一种抑制皮肤黑素瘤细胞增殖的迷迭香复方精油及其用途

1.本发明属于植物天然提取物的药理学领域，具体涉及一种迷迭香复方精油抑制黑素瘤细胞增殖的新用途。


背景技术：

2.黑素瘤(melanoma)是由黑色素细胞恶变而来的一种高度恶性肿瘤，已成为全世界发病率增长最快的恶性肿瘤之一。研究表明，近20年来中国皮肤恶性肿瘤特别是恶性黑素瘤，有明显增加的趋势。目前，精油作为一种风险较小的非侵入性治疗方法，可以潜在地提高癌症患者的生活质量，并减轻癌症患者接受化疗的症状，同时减轻副作用，改善预后状况。其中迷迭香精油已被证明具有良好的抗氧化、抗炎等活性，并且对乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌和宫颈癌细胞具有一定的抗增殖作用，能促进肝癌细胞的凋亡。
3.目前迷迭香精油的抗癌方面研究较少，不够深入，多为精油进行不同浓度处理细胞24小时或48小时后通过mtt法检测细胞活力，并计算其ic
50
。通过mtt法发现迷迭香精油对人乳腺癌细胞mda-mb-231,肺腺癌细胞a549，人非小细胞肺癌细胞h1299，人乳腺癌细胞mcf-7，宫颈癌hela，人t淋巴瘤细胞jurkat，人结肠癌细胞ht-29和人膀胱癌细胞t24具有抗增殖作用，并且可以增强肝癌细胞hepg2中bax的表达，减少其bcl-2的表达，诱导其凋亡，精油成分的差异也会对瘤细胞造成不同的影响。但目前迷迭香挥发物精油对于黑素瘤细胞的抑制作用尚无报道，仅有非挥发性成分迷迭香酸等对皮肤黑素瘤细胞生成的影响。此外，已报道的迷迭香精油抑癌技术中涉及的精油存在使用率低、化学型单一、效果不佳等不足，而采用不同化学型进行制备的复方精油更是少见。


技术实现要素：

4.针对以上问题，本发明提供一种迷迭香复方精油在抑制皮肤黑素瘤细胞增殖药物中的用途及其制备方法。本发明主要步骤包括：
①
迷迭香精油的提取；
②
精油成分分析；
③
复方精油制备；
④
复方精油成分分析；
⑤
结合黑素瘤细胞b16-f10和hacat的毒性实验，确定使用浓度范围。
5.本发明旨在通过不同化学型的迷迭香精油针对黑素瘤细胞的处理，以正常皮肤细胞hacat为对照，并通过细胞周期变化的分析，证明迷迭香精油抑制黑素瘤细胞增殖的作用，同时将不同化学型迷迭香精油制备成迷迭香复方精油，再次针对黑素瘤细胞的处理，以正常皮肤细胞hacat为对照，并通过细胞周期变化的分析，筛选出抗癌活性更强的迷迭香精油配方和浓度。
6.首先，本发明提供一种迷迭香复方精油在抑制皮肤黑素瘤细胞增殖药物中的用途及其制备方法。
7.在本发明所采用的技术方案如下：
8.1、一种迷迭香复方精油，各原料的质量份数如下：α-蒎烯型迷迭香精油25-30份、马鞭草烯酮型迷迭香精油10-15份和1,8-桉叶素型迷迭香精油5-8份。
9.其中，所述迷迭香精油为通过水蒸气蒸馏法提取迷迭香地上部分(包括迷迭香枝、叶、花)，其中化学型α-蒎烯型、马鞭草烯酮型和1,8-桉叶素型精油主要成分如下：
10.α-蒎烯型迷迭香精油主要成分为α-蒎烯28.32％、1,8-桉叶素20.48％、马鞭草烯酮14.21％和龙脑5.22％；
11.马鞭草烯酮型迷迭香精油主要成分为马鞭草烯酮24.46％、1,8-桉叶素10.48％、α-萜品醇7.12％和龙脑5.88％；
12.1,8-桉叶素型迷迭香精油主要成分为1,8-桉叶素25.46％、马鞭草烯酮13％、α-蒎烯11.96％和樟脑11.38％。
13.所形成的迷迭香复方精油的主要成分为α-蒎烯18.56％-20.59％、马鞭草烯酮16.70％-20.26％、1,8-桉叶素17.70％-19.06％和龙脑5.54％-5.99％。
14.在本发明另一个的技术方案中，将各原料按照质量份数混合后，将复方精油进行纳米化破碎、均质、分散、过筛，形成粒径在10-30nm的纳米颗粒。
15.将3种化学型精油和制备完成的复方精油分别溶解于二甲基亚砜(dmso)中，使用漩涡混合器以250-500转/min的速度涡旋均匀，无菌有机系滤膜过滤后，使用dmem培养基进行稀释，按体积比配置成浓度为0.01％～0.15％的细胞培养基。该培养基处理黑素瘤b16-f10细胞24小时后通过cck-8法测定细胞活力，并通过倒置显微镜观察细胞生长情况和形态。同时通过pi染色、75％乙醇固定后进行流式分析，观察对黑色素瘤细胞生长周期的影响，所述迷迭香复方精油效果最佳。
16.经多方查阅相关文献，尚未发现迷迭香精油在抑制皮肤黑色素瘤细胞增殖方面的报道。本发明的优势在于发现了迷迭香精油在抑制皮肤黑色素瘤细胞增殖方面具有显著的作用。尤其在迷迭香不同化学型精油进行质量份数组合后，制备的复方精油效果更为显著。复方精油在浓度为0.01％的细胞培养基中，皮肤黑色素瘤细胞b16-f10增殖出现明显抑制作用。在浓度达到0.07％时，抑制作用达到ic
50
，明显低于其他化学型。在浓度达到0.16％时，对正常细胞hacat同样出现了抑制作用。相对于其他化学型的迷迭香精油，该复方精油明显降低了对黑素瘤细胞b16-f10的抑制浓度，通过对正常细胞的hacat毒性的ic
50
对比，增大了迷迭香精油的使用浓度范围。同时通过细胞生长情况和形态的观察，发现复合精油通过抑制细胞dna合成，造成g1/g0的周期阻滞，达到抑制b16-f10的增殖作用。本发明虽为精油对体外培养的黑色素瘤细胞b16-f10的抑制作用，但为治疗皮肤黑素瘤新药物的开发奠定了基础。
附图说明
17.图1所示为迷迭香复方精油的精油成分质谱图
18.图2所示为迷迭香复方精油对黑素瘤细胞b16-f10的活力影响。ns表示p＞0.05，与对照相比，没有统计学差异；*表示0.01＜p＜0.05，与对照相比，差异显著；**表示p＜0.01，与对照相比，差异极为显著。
19.图3所示为迷迭香复方精油对黑素瘤细胞b16-f10的形态和数量影响。
20.图4所示为实施例三迷迭香复方精油对黑素瘤细胞b16-f10的生长周期的影响。ns表示p＞0.05，与对照相比，没有统计学差异；*表示0.01＜p＜0.05，与对照相比，差异显著；**表示p＜0.01，与对照相比，差异极为显著。
21.图5所示为实施例4迷迭香复方精油对黑素瘤细胞b16-f10的生长周期的影响。ns表示p＞0.05，与对照相比，没有统计学差异；*表示0.01＜p＜0.05，与对照相比，差异显著；**表示p＜0.01，与对照相比，差异极为显著。
具体实施方式
22.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
23.实验材料：3种化学型的迷迭香精油；
24.仪器设备：clevenger型蒸馏装置、气相色谱质谱联用仪、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、细胞培养箱、电子显微镜、荧光倒置显微镜、多功能酶标仪、流式细胞仪等；
25.试验方法：将3种化学型迷迭香材料阴干，通过水蒸气蒸馏法提取精油，对精油进行气相色谱质谱联合分析化学成分；按照α-蒎烯型25-30份、马鞭草烯酮型10-15份和1,8-桉叶素型5-8份的质量份数进行混合；将复方精油进行纳米化破碎、均质、分散、过筛，形成粒径在10-30nm的纳米颗粒。
26.将制备完成的复方精油和3种化学型迷迭香精油分别设置0.01％、0.05％、0.10％、0.50％、1.00％、2.50％、5.00％的浓度(v/v)对小鼠黑素瘤细胞b16-f10和皮肤正常细胞hacat进行处理24小时后测定细胞活力，计算4种精油对黑素瘤细胞和正常细胞hacat的ic
50
；将ic
50
最低的迷迭香精油处理黑素瘤细胞，检测瘤细胞的周期变化。
27.细胞培养条件为：温度为25
±
1℃，二氧化碳浓度为5％。
28.实施例1 4种迷迭香精油的成分
29.于2020年8月下旬在北京采收迷迭香25-40cm长的枝条，阴凉干燥一个月后对叶、茎混合的材料通过clevenger型装置进行水蒸气蒸馏，提取精油。
30.对3种迷迭香精油通过gc-ms分析其挥发性成分。通过气相色谱质谱联用仪分离样品成分，同时检测正构烷烃c
7-c
40
的保留时间，将样品组分的保留时间代入kovats保留指数公式计算组分程序升温保留指数的实测值。通过检索nist14标准质谱图库，使用ms软件进行谱库搜索，依据保留指数和质谱峰图的相似度来鉴定组分的结构和名称，采用面积归一法确定各个组分的相对百分含量。分析(表1)发现，3种精油成分种类和含量都呈现不同的趋势：，α-蒎烯型迷迭香精油主要成分为α-蒎烯28.32％、1,8-桉叶素20.48％、马鞭草烯酮14.21％和龙脑5.22％；马鞭草烯酮型迷迭香精油主要成分为马鞭草烯酮24.46％、1,8-桉叶素10.48％、α-萜品醇7.12％和龙脑5.88％；1,8-桉叶素型迷迭香精油主要成分为1,8-桉叶素25.46％、马鞭草烯酮13％、α-蒎烯11.96％和樟脑11.38％。
31.将3种化学型的迷迭香精油按照α-蒎烯型28份、马鞭草烯酮型15份和1,8-桉叶素型7份进行配制形成复方精油，并将复方精油进行精油成分分析并鉴定，采用面积归一法确定各个组分的相对百分含量(表1)，复方精油的成分质谱图见附图1。其中主要成分α-蒎烯19.22％、1,8-桉叶素18.25％、马鞭草烯酮18.20％和龙脑5.58％。
32.表1迷迭香4种迷迭香精油的成分种类和相对含量(％)
33.[0034][0035]
注释：ria表示在hp-5ms毛细管柱上通过正构烷烃c
7-c
40
保留时间的测定并计算的程序升温保留指数；rib是相关文献和nist14标准数据库里该成分已报道的保留指数；
“‑”
表示该成分未检测到；“t”表示该成分相对含量低于0.10％。
[0036]
实施例2 4种迷迭香精油对黑素瘤细胞b16-f10和人表皮角质形成细胞hacat的ic
50
[0037]
将α-蒎烯型等3种化学型精油及实施例1中制备完成的复合精油按体积比分别设置0.01％、0.05％、0.10％、0.50％、1.00％、2.50％、5.00％的浓度(v/v)处理黑素瘤b16-f10细胞24小时后通过cck-8法测定细胞活力，并计算4种精油的ic
50
。ic
50
越小，意味着抑制b16-f10增殖的能力越强。结果表明，根据ic
50
从小到大分别为：复方精油＜马鞭草烯酮型＜1,8-桉叶素型＜α-蒎烯型，其中复方精油型的精油ic
50
最低，效果最好，为0.07
±
0.01％；其次是马鞭草烯酮型ic
50
为0.10
±
0.003％；1,8-桉叶素型ic
50
为0.23
±
0.02％；ic
50
最高的是α-蒎烯型，达到了0.29
±
0.02％(表2)。通过检测迷迭香精油对人正常表皮角质形成细胞hacat的ic
50
，发现复合精油型和马鞭草烯酮型精油对b16-f10的毒性显著大于hacat，其中
复合精油对b16-f10的ic
50
是hacat的0.44倍，明显低于其他3种化学型精油(精油对hacat的毒性ic
50
与b16-f10 ic
50
差别越大，精油的使用浓度范围越大)。另外马鞭草烯酮型精油对b16-f10的ic
50
是hacat的0.77倍，而其余2种化学型精油对hacat的ic
50
的浓度都显著大于对b16-f10的浓度，不建议使用。
[0038]
表2 4种迷迭香精油对b16-f10和hacat的ic
50
(v/v，％)
[0039][0040]
实施例3迷迭香复合精油对黑素瘤细胞b16-f10的毒性实验及对生长周期的影响
[0041]
选择实施例1中制备好的迷迭香复合精油，设置0.010％、0.025％、0.050％、0.075％、和0.10％共5个浓度(v/v)处理b16-f10细胞24小时后，通过cck-8法检测细胞活力，并通过倒置显微镜观察细胞生长情况和形态。结果发现(图2)，复合精油对b16-f10的细胞毒性呈浓度依赖型，浓度越高，细胞毒性越大，对黑素瘤细胞的生长情况和形态影响更严重(图3)，0.075％的处理让细胞活力下降到45.90％。
[0042]
b16-f10细胞经过迷迭香复合精油处理24小时后，通过pi染色、75％乙醇固定后进行流式分析。结果如图4所示，空白处理组中g1/g0期细胞占62.57％，s期占34.22％，g2/m期占3.23％；0.010％和0.025％的精油处理下，g2/m期为0，分别让s期细胞减少了10.10％和3.25％，g1/g0期增加了13.33％和6.48％，说明这两个浓度抑制了b16-f10的dna合成，导致g1/g0期阻滞；0.050％和0.075％的处理让b16-f10的g1/g0期分别增加到了85.27％和93.39％，s期分别减少到了12.82％和5.43％，进一步说明复合精油处理通过抑制dna合成，造成g1/g0的周期阻滞，显著抑制b16-f10的增殖。
[0043]
实施例4迷迭香复方精油及其抑制皮肤黑素瘤细胞增殖中的用途
[0044]
将实施例1中提取的3种迷迭香精油按照α-蒎烯型30份、马鞭草烯酮型12份和1,8-桉叶素型8份进行配制形成复方精油，并将复方精油进行精油成分分析并鉴定，采用面积归一法确定各个组分的相对百分含量。其中主要成分α-蒎烯20.59％、马鞭草烯酮16.70％、1,8-桉叶素18.46％和龙脑5.54％。
[0045]
将制备完成的复合精油分别设置0.01％、0.05％、0.10％、0.50％、1.00％、2.50％、5.00％的浓度(v/v)处理黑素瘤b16-f10细胞24小时后通过cck-8法测定细胞活力，并计算ic
50
，通过检测复合精油对人正常表皮角质形成细胞hacat的ic
50
。结果发现复合型精油对b16-f10和hacat的ic
50
分别为0.07
±
0.02％、0.17
±
0.01％。对b16-f10的ic
50
明显高于人正常表皮角质形成细胞的ic
50
，符合预期结果。
[0046]
选择制备好的迷迭香复合精油，设置0.010％、0.025％、0.050％、0.075％、和0.10％共5个浓度(v/v)处理b16-f10细胞24小时后，通过cck-8法检测细胞活力，并通过倒置显微镜观察细胞生长情况和形态。结果发现，复合精油对b16-f10的细胞毒性呈浓度依赖型，浓度越高，细胞毒性越大，对黑色素瘤细胞的生长情况和形态影响更严重；0.075％的处理让细胞活力下降到46.55％。
[0047]
b16-f10细胞经过迷迭香复合精油处理24小时后，通过pi染色、75％乙醇固定后进行流式分析。结果如图5所示，空白处理组中g1/g0期细胞占62.57％，s期占34.22％，g2/m期
占3.23％；0.010％和0.025％的精油处理下，g2/m期为0，分别让s期细胞减少了9.55％和4.25％，g1/g0期增加了12.78％和7.48％，说明这两个浓度抑制了b16-f10的dna合成，导致g1/g0期阻滞；0.050％和0.075％的处理让b16-f10的g1/g0期分别增加到了86.12％和94.27％，s期分别减少到了11.35％和4.69％，进一步说明复合精油处理通过抑制dna合成，造成g1/g0的周期阻滞，显著抑制b16-f10的增殖。
[0048]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。