一种分步组装式软骨-骨多孔仿生支架的制作方法

1.本实用新型涉及生物医学组织工程领域，尤其涉及一种分步组装式软骨-骨多孔仿生支架。


背景技术：

2.由创伤、疾病、退变等原因造成的关节部位软骨-骨复合损伤是临床常见疾病，在全球范围内呈逐年增长趋势。软骨-骨复合缺损的修复具有重大临床需求，目前临床常用的治疗方法包括自体骨软骨移植、异体骨软骨移植以及人工关节置换术等，但却存在供体来源受限、异物排斥、无生物学功能等弊端，治疗效果欠佳，亟需研究理想的永久性修复重建措施。
3.组织工程与再生医学技术的迅速发展，为关节骨软骨复合损伤的再生修复提供了新的解决方案。组织工程学是利用生命科学和工程学的基本原理和方法，体外构建所需的组织，用于修复或替代因创伤、疾病而丧失功能的组织或器官。利用仿生支架诱导原位软骨-骨复合组织再生有望成为关节功能重建重要手段，但目前该领域尚无重大突破。其关键难点在于如何完成软骨-骨复合支架的制备、微环境的仿生和软骨-骨的分步诱导，实现体外生物关节的构建。
4.综上所述，本领域迫切需要开发一种适用于软骨-骨复合修复的仿生支架。


技术实现要素：

5.本实用新型提供了一种适用于软骨-骨复合修复的仿生支架。
6.本实用新型第一方面，提供了一种软骨-骨复合物，所述软骨-骨复合体包括软骨相和硬骨相，其中所述的软骨相包括第一固相载体以及负载于所述第一固相载体的软骨细胞层，所述软骨细胞层含有软骨细胞或含软骨细胞的颗粒；
7.所述的硬骨相包括第二固相载体以及负载于所述第二固相载体的硬骨细胞层，所述硬骨细胞层含有形成硬骨层的种子细胞或含所述种子细胞的颗粒；
8.所述的硬骨相包括第二固相载体以及负载于所述第二固相载体的用于形成硬骨的种子细胞或含所述种子细胞的颗粒；
9.所述的软骨相设有第一结构，而所述的硬骨相设有第二结构，所述的第一结构和第二结构以卡扣方式将软骨相和硬骨相组装形成软骨-骨复合物。
10.在另一优选例中，所述的复合物包括将所述软骨细胞或含软骨细胞的颗粒接种于所述第一固相载体并经成软骨培养后所形成的复合物；和将所述形成硬骨的种子细胞或含所述种子细胞的颗粒接种于所述第二固相载体并经成骨培养后所形成的复合物(在所述复合物中，软骨细胞负载于载体并与载体形成更为紧密的一体结构；和所述种子细胞负载于载体并与载体形成更为紧密的一体结构)。
11.在另一优选例中，所述的复合物包括将所述软骨细胞或含软骨细胞的颗粒接种于所述第一固相载体，但未经成软骨培养后所形成的复合物，和将所述形成硬骨的种子细胞
或含所述种子细胞的颗粒接种于所述第二固相载体，但未经成骨培养后所形成的复合物。
12.在另一优选例中，所述的种子细胞选自：骨髓间充质干细胞(bmsc)、软骨细胞、或其组合。
13.在另一优选例中，所述软骨细胞选自：弹性软骨、透明软骨、纤维软骨组织、或其组合。
14.在另一优选例中，所述软骨细胞选自：括耳软骨细胞、关节软骨细胞、肋软骨细胞、肩胛软骨细胞、半月板细胞、或其组合。
15.在另一优选例中，所述含软骨细胞的颗粒包含凝胶软骨或软骨膜片颗粒。
16.在另一优选例中，所述的凝胶软骨包括软骨细胞构成的细胞群以及软骨细胞所分泌的细胞外基质，其中所述细胞外基质包裹所述的细胞群，并且所述凝胶软骨呈凝胶态，并且软骨细胞的密度为至少1.0
×
108个/ml或1.0
×
108个/g。
17.在另一优选例中，所述的凝胶软骨是用软骨细胞经凝胶化培养而制备的。
18.在另一优选例中，所述凝胶软骨的粘附率≥90％。
19.在另一优选例中，所述凝胶软骨中，软骨细胞的浓度为1.0
×
10
8-10
×
108个/ml，较佳地1.5-5
×
108个/ml。
20.在另一优选例中，所述凝胶软骨是凝胶化培养2-5天得到的，较佳地，为2.5-4天。
21.在另一优选例中，所述软骨细胞来自哺乳动物。
22.在另一优选例中，所述软骨细胞选自耳软骨细胞、肋软骨或其组合。
23.在另一优选例中，所述耳软骨细胞来自自体或同种异体；优选自体人耳软骨细胞。
24.在另一优选例中，所述凝胶软骨的制备包括如下步骤：
25.(1)提供一分离的软骨细胞,进行原代及传代培养，从而获得经传代培养的软骨细胞；
26.(2)对步骤(1)获得的经传代培养的软骨细胞，在凝胶化培养基中诱导培养，从而获得诱导的凝胶软骨。
27.在另一优选例中，步骤(2)中，经传代培养的软骨细胞以层叠接种的方式接种于培养容器中。
28.在另一优选例中，步骤(2)中，所述软骨细胞传代至2-5代。
29.在另一优选例中，步骤(2)中，所述培养基中含有或不含有血清。
30.在另一优选例中，步骤(2)中，所述培养基中含有5-15％(v/v)的血清。
31.在另一优选例中，所述血清选自胎牛血清。
32.在另一优选例中，步骤(2)中，所述凝胶化培养基为dmem培养基。
33.在另一优选例中，步骤(2)中，所述dmem培养基含有4-5wt％葡萄糖，5-20％fbs(v/v)，50-150u/ml的青链霉素。
34.在另一优选例中，步骤(2)中，所述诱导培养的时间为2-5天；较佳地，为2.5-4天。
35.在另一优选例中，所述软骨膜片颗粒包括软骨细胞构成的细胞群以及软骨细胞所分泌的细胞外基质，其中所述细胞外基质包裹所述的细胞群，并且所述软骨颗粒是由薄片状的软骨膜片剪碎制得，其中软骨细胞的密度为至少1.0
×
108个/ml或1.0
×
108个/g。
36.在另一优选例中，所述软骨膜片中，软骨细胞的浓度为1.0
×
108个/ml-10
×
108个/ml，较佳地1.5-5
×
108个/ml。
37.在另一优选例中，所述的软骨膜片是用软骨细胞经凝胶化培养而制备的。
38.在另一优选例中，所述软骨膜片是凝胶化培养6-30天，较佳地7-20天，最佳地10-15天得到的。
39.在另一优选例中，所述的凝胶化培养是用凝胶化培养基进行的体外培养。
40.在另一优选例中，所述的凝胶化培养基含有以下组分：含4-5wt％葡萄糖的高糖dmem培养基、10％fbs(v/v)和100u/ml青-链霉素。
41.在另一优选例中，所述软骨膜片的厚度为0.2-0.25mm。
42.在另一优选例中，所述软骨膜片颗粒的平均体积为0.2μl。
43.在另一优选例中，所述软骨膜片颗粒的表面积为0.05-10mm2，优选地，为1-5mm2，更优选地，平均面积为1mm2。
44.在另一优选例中，所述的第一结构设置于所述的第一固相载体。
45.在另一优选例中，所述的第二结构设置于所述的第二固相载体。
46.在另一优选例中，所述的第一结构和第二结构以卡扣方式将软骨相和硬骨相组装形成软骨-骨复合物。
47.在另一优选例中，所述软骨相通过在软骨相固相载体上接种软骨细胞或含软骨细胞的颗粒后，成软骨诱导培养而成。
48.在另一优选例中，所述硬骨相通过在硬骨相固相载体上接种形成硬骨的种子细胞或含所述种子细胞的颗粒后，成骨诱导培养而成。
49.在另一优选例中，所述第一结构和第二结构有一个或多个。
50.在另一优选例中，所述第一结构和第二结构的数量选自1-5之间的正整数。
51.在另一优选例中，所述第一结构位于第一固相载体底端、第二结构位于第二固相载体顶端；或第一结构位于第一固相载体顶端、第二结构位于第二固相载体底端。
52.在另一优选例中，所述第一固相载体和/或第二固相载体包含多孔生物相容性材料。
53.在另一优选例中，所述多孔生物相容性材料选自下组：pcl、pga、同种异体骨修复材料、异种骨修复材料、脱钙骨基质、脱细胞基质。
54.在另一优选例中，所述多孔生物相容性材料还可以负载有明胶、胶原、丝素、水凝胶或其组合。
55.在另一优选例中，所述第一固相载体包含脱细胞基质，较佳地，为软骨脱细胞基质。
56.在另一优选例中，所述第二固相载体包含脱钙骨基质。
57.在另一优选例中，所述复合物为圆柱体，所述圆柱体的直径为4～8mm，所述圆柱体的高度为4～6mm；
58.所述软骨相和所述硬骨相的高度比为1：(1～1.5)，优选1：1.2。
59.本实用新型第二方面，提供了一种软骨-骨复合物的制备方法包括如下步骤：
60.(a)软骨-骨内核网格框架制备：提供一分体式软骨相和硬骨相内核网格框架，所述软骨相内核网格框架带卡扣突起结构，硬骨相内核网格框架带有相应卡扣凹陷结构；
61.(b)软骨相固相载体构建：提供一软骨脱细胞基质，与辅剂混合后灌注软骨相内核网格框架中；冷冻干燥获得卡扣突起结构的软骨相固相载体；
62.(c)硬骨相固相载体构建：提供一脱钙骨基质，与辅剂混合后灌注硬骨相内核网格框架中；冷冻干燥获得卡扣凹陷结构的硬骨相固相载体；
63.(d)软骨相构建：将(b)中所述软骨相固相载体体外接种软骨细胞，体外应用成软骨诱导培养基诱导，构建软骨相；
64.(e)硬骨相构建：将(c)中所述硬骨相固相载体体外接种骨髓间充质干细胞，体外应用成骨诱导培养基诱导培养，构建硬骨相；
65.(f)软骨-骨复合物组装：将(d)和(e)中获得的软骨相和硬骨相，通过卡扣结构组装软骨相、硬骨相构建软骨-骨复合体。
66.在另一优选例中，所述辅剂选自明胶或胶原。
67.在另一优选例中，所述明胶的浓度选自1-10％(重量/体积)。
68.在另一优选例中，所述冷冻干燥的时间选自12-24小时。
69.在另一优选例中，所述冷冻干燥的温度为-20-0℃。
70.在另一优选例中，步骤(d)中，所述软骨细胞的细胞悬液密度选自1
×
10
7-8
×
108细胞/ml；较佳地，5
×
10
7-1
×
108细胞/ml；更佳地，7
×
10
7-9
×
107细胞/ml。
71.在另一优选例中，步骤(e)中，所述骨髓间充质干细胞的细胞悬液密度选自1
×
10
7-8
×
108细胞/ml；较佳地，5
×
10
7-1
×
108细胞/ml；更佳地，2
×
10
7-3
×
107细胞/ml。
72.在另一优选例中，步骤(a)中，所述软骨相和硬骨相内核网格框架基于软骨相和硬骨相三维数字模型经三维打印pcl基材制备。
73.在另一优选例中，步骤(b)中，还包括交联处理，包括：
74.(b1)将灌注所述含软骨脱细胞基质的混悬液的软骨相内核网格框架，真空冷冻干燥，得到软骨脱细胞基质的干燥物；
75.(b2)将(b1)中得到的干燥物浸入化学交联剂中，4℃交联处理后，去除残余的化学交联剂；
76.(b3)真空冷冻干燥后获得卡扣突起结构的软骨相固相载体。
77.在另一优选例中，所述交联使用的试剂选自：(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、戊二醛、京尼平、或其组合。
78.在另一优选例中，所述交联使用的试剂选自edc和/或nhs。
79.在另一优选例中，所述edc的浓度选自0.2％-1％(重量/体积)。
80.在另一优选例中，所述nhs的浓度选自0.2％-1％(重量/体积)。
81.在另一优选例中，所述交联处理的时间选自18-36小时。
82.在另一优选例中，步骤(b1)中，所述混悬液中软骨脱细胞基质的含量为1-10％(重量/体积)。
83.在另一优选例中，步骤(c)中，还包括交联处理，包括：
84.(c1)将灌注所述含脱钙骨基质的混悬液的硬骨相内核网格框架，真空冷冻干燥，得到脱钙骨基质的干燥物；
85.(c2)将(c1)中得到的干燥物浸入化学交联剂中，4℃交联处理后，去除残余的化学交联剂；
86.(c3)真空冷冻干燥后，获得卡扣突起结构的硬骨相固相载体。
87.在另一优选例中，步骤(c1)中，所述混悬液中脱钙骨基质的含量为1-10％(重量/
体积)。
88.本实用新型第三方面，提供了一种软骨-骨复合物的用途，所述软骨-骨复合物可用于制备修复软骨和/或硬组织缺损的医用产品。
89.在另一优选例中，所述软骨和/或硬组织缺损选自：关节软骨缺损、唇腭裂畸形、颌面部硬组织缺损或其组合。
90.在另一优选例中，所述组织工程软骨复合物包含组织工程软骨移植物移植物。
91.在另一优选例中，所述组织工程软骨移植物的形状与人体需要移植软骨的缺损部位形状相符。
92.在另一优选例中，所述缺损部位选自关节软骨缺损、唇腭裂畸形、颌面部硬组织或其组合。
93.在另一优选例中，所述缺损部位选自膝关节缺损、颞下颌关节缺损。
94.应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
95.图1为本实用新型的软骨-骨复合物的结构示意图。其中，a图中，由上至下包括：
96.软骨细胞层1；
97.第一固相载体2；
98.第一结构3a；
99.第二结构4a；
100.第二固相载体5；
101.硬骨细胞层6，其中，第一结构3a与第二结构4a以卡扣方式连接，卡扣结构4a凹陷在第二固相载体5内部。
102.b图中，由上至下包括：
103.软骨细胞层1；
104.第一固相载体2；
105.第一结构3b；
106.第二结构4b；
107.第二固相载体5；
108.硬骨细胞层6，其中，第一结构3b与第二结构4b以卡扣方式连接，卡扣结构3b凹陷在第一固相载体2内部。
109.第一固相载体2上设有软骨细胞层1，第二固相载体5上设有硬骨细胞层6，第一固相载体2与软骨细胞层1构成软骨相，第二固相载体5与硬骨细胞层6构成硬骨相。
具体实施方式
110.本实用新型发明人通过广泛而深入地研究，设计制备了一种分步组装式软骨-骨多孔仿生支架。本实用新型的软骨-骨多孔仿生支架实现了软骨和骨一体化的生物关节在体外的同时构建。具体地，本实用新型发明人设计了软骨相底端和硬骨相顶端带有卡扣或
榫卯结构的分步组装式软骨-骨多孔仿生支架，在体外于软骨相和硬骨相支架上接种和培养细胞，构建成熟的软骨相和硬骨相后，通过卡扣或榫卯结构组装成软骨-骨多孔仿生体复合物，用于修复软骨-骨复合缺损。在此基础上完成本实用新型。
111.术语
112.如本文所用，“本实用新型的软骨-骨复合物”、“本实用新型的软骨-骨复合体”、“本实用新型的软骨-骨仿生体”“软骨-骨复合物移植物”可互换使用，皆指本实用新型第一方面所制备的软骨-骨复合物。
113.如本文所用，术语“凝胶化培养”指提供特殊的生化环境，使具有软骨分化潜能的细胞表达形成质地粘稠、粒径显著增加的凝胶状软骨细胞，具备成软骨能力的过程。
114.如本文所用，术语“软骨(干)细胞”指软骨细胞、软骨干细胞或其组合。
115.脱钙骨基质
116.脱钙骨基质(dbm)是由同种异体骨或异种骨经脱钙处理，能降低免疫原性的骨移植材料。脱钙程度不同对应的机械强度也不同。具有良好的生物学特性、骨诱导性和骨传导性，可生物降解，促进新骨形成及骨组织矿化，加速骨愈合，可以单独或与自体骨、其它生物材料、生长因子联合有效修复骨损伤，是比较理想的骨组织工程支架材料。
117.软骨凝胶及其制备
118.如本文所用，“凝胶软骨”、“软骨凝胶”、“凝胶态软骨”、“凝胶状软骨”、“本实用新型的软骨凝胶”或“本实用新型的凝胶软骨”可互换使用，皆指本实用新型的呈凝胶状态的软骨(干)细胞，尤其是将特定浓度的软骨细胞接种于和/或铺于平坦或基本平坦的培养表面，使得被接种的软骨细胞形成层叠结构，并在合适的凝胶化培养条件下培养具有层叠结构的软骨细胞，从而形成凝胶状软骨培养物。
119.本实用新型的凝胶软骨是不同于游离的软骨细胞、离心沉淀的软骨细胞和软骨团块(pellet)的新型软骨。本实用新型的凝胶软骨可视为介于游离的软骨细胞和致密的软骨团块之间的一种特定形态的软骨。本实用新型凝胶软骨，由于在凝胶化培养过程中，软骨细胞不仅与平面(x-y平面)上相邻细胞存在接触和/或相互作用，而且还与其上方和/或下方和/或侧上方或下方等多方向的相邻软骨细胞存在接触和/或相互作用，从而促使软骨细胞分泌和形成更多的细胞外基质，从而将将凝胶化培养的软骨细胞包裹于具有一定粘性的细胞外基质中，从而使得本实用新型的凝胶软骨既具有紧密联系，而具有一定的粘性和流动性，从而使得本实用新型的凝胶软骨更适合接种和负载于各种不同的载体材料(尤其是多孔的载体材料)上，从而形成用于修复软骨的复合物。
120.此外，本实用新型的凝胶软骨一方面具有凝胶状态，另一方面具有异乎寻常高的细胞密度(通常至少1.0
×
108个/ml或更高，如1.0
×
10
8-10
×
108个/ml)，因此，特别适合制备修复各类软骨的移植物，或用于软骨移植或软骨修复手术。
121.在本实用新型中，修复软骨的复合物包括将本实用新型的凝胶软骨负载于载体材料(尤其是3d打印多孔框架材料)所形成的未经成软骨培养的复合物，也包括将本实用新型的凝胶软骨负载于载体材料(尤其是3d打印多孔框架材料)并经成软骨培养所形成的复合物。
122.在本实用新型中，适合用于移植于人体或动物体的复合物就是本实用新型组织工程软骨移植物。
123.优选地，在本实用新型中，在凝胶化培养条件系下，体外培养一段时间t1，从而形成了凝胶软骨。优选地，所述的t1为2.5-5.5天，较佳地3-5天。
124.在本实用新型中，一个特征是层叠接种，即将特定密度的软骨细胞接种于培养容器后，接种的软骨细胞会通过例如沉积作用形成互相层叠的多层软骨细胞群(即具有层叠结构的软骨细胞群)。典型地，以培养皿(或培养容器)的培养面积计算，并设铺设单层细胞的汇合度为100％，则本实用新型的层叠接种的细胞数量s1是对于100％汇合度的细胞数量s0的n倍(即s1/s0＝n)，其中所述的n为1.5-20，较佳地2-10，更佳地2.5-5。
125.软骨膜片及其制备
126.本实用新型的“软骨膜片”是在本实用新型所述的“软骨凝胶”的制备基础上，通过延长凝胶化培养时间所制备得到的。即，在本实用新型中，在凝胶化培养条件下，将接种于和/或铺于平坦或基本平坦的培养表面的耳软骨细胞体外培养一段时间t2，从而形成了软骨膜片。优选地，所述的t2为6-30天，较佳地7-20天，最佳地10-15天。
127.本实用新型的软骨膜片一方面具有异乎寻常高的细胞密度(通常至少1.0
×
108个/ml或更高，如1.0
×
108个-10
×
108个/ml)，另一方面它的厚度薄(仅有0.2-0.25mm)并且韧性佳，可被剪碎为平均体积0.2μl的“软骨膜片颗粒”，通过简单离心的方式填充于多孔框架结构中，因此，特别适合制备修复各类软骨的移植物，或用于软骨移植或软骨修复手术。
128.在本实用新型中，修复软骨的复合物包括将本实用新型的软骨膜片颗粒负载于载体材料(尤其是3d打印多孔框架结构)所形成的未经成软骨培养的复合物，也包括将本实用新型的软骨膜片颗粒负载于载体材料(尤其是3d打印多孔框架结构)并经成软骨培养所形成的复合物。
129.在本实用新型中，适合用于移植于人体或动物体的复合物就是本实用新型的耳软骨组织工程复合物，即将本实用新型的软骨膜片颗粒负载于载体材料(尤其是多孔框架结构)并经成软骨培养所形成的复合物。
130.如本文所用，“特定浓度”或“特定密度”是指在3.5cm的培养皿(例如，六孔板中的一个孔)中，接种1.0
×
10
7-2.0
×
107个细胞，较佳地，为1.5
×
107个细胞。经凝胶化培养不同的时间，最终形成所含软骨细胞密度为1.0
×
108个-10.0
×
108个/ml的耳软骨凝胶或所含软骨细胞密度为1.0
×
108个-10.0
×
108个/ml的软骨膜片。
131.在另一优选例中，所述的凝胶化培养条件为：接种特定密度的软骨细胞，使用凝胶化培养基培养，所述凝胶化培养基为含10％胎牛血清及100u/ml青-链霉素的高糖(4-5wt％葡萄糖)dmem培养基。
132.软骨和软骨细胞
133.软骨即软骨组织，由软骨细胞和细胞间质组成。软骨内的基质呈凝胶状态，具有较大韧性。软骨是以支持作用为主的结缔组织。软骨内不含血管和淋巴管，营养物由软骨膜内的血管中渗透到细胞间质中，再营养骨细胞。
134.根据细胞间质的不同可把软骨分为3种，即透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。透明软骨的基质是由胶原纤维、原纤维和周围无定形的基质组成。在胚胎时期有临时支架作用，后来这种作用被骨代替。成人的透明软骨主要分布在气管和支气管壁中、肋骨的胸骨端和骨的表面(关节软骨)。弹性软骨的基质中除了胶原纤维还有弹性纤维，这种软骨弹性较大，主要分布在耳廓、外耳道壁、耳咽管和会厌、喉部等处。纤维软骨基质中有成束的胶原纤维
平行或交叉排列，较坚韧。分布在椎间盘、关节盂、关节盘以及一些腱、韧带等处，以增强运动的灵活性和保护、支持等作用。
135.如本文所用，用于修复关节软骨的组织工程复合物中所用的软骨细胞，不限于来自关节软骨的软骨细胞。较佳地，可以选自来源于透明软骨(例如关节软骨)、弹性软骨或纤维软骨(例如，耳软骨)的软骨细胞。
136.特别地，本实用新型中用于接种的软骨细胞，可以以“凝胶化培养”的方式预培养，获得软骨凝胶或软骨膜片颗粒的状态，再接种支架材料进行体外的成软骨培养，获得体外构建的软骨相。
137.软骨-骨复合物及其制备方法：
138.本实用新型的软骨-骨复合物包含软骨相和硬骨相，所述的软骨相底端和硬骨相顶端带有卡扣或榫卯结构。具体地，所述的软骨相设有第一结构，而所述的硬骨相设有第二结构，所述的第一结构和第二结构以卡扣方式将软骨相和硬骨相组装形成软骨-骨复合物。在具体实施例中，通过在体外于软骨相和硬骨相支架上接种和培养细胞，构建成熟的软骨相和硬骨相后，通过卡扣或榫卯结构组装成软骨-骨复合物。
139.在本实用新型的一个具体实施例中，构建好的软骨-骨复合物的为圆柱体，所述圆柱体的直径为4～8mm；所述圆柱体的高度为4～6mm。所述软骨相和所述硬骨相的高度比为1：(0.5～1.5)，优选1：1.2。
140.本实用新型的软骨细胞层的高度为5～100μm；硬骨细胞层的高度为5～100μm；
141.本实用新型中的软骨相和硬骨相通过卡扣方式连接。应理解，可以设置一对或多对卡扣结构连接所述的软骨相和硬骨相。例如，设置1、2、3、4、5对。较佳地，设置1对卡扣结构连接所述的软骨相和硬骨相。
142.在本实用新型的一个具体实施例中，在软骨相底部设有第一结构3a；在硬骨相顶端设有第二结构4a。其中，第一结构3a与第二结构4a以卡扣方式连接，第二结构4a凹陷在第二固相载体5(硬骨相)内部。第一结构3a设置在软骨相底面。
143.在本实用新型的一个具体实施例中，在软骨相底部设有第一结构3b；在硬骨相顶端设有第二结构4b。其中，第一结构3b与第二结构4b以卡扣方式连接，卡扣结构3b凹陷在第一固相载体2(软骨相)内部。第一结构4b设置在软骨相顶面。
144.由于软骨相和硬骨相体外构建时所需的诱导条件不同，分体式支架可以实现软骨相和硬骨相的单独培养以满足不同的诱导条件要求。此外，组装完成的软骨-骨复合物可以进行体外软骨-骨的共培养，实现软骨-骨材料的界面更佳接近自然状态下的生长。
145.本实用新型提供了一种软骨-骨复合物的制备方法，包含如下步骤：
146.(1)软骨-骨内核网格框架制备；
147.(2)软骨相固相载体构建；
148.(3)硬骨相固相载体构建；
149.(4)软骨相构建；
150.(5)硬骨相构建；
151.(6)软骨-骨复合物组装。
152.应用
153.根据缺损面积、形状、缺损深度等不同损伤程度以及患者自身情况及需求个体化
定制缺损修复材料。
154.软骨相使用成软骨诱导液体外培养2-8周；硬骨相使用成骨诱导液体外培养2-4周。由于软骨相和硬骨相体外构建时所需的诱导时间不同，分体式支架可以实现软骨相和硬骨相的单独培养以满足不同诱导时间要求。此外，软骨相、硬骨相组装成类似于“钢筋-混凝土”式的结构多孔仿生支架，解决了天然材料不能3d打印精确控制形态的难题，又更大限度的保持了其生物学活性和软骨及骨基质微环境，为进一步添加各类生物活性因子提升复合支架的调控功能提供了可能。
155.粘附率测定方法
156.本实用新型中的粘附率测定方法的具体步骤如下：
157.检测所接种样品(细胞悬液或软骨凝胶)的dna定量a1；检测接种后复合物(细胞-支架复合物或软骨凝胶-支架复合物)培养24小时后的dna定量a2；粘附率为a2/a1*100％。
158.所述粘附率的测定方法包括以下步骤：
159.取接种样品(例如软骨凝胶或软骨凝胶-3d打印双层多孔框架复合物)，使用蛋白酶k消化，消化后的样品使用picogreen试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca,usa)定量检测，使用荧光酶标仪测定520nm的吸光度，依据标准曲线公式计算出dna含量。
160.在本实用新型中，当将本实用新型的软骨凝胶接种于载体材料(尤其是3d打印双层多孔框架)时，本实用新型中的软骨凝胶具有一定的粘附率，通过本实用新型提供的粘附率测定方法确定。本实用新型的软骨凝胶或软骨膜片颗粒的粘附率≥90％，较佳的，≥95％。
161.本实用新型的主要优点包括：
162.(1)卡扣的设计结构可实现软骨相和硬骨相的分步式自由组装；
163.(2)软骨相和硬骨相所接种的细胞种类不同，分体式支架可以实现不同种类细胞分别接种软骨相和硬骨相支架；
164.(3)软骨相和硬骨相所接种的细胞密度和数量不同，分体式支架可以实现不同密度和数量的细胞分别接种软骨相和硬骨相支架；
165.(4)软骨相和硬骨相体外构建时所需的培养基不同，分体式支架可以实现不同培养基分别培养软骨相和硬骨相；
166.(5)软骨相和硬骨相体外诱导时所需的细胞因子不同，分体式支架可以实现不同种类细胞因子分别诱导软骨相和硬骨相；
167.(6)软骨相和硬骨相体外构建时所需的诱导时间不同，分体式支架可以实现软骨相和硬骨相的单独培养以满足不同诱导时间要求。
168.(7)软骨脱细胞基质及脱钙骨基质可以分别提供软骨再生及骨再生的微环境，实现成分的仿生，促进软骨形成及骨形成；
169.(8)单纯软骨脱细胞基质及脱钙骨基质成型困难，复合一定比例的明胶或胶原作为辅剂，有效提升了交联性能，可制备一定形状的三维多孔支架；
170.(9)调控材料复合比例、冻干和交联参数可实现对支架材料孔隙结构和降解速率的精确控制。
171.(10)“钢筋-混凝土”结构多孔仿生支架，解决了天然材料不能3d打印精确控制形态的难题，又更大限度的保持了其生物学活性和软骨及骨基质微环境，为进一步添加各类
生物活性因子提升复合支架的调控功能提供了可能。
172.下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
173.培养基
174.成软骨培养基：高糖dmem培养基，1％1
×
its premix((its通用型培养混合剂，含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清蛋白、丙酮酸、抗坏血酸磷酸盐),40μg/ml脯氨酸，10ng/ml tgf-β1，100ng/ml igf-1,40ng/ml地塞米松和50μg/ml维生素c。
175.成骨诱导培养基：
176.低糖dmem培养基，10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)，10mm地塞米松，10mmβ-磷酸甘油，50mm维生素c
177.凝胶化培养基:含4-5wt％葡萄糖，10％fbs(v/v)和100u/ml青链霉素的dmem培养基。
178.实施例1：软骨相和硬骨相分体式内核网格框架的制备
179.经计算机辅助设计可分步组装的软骨-骨分体式三维数字模型，分为软骨相和硬骨相。软骨相底端设计两个卡扣式突起结构，硬骨相顶端设计两个与之相匹配的卡扣式凹陷结构，使之两部分可以紧密连接构建复合体。根据软骨相和硬骨相结构及力学特征调节软骨相和硬骨相层宽、沉积角度和孔径大小等参数。基于三维数字模型经3d打印机(mam
‑ⅱ
free form fabrication system)打印pcl基材制备毫米级软骨相和硬骨相分体式内核网格框架。通过调节不同层宽，不同沉积角度(-45
°
/45
°
、-60
°
/60
°
或0
°
/60
°
/120
°
)及不同直径的不锈钢针头(19g、20g或21g)，设置合适的挤料速度、打印速度和层高等打印参数，制备不同孔径大小及内部结构的软骨相和硬骨相分体式内核网格框架。
180.如图1所示的软骨-骨复合体的分体式内核网格框架，其沉积角度为60
°
、不锈钢针头为21号、孔径大小为0.3mm。
181.实施例2：软骨相支架和硬骨相支架的制备
182.取一定质量(0.2g)的明胶颗粒，置于一定体积(20ml)的去离子水中，37℃恒温震荡2小时溶解制成浓度为1％(m/v)的明胶溶液。取一定质量(0.1g)的软骨脱细胞基质粉末，置于一定体积(10ml)的1％的明胶溶液中，4℃低温预冷搅拌6小时充分混匀，配制成含1％软骨脱细胞基质的悬浊液。
183.取一定质量(0.1g)的脱钙骨基质粉末，置于一定体积(10ml)的1％的明胶溶液中，4℃低温预冷搅拌6小时充分混匀，配制成含1％脱钙骨基质的悬浊液，用于构建硬骨相。
184.分体式软骨相和硬骨相内核网格框架分别固定于特制的圆柱状模具中，分别灌注一定体积(1ml)的含1％软骨脱细胞基质的悬浊液和含1％脱钙骨基质的悬浊液，-10℃冷冻处理24小时，经真空冷冻干燥48小时后，软骨相和硬骨相固相载体分别浸入含有0.5％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和0.3％n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(溶于95％酒精)交联溶液中充分交联24小时。去离子水反复浸泡冲洗软骨相和硬骨相支架24小时，去除三维支架中残留的化学交联剂，再经真空冷冻干燥24小时，得到分体式的软骨相和
硬骨相固相载体(即软骨相/硬骨相支架)。
185.实施例3：软骨相和硬骨相的体外构建及组装
186.3.1软骨相体外构建
187.方法1：获取关节软骨细胞，软骨相支架(直径约为0.8cm)体外接种培养自体关节软骨细胞，细胞悬液密度为7.5
×
107/ml，体外应用成软骨诱导培养基诱导培养4周，得到一体化的负载有软骨细胞的软骨相。
188.方法2：无菌切取2.5
×
2.5cm2的耳软骨组织，使用无菌器械将软骨表面的黏膜及纤维组织剥离。将软骨组织剪为1.5
×
1.5mm2大小软骨碎片。配置浓度为0.15％胶原酶，将软骨碎片加入配置好的胶原酶中消化8小时。8小时后将胶原酶溶液过滤离心得到耳软骨细胞，进行原代及传代培养(高糖dmem培养基)，细胞传代至第2-5代，优选第3代。
189.扩增后收集细胞重悬，按每孔8
×
106/10ml至30
×
10
6/
10ml的细胞量接种于六孔板(3.5cm直径)中，以凝胶化培养基(含4-5wt％葡萄糖，10％fbs(v/v)和100u/ml青链霉素的dmem培养基)培养。培养3天后，将六孔板中上部的培养基吸去，使用镊子将六孔板底部的软骨凝胶聚集，一个孔的凝胶软骨产量为0.1-0.2ml，收集至5ml注射器中。3天后得到的软骨凝胶为0.1ml左右，按细胞扩增2倍计算，该凝胶软骨中，细胞密度为1.0
×
10
8-10
×
108个/ml，较佳地1.5-5
×
108个/ml。
190.将其与0.15ml培养基混合制成含软骨凝胶的可注射制剂。
191.第3天，软骨凝胶的粘稠度显著提升，便于与孔径大的负载材料结合。
192.通过上述粘附率测定的方法测定粘附率。与细胞悬液相比，本实用新型的凝胶软骨粘附率为92％
±
2％。
193.将凝胶软骨制剂(如上所述制备，体积约0.25-0.35ml)接种于上述软骨相支架中，于37℃、95％湿度、5％二氧化碳静置2小时；静置后加入成软骨培养基继续培养3-11天，得到一体化的负载有软骨细胞的软骨相。
194.方法3：提供一第2-5代的耳软骨细胞(如方法2所述的制备方法)，扩增后收集细胞重悬，按照8
×
106/10ml至30
×
106/10ml/孔的细胞量接种于六孔板中，以凝胶化培养基(含4-5wt％葡萄糖，10％fbs(v/v)和100u/ml青链霉素的dmem培养基)培养；培养24小时或48小时后更换新鲜凝胶化培养基，继续体外培养至15天；吸去六孔板中的培养基，可见六孔板底部的耳软骨膜片组织，其中耳软骨膜片组织中的细胞密度约为1.0
×
108个/ml-10
×
108个/ml；使用镊子将耳软骨膜片夹起，将其切割为1
×
1mm2大小的耳软骨膜片颗粒后，收集至50ml离心管；
195.将需要接种的框架材料(软骨相支架)置于装有耳软骨膜片颗粒的离心管中，确保框架材料被完全浸没过；将装有框架材料及耳软骨膜片颗粒的离心管放于离心机中，600转/分钟，离心2分钟；
196.将接种好的框架材料于37℃、95％湿度、5％二氧化碳静置一定时间；静置后加入成软骨培养基继续体外培养3-11天，形成软骨膜片颗粒-框架结构复合物。
197.3.2硬骨相体外构建
198.(1)bmsc细胞的获取：从患者髂前上棘经穿刺取骨髓3～5ml，置于percoii分离液上(密度1.073g/l)行梯度密度离心，骨髓与分离液比例为1:2。2550r/min离心30分钟，吸取中间云雾状细胞层，磷酸缓冲液(pbs)洗1次。1550r/min离心后弃上清获取有核细胞，以2
×
107细胞/cm2接种培养皿，进行体外细胞扩增，以成骨条件培养液予成骨诱导。
199.原代细胞接种后48小时换液，细胞达80％～90％融合后，采用0.25％胰酶消化，2
×
103细胞/cm2传代培养，置于37℃，5％co2培养箱培养至第3代，收集细胞并计数。
200.(2)软骨相支架体外诱导培养1周后，硬骨相支架(直径约为8mm)体外接种培养至第3代的自体骨髓间充质干细胞，细胞悬液密度为2.5
×
107/ml，体外应用成骨诱导培养基诱导培养3周。
201.3.3组装
202.体外构建较成熟的软骨组织和骨组织后，软骨相的突起卡扣结构与硬骨相与之相匹配的凹陷结构组装构建软骨-骨复合体，用于修复骨软骨复合缺损。
203.本实用新型的软骨-骨复合体如图1所示。
204.讨论
205.用于软骨及骨修复的支架材料及其制备方法有很多种，现有技术中的软骨-骨一体化仿生支架，可以用于软骨复合缺损的即时修复，但其修复范围受限。当需要较大面积的骨软骨复合缺损时，现有的软骨-骨一体化仿生支架难以较好地完成修复。需要通过组织工程方法，通过支架复合自体细胞进行体外构架生物关节以实现骨软骨复合缺损的修复。此时，现有的一体化支架的应用受到了较大限制，原因如下：
206.(1)软骨相和硬骨相所接种的细胞种类和细胞数量不同；
207.(2)软骨相和硬骨相体外构建时所需的培养基和细胞因子种类不同；
208.(3)软骨相和硬骨相体外构建所需的时间不同等。
209.以上过程在现有的一体化支架上都难以实现精确的调控。然而本实用新型的分步组装式软骨-骨多孔仿生支架，分别提供软骨再生及骨再生的微环境，实现成分的仿生，促进软骨形成及骨形成；通过组装，实现了体外的软骨-骨支架材料的一体化培养。本实用新型的仿生支架更大限度的保持了其生物学活性和软骨及骨基质微环境，为进一步添加各类生物活性因子提升复合支架的调控功能提供了可能。
210.在本实用新型提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。