一种环保的脱蜡透明试剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于病理学组织切片技术领域，具体涉及一种环保的脱蜡透明试剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.常规石蜡包埋组织切片(常规切片)是组织学常规制片技术中最为广泛应用的技术，在病理学中常用于研究、观察及判断细胞组织的形态变化，常规切片与免疫学技术相结合可用于定性和定位观察研究组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质，常规切片与荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，fish)结合可用于细胞中基因定位和状态分析，目前已广泛的应用于多种学科领域的研究中。
3.福尔马林固定石蜡包埋组织是病理科最常用的样本保存方式，保存的样本稳定，且保存条件简便，可在医院档案中保存数年至数十年。
4.病理技术的首要任务是制作优良的切片，而在he(hematoxylin-eosin)常规石蜡制片技术中，组织透明、切片脱蜡、透明和封固剂制备都离不开透明脱蜡剂的使用，透明、脱蜡效果的好坏直接影响石蜡制片的质量。
5.透明脱蜡试剂是病理制片必须应用的有机溶剂，常规组织石蜡制片过程中常用二甲苯作为透明脱蜡剂，二甲苯作为透明脱蜡剂具有脱蜡彻底、透明能力强、时间短的优点，但也容易使病理组织收缩、变脆，对于不同的组织透明处理的时间不同，操作条件不易掌握，而且二甲苯属于中度毒性的化学试剂，会对长期在二甲苯环境下工作的技术人员的身体健康造成损害，二甲苯属于who认定的3类致癌物，并且会对环境造成污染。此外，二甲苯高度易燃、挥发性强，二甲苯的沸点低(143℃～145℃)、闪点为31℃，因此，使用二甲苯的替代品是必然的趋势。
6.目前文献报道的能够替代二甲苯的脱蜡试剂包括植物油、萜烯和烷烃等。每种替代物都能够满足不同的应用需求。
7.植物油主要是使用橄榄油、椰子油和花生油，植物油的透明效果与二甲苯相当，且对组织收缩影响更小。但是，植物油的粘度较高，且含有饱和脂肪酸，当温度降至某一临界点以下时，会出现浑浊乃至沉淀。
8.萜烯是一系列萜类化合物的总称，是分子式为异戊二烯的整数倍的烯烃类化合物，萜烯是一类广泛存在于植物体内的天然来源的碳氢化合物，可从许多植物中得到，特别是针叶树中得到，包括松节油、d-柠檬烯、佛手柑油、雪松油、丁香油或牛至油等。其中松节油、d-柠檬烯在脱蜡剂中已有成品使用，但是，此类试剂有较为强烈的气味，不便于使用。
9.烷烃包括汽油、石脑油或干洗溶剂等石油衍生物，是一种比较好的二甲苯替代品，部分烷烃的气味较淡、油性不高、危害水平低，市面上较多的脱蜡透明产品都是以烷烃为主成分或者是组合配方。
10.此外，石蜡本身也可作为一种脱蜡的试剂，比较有效的方案是矿物油、异丙醇配比混溶后的试剂进行脱蜡，但是，该方法需要较高的温度以保证彻底脱蜡。
11.目前临床医院病理组织包埋多使用组织脱水包埋设备，减少了医护人员与二甲苯的直接接触。而免疫组化、fish制片目前还是以手工操作为主，因此，开发一种溶蜡稳定、低挥发度、低气味、高燃点、面向制片过程使用的脱蜡透明试剂具有重要的应用价值。


技术实现要素：

12.本发明的目的在于提供一种环保的脱蜡透明试剂及其制备方法和应用，所述环保的脱蜡透明试剂面向制片过程使用，所述环保的脱蜡透明试剂溶蜡稳定、溶蜡速度快、低挥发度、低气味、高燃点，所述脱蜡透明试剂能够降低组织折射率，使得切片更加均匀通透，切片结构清晰。所述脱蜡透明试剂的原料为无毒安全的产品，使用安全方便。
13.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
14.第一方面，本发明提供一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂包括引发剂、溶蜡剂、透明剂和溶液改良剂；
15.所述引发剂包括正链烷烃；
16.所述溶蜡剂包括异构烷烃；
17.所述透明剂包括叔丁醇、peg甲基丙烯酸酯、n,n,n,n-四(2-羟基丙基)乙二胺、苯甲酸苄酯、聚乙二醇、苯甲醇或二苯醚中任意一种或至少两种的组合。
18.本发明中，所述脱蜡透明试剂能够与石蜡和乙醇混溶，且通过降低组织折射率使得切片更加均匀通透，切片结构清晰。所述脱蜡透明试剂的原料为无毒安全的产品，使用方便，可在一般实验室使用，不需要在通风橱中使用。
19.优选地，所述环保的脱蜡透明试剂中引发剂和溶蜡剂的重量比为(1～4):(2～15)，例如可以是1:2、1:5、1:10、2:5、3:10、1:12、1:15或4:15等。
20.本发明中，所述异构烷烃与石蜡作用速度缓慢，室温溶蜡几乎无效；所述正链烷烃在室温不能溶蜡，但是通过加热可以溶蜡，56℃加热2min便可溶蜡，但溶蜡不稳定，随着温度降低，石蜡重新析出，变成浑浊溶液乃至凝固。在正链烷烃中加入异构烷烃，可在室温进行脱蜡，且溶液澄清不浑浊。
21.优选地，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：引发剂1～4份、溶蜡剂2～15份、透明剂1～3份和溶液改良剂0.5～4份。
22.本发明中，所述引发剂的重量份数为1～4份，例如可以是1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份或4份等。
23.本发明中，所述溶蜡剂的重量份数为2～15份，例如可以是2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份等。
24.本发明中，所述透明剂的重量份数为1～3份，例如可以是1份、1.5份、2份、2.5份或3份等。
25.本发明中，所述溶液改良剂的重量份数为0.5～4份，例如可以是0.5份、1份、1.2份、1.5份、2份、2.5份、3份或4份等。
26.优选地，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：引发剂1～2份、溶蜡剂5～12份、透明剂1～2份和溶液改良剂0.5～2份。
27.优选地，所述引发剂包括正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、正十一烷、正十二烷、正十三烷、正十四烷、正十五烷或正十六烷中任意一种或至少两种的组合。
28.优选地，所述溶蜡剂包括异构癸烷、异构十一烷、异构十二烷、异构十三烷、异构十四烷、异构十五烷、异构十六烷、异构十七烷、异构十八烷、异构十九烷、异构二十烷中任意一种或至少两种的组合。
29.本发明中，所述引发剂为c7～c16的正链烷烃，所述溶蜡剂为c10～c20的异构烷烃，通过正链烷烃与异构烷烃的复合使用，能够增加溶蜡和脱蜡的效果，同时其挥发性较低，使用便捷，溶蜡脱蜡效果好。
30.优选地，所述溶液改良剂包括7
#
～100
#
白油，例如可以是7
#
白油、10
#
白油、15
#
白油、20
#
白油、32
#
白油、40
#
白油、50
#
白油、60
#
白油、70
#
白油、80
#
白油或100
#
白油等。
31.在本发明中，所述异构烷烃的表面张力低，倾倒时容易沿着容器边缘流下，使用不方便。通过加入白油调节溶液粘度，调整了液体的表面张力，使其倾倒方便，当加入的白油的牌号较大时(白油粘度较大)，降低添加量，当加入的白油的牌号较小时(白油粘度较小)，增加添加量，通过改变添加量实现对液体的表面张力的调整。
32.优选地，所述溶蜡剂包括异构癸烷、异构十一烷、异构十二烷、异构十三烷、异构十四烷、异构十五烷或异构十六烷中任意一种或至少两种的组合。
33.本发明中，所述溶蜡剂中异构烷烃的含碳量越大其挥发性越低，更有利于使用，含碳量越大其与乙醇互溶性越差，需与更多的引发剂配套使用。
34.优选地，所述透明剂包括叔丁醇和/或苯甲酸苄酯。
35.本发明中，通过加入透明剂能够使组织切片更加通透，溶蜡后的溶液稳定，溶解的石蜡不出现析出现象。
36.第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的环保的脱蜡透明试剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将引发剂、溶蜡剂、透明剂和溶液改良剂混合，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
37.优选地，所述混合的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
38.优选地，所述混合方式包括电动搅拌和/或磁力搅拌。
39.优选地，所述电动搅拌的转速为200～1000rpm，例如可以是200rpm、300rpm、500rpm、800rpm或1000rpm等，所述电动搅拌的时间为1～30min，例如可以是1min、2min、5min、10min、15min、20min、25min或30min等。
40.优选地，所述磁力搅拌的转速为100～500rpm，例如可以是100rpm、200rpm、300rpm、400rpm或500rpm等，所述磁力搅拌的时间为3～100min，例如可以是3min、5min、15min、20min、40min、60min、80min或100min等。
41.作为本发明的优选技术方案，所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法包括如下步骤：按重量份数将引发剂、溶蜡剂、透明剂和溶液改良剂在20～25℃下进行电动搅拌1～30min，转速为200～1000rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂；
42.或者按重量份数将引发剂、溶蜡剂、透明剂和溶液改良剂在20～25℃下进行磁力搅拌3～100min，转速为100～500rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
43.第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的环保的脱蜡透明试剂的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
44.(1)取石蜡包埋的切片样本，烤片后置于所述环保的脱蜡透明试剂中浸泡；
45.(2)将步骤(1)中浸泡后的切片样本置于无水乙醇中浸泡；
46.(3)将步骤(2)中浸泡后的切片样本依次置于无水乙醇、85～90vol％乙醇、65～70vol％乙醇和纯化水中浸泡。
47.本发明中，浸泡切片样本使用85～90vol％乙醇，例如可以是85vol％乙醇、86vol％乙醇、87vol％乙醇、88vol％乙醇、89vol％乙醇或90vol％乙醇等；所述65～70vol％乙醇，例如可以是65vol％乙醇、66vol％乙醇、67vol％乙醇、68vol％乙醇、69vol％乙醇或70vol％乙醇等。
48.优选地，步骤(1)中，所述烤片的时间为15～20min，例如可以是15min、16min、17min、18min、19min或20min，所述烤片的温度为55～65℃，例如可以是55℃、57℃、60℃、63℃或65℃等。
49.优选地，步骤(1)中，所述浸泡的时间为5～20min，例如可以是5min、8min、10min、12min、15min、16min、18min或20min等，所述浸泡的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
50.优选地，步骤(2)中，所述浸泡的时间为5～20min，例如可以是5min、8min、10min、12min、15min、16min、18min或20min等，所述浸泡的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
51.优选地，步骤(3)中，在无水乙醇、85～90vol％乙醇、65～70vol％乙醇和纯化水中浸泡的时间各自独立地为1～20min，例如可以是1min、2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min或20min等，浸泡的温度各自独立地为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
52.第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的环保的脱蜡透明试剂在制备病理学组织切片中的应用。
53.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
54.(1)所述脱蜡透明试剂能够与石蜡和乙醇混溶，且通过降低组织折射率使得切片更加均匀通透，切片结构清晰。所述脱蜡透明试剂的原料为无毒安全的产品，使用方便，可在一般实验室使用，不需要在通风橱中使用。
55.(2)所述脱蜡透明试剂中正链烷烃与异构烷烃复配使用，可在室温进行脱蜡，且溶液澄清不浑浊，挥发性较低，使用便捷。
56.(3)通过加入透明剂能够使组织切片更加通透，溶蜡后的溶液更加稳定，溶解的石蜡不出现析出现象。
附图说明
57.图1为测试例1中实施例1的脱蜡透明试剂处理的乳腺癌组织切片样本的检测结果图(放大倍数1000
×
)。
58.图2为测试例1中对比例2的脱蜡透明试剂处理的肺癌组织切片样本的检测结果图(放大倍数1000
×
)。
59.图3为测试例1中对比例4的脱蜡透明试剂处理的肺癌组织切片样本的检测结果图(放大倍数1000
×
)。
60.图4为测试例2中脱蜡透明试剂的挥发性验证结果图(左，实施例4中所述脱蜡透明
试剂；右，南昌雨露浸蜡脱蜡透明液)。
61.图5为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的甲状腺组织切片样本的检测结果图(放大倍数20
×
)。
62.图6为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的扁桃体组织切片样本的检测结果图(放大倍数10
×
)。
63.图7为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的扁桃体组织切片样本的检测结果图(放大倍数20
×
)。
64.图8为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的阑尾组织切片样本的检测结果图(放大倍数10
×
)。
65.图9为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的阑尾组织切片样本的检测结果图(放大倍数20
×
)。
66.图10为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的肺腺癌组织切片样本的检测结果图(放大倍数10
×
)。
67.图11为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的宫颈癌组织切片样本的检测结果图(放大倍数10
×
)。
68.图12为测试例3中实施例5的脱蜡透明试剂处理的子宫内膜组织切片样的检测结果图(放大倍数10
×
)。
具体实施方式
69.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
70.实施例中未标明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或未标注生产厂商者，均为可通过正规渠道采购获得的常规产品。
71.以下实施例、对比例和测试例中，各材料的来源如下所示：
[0072][0073]
实施例1
[0074]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：
[0075]
正十六烷1份、异构十二烷10份、叔丁醇1份和32
#
白油1.2份。
[0076]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法包括如下步骤：
[0077]
取正十六烷1份、异构十二烷10份、叔丁醇1份和32
#
白油1.2份，在20℃下进行电动搅拌10min，转速为400rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
[0078]
实施例2
[0079]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：
[0080]
正十二烷1份、异构十六烷10份、苯甲酸苄酯1份和32
#
白油1.2份。
[0081]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法包括如下步骤：
[0082]
正十二烷1份、异构十六烷10份、苯甲酸苄酯1份和32
#
白油1.2份，在25℃下进行电动搅拌20min，转速为300rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
[0083]
实施例3
[0084]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：
[0085]
正癸烷3份、异构十一烷15份、苯甲酸苄酯1份和32
#
白油1.2份。
[0086]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法包括如下步骤：
[0087]
取正癸烷3份、异构十一烷15份、苯甲酸苄酯1份和32
#
白油1.2份，在24℃下进行磁力搅拌15min，转速为200rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
[0088]
实施例4
[0089]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：
[0090]
正庚烷3份、异构十六烷12份、苯甲酸苄酯2份和15
#
白油3份。
[0091]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法包括如下步骤：
[0092]
取正庚烷3份、异构十六烷12份、苯甲酸苄酯2份和15
#
白油3份，在25℃下进行磁力搅拌7min，转速为200rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
[0093]
实施例5
[0094]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂按重量份数计包括：
[0095]
正癸烷3份、异构十四烷12份、n,n,n,n-四(2-羟基丙基)乙二胺2份和32
#
白油1.2份。
[0096]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法包括如下步骤：
[0097]
取正癸烷3份、异构十四烷12份、n,n,n,n-四(2-羟基丙基)乙二胺2份和32
#
白油1.2份，在20℃下进行电动搅拌20min，转速为800rpm，得到所述环保的脱蜡透明试剂。
[0098]
实施例6
[0099]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1的区别仅在于所述正十六烷的重量份数为0.5份。
[0100]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量制备混合得到脱蜡透明试剂，所述脱蜡透明试剂无法溶解石蜡，呈乳白浊状。
[0101]
实施例7
[0102]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1的区别仅在于所述正十六烷的重量份数为6份。
[0103]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量混合制备得到脱蜡透明试剂，所述脱蜡透明试剂在加热条件下能够溶解石蜡，但是温度降低时石蜡会重新凝固，无法实现脱蜡。
[0104]
实施例8
[0105]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1的区别仅在于所述异构十二烷的重量份数为1份。
[0106]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量混合制备得到脱蜡
透明试剂，所述脱蜡透明试剂无法溶解石蜡。
[0107]
实施例9
[0108]
本实施例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1的区别仅在于所述异构十二烷的重量份数为20份。
[0109]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量混合制备得到脱蜡透明试剂，所述脱蜡透明试剂在加热条件下能够溶解石蜡，但是温度降低时石蜡会重新凝固，无法实现脱蜡。
[0110]
对比例1
[0111]
本对比例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1相比，所述环保的脱蜡透明试剂中不含正十六烷；
[0112]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量混合制备得到脱蜡透明试剂，所述脱蜡透明试剂无法溶解石蜡。
[0113]
对比例2
[0114]
本对比例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1相比，所述环保的脱蜡透明试剂中不含叔丁醇；
[0115]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1。
[0116]
对比例3
[0117]
本对比例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1相比，所述环保的脱蜡透明试剂中不含32
#
白油；
[0118]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量混合制备得到脱蜡透明试剂，所述脱蜡透明试剂不含32
#
白油，在倾倒液体过程中，大量液体沿着容器外壁留下，污染桌面和试剂瓶外壁。
[0119]
对比例4
[0120]
本对比例提供一种环保的脱蜡透明试剂，与实施例1相比，所述环保的脱蜡透明试剂中不含叔丁醇和32
#
白油；
[0121]
所述环保的脱蜡透明试剂的制备方法参考实施例1，按配方量制备得到脱蜡透明试剂，所述脱蜡透明试剂不含叔丁醇和32
#
白油，在倾倒液体过程中，大量液体沿着容器外壁留下，污染桌面和试剂瓶外壁。
[0122]
测试例1
[0123]
取实施例1、对比例2和对比例4中所述的环保的脱蜡透明试剂进行荧光原位杂交实验，所述实验包括如下步骤：
[0124]
取10例中性福尔马林固定石蜡包埋的切片样本，所述切片样本包括乳腺癌组织切片样本和肺癌组织切片样本，所述切片样本的厚度3μm。
[0125]
所述乳腺癌组织切片样本所使用的探针为her2探针，所述肺癌组织切片样本使用的探针为ret(10q11)基因断裂探针。
[0126]
将所述切片样本进行热台烤片20min，温度为60℃，烤片后，将所述切片样本分别放入实施例1和对比例2中所述环保的脱蜡透明试剂中浸泡10min*2缸，取出切片样本在25℃置于无水乙醇中浸泡10min，再依次放入无水乙醇、90vol％乙醇和70vol％乙醇中各浸泡3min，放入纯化水浸泡3min，甩去多余水分。
[0127]
将切片放入99℃纯化水中煮片25min，取出玻片室温晾干。在样本区滴加37℃预热的胃蛋白酶200μl，消化。甩去多余液体，放入室温2
×
ssc缓冲液中浸泡3min，再依次放入无水乙醇、90vol％乙醇和70vol％乙醇各浸泡2min，取出切片样本室温晾干。
[0128]
从-20℃冰箱取出探针，震荡混匀，瞬时离心，加入10μl探针到杂交区域，盖上22
×
22mm盖玻片，轻压使探针均匀分布，避免产生气泡。用橡胶水泥沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片和载玻片接触部分。
[0129]
将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿条，放入湿条卡位，盖上杂交仪上盖，设置“denat&hyb”程序，变性85℃，5min，杂交37℃，10h。杂交结束后，撕去橡皮水泥，移去盖玻片，放入37℃2
×
ssc缓冲液中浸泡10min，再放入0.1％np40/2
×
ssc缓冲液浸泡5min，室温70vol％乙醇浸泡3min，取出玻片，在暗处晾干。滴加10μl dapi溶液至干燥的22
×
22mm盖玻片上，反转样本片，使盖玻片与载玻片的目标区域接触，反转轻压排去气泡，使用显微镜观察切片样本。
[0130]
其中，实施例1所述环保的脱蜡透明试剂处理的组织切片样本的检测结果：
[0131]
乳腺癌组织切片样本的检测结果如图1所示，从图1中可以看出组织消化完整，细胞核裸露清晰，dpai染色均匀，与背景对比清晰，通过特异通道滤光片观察到her2和cep17的信号点明亮，边缘清晰。
[0132]
其中，对比例2和对比例4中所述环保的脱蜡透明试剂处理的组织切片样本的检测结果如下：
[0133]
对比例2中脱蜡透明试剂处理肺癌组织切片样本的检测结果如图2所示。使用对比例2的配方进行脱蜡，镜下组织可见，胃蛋白酶消化结果正常，阅片认为组织背景白亮，无法与本底形成清晰对照。对比例2所述环保的脱蜡透明试剂中不含叔丁醇，在溶蜡之后，蜡质还会在切片样本上析出，脱蜡的效果较差，后续的杂交实验中杂交效率低，信号点细，不利于fish结果的观测。
[0134]
对比例4所述环保的脱蜡透明试剂中不含叔丁醇和32
#
白油，其处理后的肺癌组织切片样本的检测结果如图3所示。所述环保的脱蜡透明试剂脱蜡效果较差，后续的杂交实验中杂交效率低，信号点细，影响fish结果的观测。
[0135]
测试例2
[0136]
对实施例4中所述的环保的脱蜡透明试剂进行挥发性验证，其中对照为南昌雨露浸蜡脱蜡透明液。
[0137]
在培养皿中放入50mg切片石蜡蜡卷，蜡卷的厚度为5μm，各加入10ml脱蜡剂，对照为南昌雨露浸蜡脱蜡透明液。
[0138]
两种脱蜡试剂室温放置1min，均可溶蜡。
[0139]
经测试，室温静置4天后，对照出现白色蜡样物质，溶液已经基本挥发完毕，其测试结果如图4所示。室温放置4天，实施例4中所述环保的脱蜡透明试剂仍为液态，南昌雨露浸蜡脱蜡透明液为软蜡状的混合物。
[0140]
测试例3
[0141]
取实施例5所述的环保的脱蜡透明试剂进行免疫组化实验，所述实验包括如下步骤：
[0142]
取10例中性福尔马林固定石蜡包埋的切片样本，所述切片样本包括甲状腺组织切
片样本、扁桃体组织切片样本、阑尾组织切片样本、肺腺癌组织切片样本、宫颈癌组织切片样本和子宫内膜组织切片样本，所述切片样本的厚度3μm。
[0143]
将所述切片样本进行热台烤片20min，温度为60℃，烤片后，将所述切片样本分别放入实施例5、对比例1、对比例3和对比例4中所述环保的脱蜡透明试剂中浸泡10min*2缸，取出切片样本在25℃置于无水乙醇中浸泡10min，再依次放入无水乙醇、90vol％乙醇和70vol％乙醇中各浸泡5min，放入纯化水浸泡5min，甩去多余水分。
[0144]
使用edta溶液高压修复2min，取出切片样本甩干。用免疫组化笔在组织边缘外2mm处画圈，然后浸泡在tpbs中备用，注意保持组织湿润。用蒸馏水配制新鲜的3vol％h2o2溶液，甩去切片样本的多余水分，将3vol％h2o2溶液滴加到组织上，室温封闭10min，用纯化水冲洗2min，放入pbs缓冲液中待用。
[0145]
从pbs缓冲液中取出切片样本，甩干，待圈显现后，在圈内滴加即用型一抗，室温下孵育30min，结束后，用pbs缓冲液冲洗掉多余的一抗试剂，放入pbs缓冲液中待用。从pbs缓冲液中取出切片样本甩干，待圈出来后，在圈内滴加二抗，室温下孵育20min，结束后，用pbs缓冲液冲洗掉多余的二抗试剂后，放入pbs缓冲液中待用。配制新鲜的dab显色液，把切片样本甩干后，在圈内滴加dab显色液，孵育3min，用纯化水终止染色，用自来水冲洗4次。
[0146]
本测试例中所述一抗来自于广州安必平医药科技有限公司，所述dab显色液来自于广州安必平医药科技有限公司，产品编号为ibf10-01；本测试例中不同的切片样本所使用的一抗和二抗的种类如表1所示。
[0147]
表1
[0148][0149][0150]
切片样本甩干后，置于苏木素染液缸里浸泡3min，取出切片架，用自来水浸洗多次至多余的苏木素染料被清洗干净；甩掉水分后放入pbs缓冲液中返蓝1min后，用自来水冲洗5次，脱水透明封片，用显微镜观测切片样本。
[0151]
其中，实施例5所述环保的脱蜡透明试剂处理的组织切片样本的检测结果：
[0152]
甲状腺组织切片样本的检测结果如图5所示，扁桃体组织切片样本的检测结果如图6和图7所示，阑尾组织切片样本的检测结果如图8和图9所示，肺腺癌组织切片样本的检测结果如图10所示，宫颈癌组织切片样本的检测结果如图11所示，子宫内膜组织切片样的检测结果如图12所示，从图中可以看出切片样本染色均匀，阳性表达区可见深色信号表达，高倍镜下看细胞核内无明显液滴。
[0153]
测试例4
[0154]
测试实施例1～5所述的环保的脱蜡透明试剂在室温下的溶蜡速率和饱和脱蜡率。
[0155]
溶蜡速率的测定方法：
[0156]
取病理切片石蜡(上海华永石蜡有限公司)制备成空白蜡块，按5μm厚度切片，称量一定重量的蜡卷，加入一定量的脱蜡剂溶解石蜡，记录溶解所需时间。
[0157]
饱和脱蜡率的测定方法：
[0158]
取病理切片石蜡(上海华永石蜡有限公司)制备成空白蜡块，按5μm厚度切片，称量一定重量的蜡卷，加入一定量的脱蜡剂溶解石蜡，记录在20min完全溶解石蜡的脱蜡剂使用量。
[0159]
实施例1～5所述的环保的脱蜡透明试剂的溶蜡速率和饱和脱蜡率的结果如表2所示：
[0160]
表2
[0161]
样品溶蜡速率饱和脱蜡率(换算后)实施例110mg/ml*(4min 58s)51mg/ml实施例210mg/ml*(4min 51s)47mg/ml实施例320mg/ml*(9min 08s)52mg/ml实施例420mg/ml*(10min 02s)48mg/ml实施例550mg/ml*(21min 04s)50mg/ml
[0162]
由表1可知，使用10ml实施例1中的脱蜡透明试剂溶解100mg的石蜡需要4min 58s，使用10ml实施例2中的脱蜡透明试剂溶解100mg的石蜡需要4min 51s，使用10ml实施例3中的脱蜡透明试剂溶解200mg的石蜡需要9min08s，使用10ml实施例4中的脱蜡透明试剂溶解200mg的石蜡需要10min 02s，使用10ml实施例5中的脱蜡透明试剂溶解500mg的石蜡需要21min 04s。测试结果表明，实施例1～5中的脱蜡透明试剂溶蜡速率均较快，可在室温进行脱蜡，且溶液澄清不浑浊，挥发性较低，使用便捷，适用于临床试验。
[0163]
实施例1～5所述的环保的脱蜡透明试剂的饱和溶蜡量介于47～52mg/ml之间，所述环保的脱蜡透明试剂的溶蜡速率快，脱蜡透明的效果显著。
[0164]
综上，本发明提供了一种环保的脱蜡透明试剂，所述环保的脱蜡透明试剂面向制片过程使用，所述环保的脱蜡透明试剂溶蜡稳定、溶蜡速度快、低挥发度、低气味、高燃点，所述脱蜡透明试剂能够降低组织折射率，使得切片更加均匀通透，切片结构清晰。所述脱蜡透明试剂的原料为无毒安全的产品，溶蜡速率快，溶蜡效率高，使用安全方便。
[0165]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。