生物活性纳米复合水凝胶敷料及其制备方法

1.本发明涉及生物医用材料、组织工程和再生医学的技术领域，尤其是指一种用于糖尿病溃疡的生物活性纳米复合水凝胶敷料及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病性溃疡是糖尿病最严重的并发症之一，伴有愈合延迟和过度炎症以及细胞外基质功能受损。糖尿病足溃疡已成为许多国家截肢的主要原因。影响糖尿病溃疡愈合主要原因是血管网络损伤和细菌感染。血管网络的重建和细菌的消除对糖尿病溃疡的治疗至关重要。除了对患者进行血糖的控制，糖尿病溃疡的治疗常常借助一些功能材料来实现。然而目前临床上的大多数材料存在功能单一且生物活性低的缺点，无法有效地修复创面。
3.水凝胶能够吸附组织渗出液，保持创面水分及时交换创面附近的气体(o2、 co2等)，是创面修复的最佳材料。更重要的是水凝胶的性能可以根据所需进行设计。对于具有窦道的严重的糖尿病创面，传统的水凝胶通常预制成型，不易塑性，只能修复伤口的表面，导致较高的复发率。而具有自动自适应和可注射性能的水凝胶可以与各种形状的创面匹配，更好地修复创面。而且根据临床实际需求，还可以赋予水凝胶抗菌性、自愈性、粘接性等，以提高其实用性。同时水凝胶也是生物活性物质的优良载体。具有生物活性的敷料能够从内源性通道来加快创面修复。临床上常常使用生长因子来实现生物活性，然而由于其存在价格昂贵且半衰期短的缺点，极大地限制了其广泛应用。生物活性玻璃(bgs) 是一种具有高生物活性和相容性的无机修复材料，能够促进血管的形成、细胞外基质(ecm)和胶原纤维的沉积加快创面愈合。而且在bgs网络中掺杂生物活性金属离子mg
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也能够实现促进血管生成、降低炎症以及促进细胞迁移、增殖和分化的功能。因此，基于实用性和生物活性开发的多功能水凝胶为糖尿病溃疡的治疗提供一种可替代材料。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种用于糖尿病溃疡的生物活性纳米复合水凝胶敷料及其制备方法，该敷料通过苯硼酸酯和静电作用动态键制得，具有可注射性、自适应性、自愈合性、粘附性、抗菌性以及生物活性。
5.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种用于糖尿病溃疡的生物活性纳米复合水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
6.1)以碱溶液为催化剂，以正硅酸四乙酯(teos)、磷酸三乙酯(tep)、四水合硝酸钙(cn)和硝酸镁(mn)为原料，采用溶胶-凝胶法制备含镁生物活性玻璃微球；将季铵盐改性聚合物材料和苯硼酸改性聚合物材料分别以不同的浓度溶解在去离子水中；
7.2)将含镁生物活性玻璃微球加入到苯硼酸改性聚合物材料的水溶液中并搅拌均匀，得到混合物，然后再往该混合物中加入季铵盐改性聚合物材料的水溶液并搅拌均匀，便能快速制得水凝胶，然后在室温下继续搅拌，以确保生成的水凝胶稳定。
8.进一步，在步骤1)中，所述含镁生物活性玻璃微球的制备如下：
9.将2-10g碱溶液在特定温度下溶于20-100ml无水乙醇和10-100ml去离子水的混合物中；然后滴加5-20ml正硅酸乙酯(teos)继续搅拌预设时间；接着每隔一段时间依次加入0.5-2ml磷酸三乙酯(tep)、2-10g四水合硝酸钙(cn)和 2-10g硝酸镁(mn)；再在特定温度下搅拌2-12h，而后用无水乙醇和去离子水离心洗涤三次，得到粗产物；最后，将粗产物在500-800℃空气中烧结2-8h去除碱溶液、乙醇和反应单体，得到最终产品，即含镁生物活性玻璃微球。
10.进一步，在步骤1)中，所述季铵盐改性聚合物材料的制备如下：
11.将聚合物材料2-10wt％的浓度溶于水溶液中，在25-55℃下完全溶解，得到混合物；然后将缩水甘油基三甲基氯化铵(gtmac)加入该混合物中，在25-55℃下搅拌反应10-24h，得到反应产物；接着将反应产物转速离心，去除未反应物质；而后再在去离子水透析，最后，通过冷冻干燥得到季铵盐改性聚合物材料。
12.进一步，按照缩水甘油基三甲基氯化铵(gtmac)与聚合物材料上的氨基 1:1-5:1的比例加入缩水甘油基三甲基氯化铵(gtmac)。
13.进一步，在步骤1)中，所述苯硼酸改性聚合物材料的制备如下：
14.将聚合物材料溶于2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)溶液中得到浓度为0.5-2wt％的溶液，加入羧基活化剂活化20-60分钟，再加入氨基苯硼酸，在避光条件下连续搅拌12-48h，得到反应液，最后，将反应液在去离子水中透析后冻干，得到苯硼酸改性聚合物材料。
15.进一步，在步骤1)中，所述碱溶液为氨水、氢氧化钠、十二胺中的一种或几种组合；所述季铵盐改性聚合物材料为明胶、壳聚糖、胶原、羧甲基壳聚糖中的一种或几种组合；所述苯硼酸改性聚合物材料为海藻酸钠、壳聚糖、明胶、葡聚糖、透明质酸中的一种或几种组合。
16.进一步，在步骤1)中，所述四水合硝酸钙(cn)的加入量为2-10g，硝酸镁 (mn)的加入量为2-10g。
17.进一步，在步骤1)中，所述季铵盐改性聚合物材料的浓度为1-5wt％，苯硼酸改性聚合物材料的浓度为1-5wt％。
18.进一步，在步骤2)中，所述含镁生物活性玻璃微球的添加量为0.2-1wt％。
19.本发明也提供了一种由上述方法制备得到的生物活性纳米复合水凝胶敷料，用于糖尿病溃疡。
20.本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
21.本发明通过苯硼酸酯和静电作用制得水凝胶，所制备的水凝胶具有一定的力学强度，并且能够在重力和表面张力的作用下适应各种不规则的创面，能够很好地填充有窦道的糖尿病溃疡。水凝胶能够粘附在创面处，进而更好地发挥季铵盐的抗菌性能。更重要的是，含镁生物活性玻璃微球的引入赋予水凝胶促成血管、抗炎以及促创面愈合的生物功能，从而加速糖尿病溃疡的高质量愈合。
附图说明
22.图1为实施例1中含镁生物活性玻璃微球的sem图。
23.图2为实施例1中水凝胶构建的机理示意图。
24.图3为实施例1中所得到的水凝胶的自适应性验证图。
25.图4为实施例1中所得到的水凝胶的抗菌性验证图。
26.图5为实施例2中所得到的水凝胶的可注射性验证实物图。
27.图6为实施例2中所得到的水凝胶的自愈合性验证图。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
29.以下所用季铵盐改性羧甲基壳聚糖的制备包括以下步骤：
30.将羧甲基壳聚糖以5wt％的浓度溶于醋酸的水溶液中，在25℃下完全溶解 30min。接着按照缩水甘油基三甲基氯化铵(gtmac)与羧甲基壳聚糖的氨基 1:1加入gtmac到上述混合物中，在25℃下搅拌反应10h。然后将反应产物以 4500rpm的转速离心30min，去除未反应物质。将上清液倒入预冷的丙酮中，得到粗产物。将粗产物在去离子水中再溶解，然后在去离子水透析7d。最后通过冷冻干燥得到季铵盐改性羧甲基壳聚糖。
31.以下所用苯硼酸改性明胶的制备包括以下步骤：
32.1)取5.33g 2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)于500ml去离子水中，得到浓度为 0.05mol/l的mes缓冲溶液；
33.2)将5g明胶溶于500ml的mes缓冲溶液中得到浓度为1wt％的溶液，加入羧基活化剂活化20分钟，再加入适量的氨基苯硼酸，在避光条件下连续搅拌 24h，将反应液在去离子水中透析3d后冻干，得到苯硼酸改性明胶。
34.以下所用季铵盐改性胶原的制备包括以下步骤：
35.将胶原以10wt％的浓度溶于水溶液中，在40℃下完全溶解30min。接着按照缩水甘油基三甲基氯化铵(gtmac)与胶原的氨基5:1加入gtmac到上述混合物中，在40℃下搅拌反应24h。然后将反应产物以4500rpm的转速离心 30min，去除未反应物质。然后在去离子水透析7d。最后通过冷冻干燥得到季铵盐改性胶原。
36.以下所用苯硼酸改性海藻酸钠的制备包括以下步骤：
37.1)取5.33g 2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)于500ml去离子水中，得到浓度为 0.05mol/l的mes缓冲溶液；
38.2)将4g海藻酸钠溶于200ml的mes缓冲溶液中得到浓度为2wt％的溶液，加入羧基活化剂活化60分钟，再加入适量的氨基苯硼酸，在避光条件下连续搅拌12h，将反应液在去离子水中透析3d后冻干，得到苯硼酸改性海藻酸钠。
39.以下所用季铵盐改性壳聚糖的制备包括以下步骤：
40.将壳聚糖以2wt％的浓度溶于醋酸的水溶液中，在55℃下完全溶解30min。接着按照缩水甘油基三甲基氯化铵(gtmac)与壳聚糖的氨基3:1加入gtmac 到上述混合物中，在55℃下搅拌反应18h。然后将反应产物以4500rpm的转速离心30min，去除未反应物质。将上清液倒入预冷的丙酮中，得到粗产物。将粗产物在去离子水中再溶解，然后在去离子水透析7d。最后通过冷冻干燥得到季铵盐改性的季铵盐改性壳聚糖。
41.以下所用苯硼酸改性透明质酸的制备包括以下步骤：
42.1)取5.33g 2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)于500ml去离子水中，得到浓度为 0.05mol/l的mes缓冲溶液；
43.2)将1g分子量为100万的透明质酸溶于200ml的mes缓冲溶液中得到浓度为0.5wt％的溶液，加入羧基活化剂活化30分钟，再加入适量的氨基苯硼酸，在避光条件下连续搅拌48h，将反应液在去离子水中透析3d后冻干，得到苯硼酸改性透明质酸。
44.实施例1
45.1)将4g碱溶液(为氨水、氢氧化钠、十二胺中的一种或几种组合)在40℃溶于100ml无水乙醇和10ml去离子水的混合物中。然后滴加20ml正硅酸乙酯(teos)继续搅拌30min。接着每隔30min依次加入2ml磷酸三乙酯(tep)、 10g四水合硝酸钙(cn)和10g硝酸镁(mn)。然后在40℃下再搅拌2h。用无水乙醇和去离子水离心洗涤三次，得到粗产物。最后将粗产物在650℃空气中烧结 2h去除dda、乙醇、反应单体等，得到含镁生物活性玻璃微球，参见图1所示的含镁生物活性玻璃微球的sem图，图中说明得到的含镁生物活性玻璃为规则的球型结构；
46.2)将20mg季铵盐改性壳聚糖和20mg苯硼酸改性透明质酸分别加入到1ml 去离子水中，然后在室温下搅拌24h，得到浓度为2wt％季铵盐改性壳聚糖和2wt％苯硼酸改性透明质酸溶液；
47.3)将5mg含镁生物活性玻璃微球分散在1ml苯硼酸改性透明质酸溶液(2wt％)中，然后将2wt％季铵盐改性壳聚糖快速加入上述体系，在室温下搅拌 30min，即可得到稳定的水凝胶。
48.参见图2所示的水凝胶构建的机理示意图，图中显示水凝胶主要是通过苯硼酸酯动态共价键和静电作用以及离子螯合动态非共价键形成。
49.参见图3所示的水凝胶的自适应性验证图，图中展示水凝胶能够在重力和表面张力的作用下适应填充不规则创面，以此来模拟糖尿病溃疡所出现的窦道，证实水凝胶具有自适应性。
50.参见图4所示的水凝胶的抗菌性验证图，图中说明水凝胶能够很好地杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，其抗菌性能源于季铵盐改性聚合物材料。
51.实施例2
52.1)将2g碱溶液(为氨水、氢氧化钠、十二胺中的一种或几种组合)在40℃溶20ml无水乙醇和100ml去离子水的混合物中。然后滴加5ml正硅酸乙酯 (teos)继续搅拌30min。接着每隔30min依次加入0.5ml磷酸三乙酯(tep)、2g 四水合硝酸钙(cn)和2g硝酸镁(mn)。然后在40℃下再搅拌12h。用无水乙醇和去离子水离心洗涤三次，得到粗产物。最后将粗产物在650℃空气中烧结8h去除dda、乙醇、反应单体等，得到含镁生物活性玻璃微球；
53.2)将50mg季铵盐改性壳聚糖和50mg苯硼酸改性透明质酸分别加入到1ml 去离子水中，然后在室温下搅拌24h，得到浓度为5wt％季铵盐改性壳聚糖和 5wt％苯硼酸改性透明质酸溶液；
54.3)将10mg含镁生物活性玻璃微球分散在1ml苯硼酸改性透明质酸溶液中，然后将季铵盐改性壳聚糖快速加入上述体系，在室温下搅拌30min，即可得到稳定的水凝胶。
55.实施例3
56.1)将10g碱溶液(为氨水、氢氧化钠、十二胺中的一种或几种组合)在40℃溶80ml无水乙醇和80ml去离子水的混合物中。然后滴加10ml正硅酸乙酯 (teos)继续搅拌30min。接着每隔30min依次加入1ml磷酸三乙酯(tep)、5g 四水合硝酸钙(cn)和5g硝酸镁(mn)。然后
在40℃下再搅拌4h。用无水乙醇和去离子水离心洗涤三次，得到粗产物。最后将粗产物在650℃空气中烧结5h去除dda、乙醇、反应单体等，得到含镁生物活性玻璃微球；
57.2)将10mg季铵盐改性壳聚糖和10mg苯硼酸改性透明质酸分别加入到1ml 去离子水中，然后在室温下搅拌24h，得到浓度为1wt％季铵盐改性壳聚糖和 1wt％苯硼酸改性透明质酸溶液；
58.3)将2mg含镁生物活性玻璃微球分散在1ml苯硼酸改性透明质酸溶液中，然后将季铵盐改性壳聚糖快速加入上述体系，在室温下搅拌30min，即可得到稳定的水凝胶。
59.参见图5所示的水凝胶的可注射性验证实物图，图中说明水凝胶具备良好的可注射性，且能够做成任意需要的形状，因而能够很好地适应各种不规则的创面。
60.参见图6所示的水凝胶的自愈合性验证图，图中展示了水凝胶具备一个优异的自愈合性能，这主要是因为水凝胶完全由动态键构成。
61.本发明的实施例仅仅是为清楚地说明本发明所举的例子，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的专业人员而言，在上述实施例的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。