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
19.将cuso4.5h2o与葡萄糖加入去离子水中混合均匀，随后加入naoh和agno3溶液，在高温下搅拌，离心收集沉淀，即得肖特基结型光催化剂；
20.优选地，还包括下述步骤(1)或(2)：
21.(1)将制备好的肖特基结型光催化剂溶解于去离子水中，随后与免疫细胞膜混匀分散，放入40℃的空气浴中摇匀过夜，然后使用脂质体挤出器反复挤出20次，离心取沉淀，即得仿生肖特基结纳米药物；
22.(2)在制备好的肖特基结型光催化剂中加入蛋白酶溶液并混合均匀，随后与免疫细胞膜混匀分散，放入37-40℃的空气浴中摇匀12-24h，然后用脂质体挤出器反复挤出，离心取沉淀，即得仿生肖特基结纳米药物。
23.进一步地，所述cuso4.5h2o与葡萄糖的质量比为11-13:6-8；
24.所述naoh的浓度为16-18mg/ml；
25.所述agno3的浓度为2-3mg/ml；
26.优选地，所述搅拌的温度为70-80℃。
27.进一步地，步骤(1)中所述肖特基结型光催化剂和免疫细胞膜的质量比为1-2:2-4；
28.步骤(2)中肖特基结型光催化剂、蛋白酶和免疫细胞膜的质量比为1-2:1-1.5:2-4。
29.本发明第四方面提供所述仿生肖特基结纳米药物或所述制备方法制备得到的仿生肖特基结纳米药物在抗肿瘤药物递送中的应用或作为肿瘤治疗药物的应用。
30.本发明第五方面提供一种增强瘤内递送的抗肿瘤药物组合物，包括所述的仿生肖特基结纳米药物；
31.优选地，所述抗肿瘤药物组合物还包括抗肿瘤药物；
32.优选地，所述抗肿瘤药物包覆于所述免疫细胞膜中；
33.优选地，所述抗肿瘤药物为化疗药物。
34.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
35.1.本发明提供肖特基结型光催化剂在抗肿瘤药物递送中的应用，贵金属和半导体形成的肖特基结能够有效催化分解水反应，降低肿瘤中的水含量，下调肿瘤间质液压(tifp)，而且贵金属在光激发下产生等离子体共振，将光能转化为热能，可以提高蛋白酶的活性，降解特定肿瘤部位的ecm，并且热疗与化疗药物联合杀伤肿瘤细胞，在抗肿瘤药物递送中具有重要的应用前景。
36.2.本发明建立了一种基于光催化和酶解性能的仿生肖特基结纳米药物，可以同时
降低tifp和tisp，实现药物的高效瘤内递送，同时实现光热治疗和化疗的协同效果。具体地，仿生肖特基结纳米药物在近红外激光照射下，纳米药物可以通过分裂肿瘤间质的水来减少间质液体积，模拟淋巴回流的功能，同时激活热敏蛋白酶降解ecm，从而下调肿瘤内的tip，tip水平的降低结合巨噬细胞膜的同源靶向，促进更多的纳米药物进入肿瘤中心，同时，光催化材料氧化亚铜可以破坏肿瘤细胞线粒体从而起到化疗的作用，仿生肖特基结纳米药物可在肿瘤深层发挥化疗和光热治疗的协同治疗作用。本发明不仅拓宽肖特基结在生物治疗领域的应用，并且该治疗模式适用于各种恶性肿瘤，对提高纳米药物的临床深层递送效果具有重要的潜力。
37.3.本发明仿生肖特基结纳米药物在荷瘤鼠治疗的实验中，tifp和tisp分别降低了50-55％和14.3-16.3％。肿瘤中心的纳米药物含量远高于对照组，表现出远高于传统纳米药物的递送效率。该仿生肖特基结纳米药物在激光照射下，实现光热治疗和化疗的联合治疗，具有优异的治疗效果和生物安全性，具有进一步临床应用的潜力。
附图说明
38.图1为本发明实施例1获得的仿生肖特基结纳米药物的tem图；
39.图2为本发明实施例2获得的仿生肖特基结纳米药物的解水效率图；
40.图3为本发明实施例3获得的仿生肖特基结纳米药物的酶解效率图；
41.图4为实施例3获得的仿生肖特基结纳米药物的细胞靶向性能的结果；
42.图5为实施例3中获得的仿生肖特基结纳米药物和生理盐水处理荷瘤鼠14天内tifp的变化情况；
43.图6为实施例3获得的仿生肖特基结纳米药物及对照药物作用荷瘤鼠后的相对肿瘤体积变化情况。
具体实施方式
44.本发明一个优选方案中，所述的仿生肖特基结纳米药物，将木瓜蛋白酶(papain)通过巨噬细胞膜包覆到制备好的氧化亚铜/银(cu2o/ag)肖特基结上，得到仿生肖特基结纳米药物(cap@m)。近红外光照射下，cap@m通过肖特基结介导的光催化分解水实现了肿瘤间质液的分解，导致tifp的降低。此外，肖特基结产生的等离子体热量激活木瓜蛋白酶来降解肿瘤细胞外蛋白，从而降低了tisp。受益于tifp和tisp的减少，仿生肖特基结可以高度渗透到肿瘤中心。同时，等离子体光热效应和化疗可以有效地破坏深层肿瘤干细胞，提高肿瘤治疗效果。
45.以下结合实施例进一步描述本发明，当这些实施例并非限制本发明的范围。本发明的实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场可以购买到的常规试剂。
46.本发明实施例中缩写含义如下：
47.ca：cu2o/ag
48.m：巨噬细胞膜
49.p：蛋白酶
50.cap@m：仿生肖特基结纳米药物
51.l：激光
52.实施例1
53.将55mg cuso4.5h2o与30mg葡萄糖，加入提前预热的15ml去离子水中混合均匀后，同时加入2ml 16mg/ml的naoh和1ml 2mg/ml的agno3溶液，在70℃温度下搅拌30min。最后14000rpm，10min离心收集并依次用水和乙醇洗涤，共洗涤三次，得到cu2o/ag(ca)肖特基结。然后称取1mg的木瓜蛋白酶溶解于10ml去离子水中，将ca肖特基结和木瓜蛋白酶溶液与提取好的巨噬细胞膜(10ml 200ug/ml的ca肖特基结和约1
×
104个细胞提取出的细胞膜)在40℃的空气浴中摇匀过夜，然后使用脂质体挤出器反复挤出20次，10000rpm离心1小时取沉淀，得到制备好的cap@m纳米药物，4℃保存。用透射电子显微镜(tem)观察到银纳米颗粒均匀生长在100-200nm氧化亚铜上，并且完整包覆了巨噬细胞膜(图1)，以上结果证实了cap@m的成功制备。
54.实施例2
55.将60mg cuso4.5h2o与35mg葡萄糖，加入提前预热的15ml去离子水中混合均匀后，同时加入2ml 17mg/ml的naoh和2ml 2.5mg/ml的agno3溶液，在75℃温度下搅拌1小时。最后14000rpm，10min离心收集并分别使用水和乙醇洗涤三次，得到ca肖特基结。然后称取1.5mg的木瓜蛋白酶溶解于10ml去离子水中，将ca肖特基结和木瓜蛋白酶溶液与提取好的巨噬细胞膜(10ml 100ug/ml的ca肖特基结和约1
×
104个细胞提取出的细胞膜)在40℃的空气浴中摇匀过夜，然后使用脂质体挤出器反复挤出20次，10000rpm离心1小时取沉淀，得到制备好的cap@m纳米药物，4℃保存。检测了cap@m的催化剂解水性能如图2所示，当反应体系为100ml的1％乳酸溶液时，分解水产氢率为200.26μmol
·
h-1
·gcat-1
，证实该发明可以分解肿瘤间质液体从而降低tifp。
56.实施例3
57.将65mg cuso4.5h2o与40mg葡萄糖，加入提前预热的15ml去离子水中混合均匀后，同时加入18mg/mlnaoh和3mg/ml的agno3溶液，在80℃温度下搅拌2小时。最后14000rpm，10min离心收集并分别使用水和乙醇洗涤三次，得到ca肖特基结。然后称取1mg的木瓜蛋白酶溶解于10ml去离子水中，将cg肖特基结和木瓜蛋白酶溶液与提取好的巨噬细胞膜(10ml 100ug/ml的ca肖特基结和约1
×
104个细胞提取出的细胞膜)在40℃的空气浴中摇匀过夜，然后使用脂质体挤出器反复挤出20次，10000rpm离心1小时取沉淀，得到制备好的cap@m纳米药物，4℃保存。检测了cap@m的酶解性能如图3所示，检测到cap@m在激光照射下的活性为1820gdu/g，证实cap@m在近红外激光的激发下可以降低肿瘤的tisp，促进纳米药物向肿瘤中心的渗透。
58.用明胶消化单元(gdu)评价酶活性。取2.5ml明胶溶液(1％wt.在10mm pbs缓冲液中)与样品混匀，在660nm激光照射20min后，加入100μl(3％)h2o2淬灭反应。用naoh调节上述溶液的ph值至6.0，不断搅拌，加入甲醛200μl(37％)。用0.05n naoh滴定至ph值8.0。记录每次试验中naoh的滴定体积(v)，n为naoh的正态，gdu由式(1)计算如下：
59.gdu＝(vtest-vblank)
×n×
14mg
×
1000/mg酶
60.实施例4
61.为了验证加入巨噬细胞膜的主动靶向作用，将200ul 200ug/ml的ca和ca@m分别用罗丹明b染色，随后与hela细胞共同孵育4h，荧光如图4所示。在hela细胞中观察到ca@m中的
亮红色信号强于ca处理组细胞。这是由于ca@m表面的膜蛋白可以识别并主动靶向hela细胞，促进细胞摄取。结果证实该仿生肖特基结纳米药物具有主动靶向能力，从而更多的在肿瘤细胞处聚集。
62.实施例5
63.探究仿生肖特基结纳米药物对宫颈癌u14荷瘤小鼠tip的降低能力。本实施例在荷瘤小鼠肿瘤大小长到100mm2时，通过尾静脉注射药物，隔天进行激光照射，监测仿生肖特基结纳米药物治疗后的荷瘤小鼠在14天内的tip变化，tip通过针芯连接压力传感器测量(图5)。结果显示，生理盐水组的tip随着肿瘤的生长而增加，而ca@m l和cap@m l组的tip则保持在一个较低的水平，并且cap@m l组tip值低于ca@m l治疗组，这是由于cap@m l组加入了木瓜蛋白酶后可以同时通过分解水和降解ecm来降低tifp和tisp，这为纳米药物有效进入肿瘤细胞深处提供了有力证据。
64.实施例6
65.验证cap@m仿生肖特基结纳米药物对宫颈癌u14荷瘤小鼠的治疗作用，本实施例在荷瘤小鼠肿瘤大小长到100mm2时，通过尾静脉注射药物，隔天进行激光照射，监测仿生肖特基结纳米药物治疗后的荷瘤小鼠在14天内相对肿瘤体积，相对肿瘤体积＝v/v0，v代表是测量肿瘤体积，v0代表该治疗组初始肿瘤体积。结果如图6所示，cap@m加激光照射组对肿瘤体积的抑制作用高于生理盐水组和ca不加激光组和ca@m加激光组，这说明巨噬细胞膜的主动靶向能力以及降低tifp和tisp促进了更多药物进入肿瘤中心细胞，同时，cap@m化疗和光热疗法的协同治疗作用进一步杀死了深部的肿瘤细胞，达到了更好的消融肿瘤的效果。
66.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。