与STAT3相关的疾病的预防和/或治疗的制作方法

与stat3相关的疾病的预防和/或治疗
技术领域
1.本发明涉及通过调节14-3-3σ预防和/或治疗与stat3相关的疾病。


背景技术：

2.信号转导及转录激活蛋白3(stat3)是stat蛋白家族的成员，由多个转录因子组成，这些转录因子对参与许多细胞功能的基因进行调节。stat蛋白由jak激酶(jak)激活。在细胞因子或生长因子的刺激后，stat3被膜受体相关的jak磷酸化，进而形成同源或异源二聚体，并转运到细胞核中进行转录。由于stat3控制多种基因的表达，并在许多细胞过程(包括细胞生长和细胞凋亡1)中发挥关键作用，因此stat3-ko在小鼠模型中具有胚胎致死性2。
3.stat3在免疫细胞中的功能已得到广泛研究。stat3对于th17细胞的分化是不可或缺的
3-6
。在病毒感染期间，t细胞中缺乏stat3的小鼠完全丧失了产生滤泡辅助t细胞(tfh)和抗体的能力7。人体内显著的stat3突变是功能丧失性(lof)突变，可导致高免疫球蛋白e综合征(hies)。患有该疾病的患者会出现反复感染以及骨骼和牙齿发育异常
8，9
。另一方面，stat3基因的功能获得性突变(gof)导致自身免疫性疾病
10
。有报告表明，诸如dock8、pgm3、spink5和tyk2等其他基因中的突变也可诱发hies
11-14
。我们培育了dock8突变小鼠来模拟dock8患者体内的突变，并发现记忆b细胞的早期激活被破坏。此外，dock8缺乏导致cd19和wasp表达减少
15
。先前的研究表明，在tlr9介导的b细胞激活中，stat3在dock8的下游，并且dock8通过激活stat3来抑制ige的产生
16
。然而，stat3与dock8之间是否存在调节ige产生的相关性尚不清楚。
4.近期发现微rna(mirna)与高ige之间存在关联。使用mirna146a转基因小鼠可以证实，mirna146a通过上调14-3-3σ来促进ige类别转换，14-3-3σ是b细胞中免疫球蛋白类别转换dna重组(csr)的关键因素
17-19
。jurkat t细胞中mirna146a的异位表达导致stat3表达适度下调
20
。此外，当stat3的激活在肝细胞癌(hcc)细胞中被阻断时，mirna146a的表达降低
21
。另外，在丙型肝炎感染期间，mirna146a控制单核细胞中socs1/stat3和细胞因子的表达
22
。然而，尤其是在b细胞中，stat3突变所致的hies的潜在机制仍不清楚。
5.b细胞受体(bcr)信号传导对于调节b细胞过程和功能至关重要。bcr信号传导决定b细胞的命运及其抗体应答的程度。当抗原与bcr结合时，可引发受体的构象变化并触发信号传导级联，如cd19、lyn、syk、btk、plcγ以及bcr信号传导中负向调节剂(包括ship和pten)的磷酸化
23-25
。bcr信号传导还可通过诸如wasp、abp1和n-wasp等若干肌动蛋白调节剂诱导肌动蛋白重组，而肌动蛋白重组通过调节bcr的移动为bcr信号传导提供反馈
26-29
。stat3如何在stat3 lof和gof患者b细胞中影响bcr信号传导尚不清楚。
6.在一项研究中，stat3缺乏阻碍了骨髓b细胞的早期发育，但stat3的缺失是由并非b细胞特有的mx1
cre
驱动的
30
。相比之下，cd19
cre stat3 fl/fl
小鼠未观察到发育缺陷，因此stat3的缺失发生在b细胞发育后期，并且只有t细胞依赖性(td)igg应答严重受损，而td-igm、ige、和iga应答或非t细胞依赖性(ti)igm和igg3应答未受损
30,31
。stat3信号传导对维持生发中心(gc)至关重要，并通过调节gc活性解释系统性红斑狼疮(sle)的发病机制
32
。
stat3患者的记忆b细胞(包括转换和未转换的免疫球蛋白)减少
33-35
。为了使用小鼠模型精确研究stat3突变仅在b细胞中引发hies的潜在机制，我们培育了在b细胞发育早期就已缺失stat3的mb1
cre stat3 flox/flox
小鼠(stat3ko)。


技术实现要素：

7.在第一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗需要这种预防和/或治疗的患者的与stat3相关的疾病的方法，所述方法包括在所述患者体内调节14-3-3σ。
8.在第一方面的一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3或功能获得性stat3。在第一方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3。
9.在第一方面的另一个实施方案中，所述与stat3相关的疾病是高ige综合征。
10.在第一方面的另一个实施方案中，调节14-3-3σ是下调14-3-3σ或上调14-3-3σ。在第一方面的另一个实施方案中，调节是下调14-3-3σ。在第一方面的另一个实施方案中，下调14-3-3σ是用14-3-3σ抑制剂进行的。在第一方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ抑制剂是肽。在第一方面的另一个实施方案中，所述肽包含氨基酸序列nh
2-ygrkkkrqrrrphcvprdlswldleanmclp-cooh。
11.在第二方面，本发明提供了一种14-3-3σ调节剂、一种包含所述14-3-3σ调节剂的药物组合物或者一种包含所述14-3-3σ调节剂的试剂盒，用于预防和/或治疗需要这种预防和/或治疗的患者的与stat3相关的疾病。
12.在第二方面的一个实施方案中，所述14-3-3σ调节剂是14-3-3σ下调剂或14-3-3σ上调剂。在第二方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ调节剂是14-3-3σ下调剂。在第二方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ下调剂是14-3-3σ抑制剂。在第二方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ抑制剂是肽。在第二方面的另一个实施方案中，所述肽包含氨基酸序列nh
2-ygrkkkrqrrrphcvprdlswldleanmclp-cooh。
13.在第二方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3或功能获得性stat3。在第二方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3。
14.在第二方面的另一个实施方案中，所述与stat3相关的疾病是高ige综合征。
15.在第二方面的另一个实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
16.在第二方面的另一个实施方案中，包含在试剂盒中的14-3-3σ调节剂处于药物组合物的形式。在第二方面的另一个实施方案中，所述试剂盒还包含应用所述14-3-3σ调节剂的说明书。
17.在第三方面，本发明提供了14-3-3σ调节剂在预防和/或治疗需要这种预防和/或治疗的患者的与stat3相关的疾病中的用途。
18.在第三方面的一个实施方案中，所述14-3-3σ调节剂是14-3-3σ下调剂或14-3-3σ上调剂。在第三方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ调节剂是14-3-3σ下调剂。在第三方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ下调剂是14-3-3σ抑制剂。在第三方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ抑制剂是肽。在第三方面的另一个实施方案中，所述肽包含氨基酸序列nh
2-ygrkkkrqrrrphcvprdlswldleanmclp-cooh。
19.在第三方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3或功能获得性
stat3。在第三方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3。
20.在第三方面的另一个实施方案中，所述与stat3相关的疾病是高ige综合征。
21.在第四方面，本发明提供了14-3-3σ调节剂在制造药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗需要这种预防和/或治疗的患者的与stat3相关的疾病。
22.在第四方面的一个实施方案中，所述14-3-3σ调节剂是14-3-3σ下调剂或14-3-3σ上调剂。在第四方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ调节剂是14-3-3σ下调剂。在第四方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ下调剂是14-3-3σ抑制剂。在第四方面的另一个实施方案中，所述14-3-3σ抑制剂是肽。在第四方面的另一个实施方案中，所述肽包含氨基酸序列nh
2-ygrkkkrqrrrphcvprdlswldleanmclp-cooh。
23.在第四方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3或功能获得性stat3。在第四方面的另一个实施方案中，所述stat3是功能丧失性stat3。
24.在第四方面的另一个实施方案中，所述与stat3相关的疾病是高ige综合征。
附图说明
25.图1：stat3对维持外周血b细胞的稳态至关重要，但对骨髓b细胞则不然。
26.(a-c)来自wt和stat3 ko小鼠(n＝8)骨髓细胞的前祖b细胞(a)、祖b细胞(b)、早期前b细胞(c)、晚期前b细胞(d)、未成熟b细胞(e)和再循环b细胞(f)的流式细胞术数据以及这些细胞各自的百分比和绝对数量。(d)从a和b门控的不同群体中cd127的mfi。(e-h)来自wt和stat3ko小鼠脾细胞(n＝8)的t1、t2、fo细胞群体的流式细胞术数据以及这些细胞各自的百分比和绝对数量。(i和j)来自小鼠脾细胞(n＝8)的mz b细胞的流式细胞术数据以及这些细胞的百分比和绝对数量。(k和l)来自小鼠脾细胞(n＝8)的gc细胞的流式细胞术数据以及这些细胞的百分比和绝对数量。(m-o)来自wt和stat3 ko小鼠(n＝6)的b1a和b1b细胞的流式细胞术分析以及这些细胞各自的百分比和绝对数量。(p-r)来自经过或未经5天抗cd40和il-4刺激的wt和stat3 ko小鼠(n＝4)的ige

脾脏b细胞的流式细胞术数据以及这些细胞的百分比和绝对数量。(s)通过elisa得出的wt和stat3 ko小鼠血清(n＝6)ige的滴度。所示为三个独立实验的代表性结果。*p《0.05并且**p《0.01。
27.图2：stat3正向调节近侧bcr信号传导。
28.(a和b)来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b细胞经过标记，并使用af546-单生物素化fab'-抗igg加链霉亲和素通过可溶性抗原(sag)在37℃下经不同时间长度的刺激。在固定和透化后，将细胞针对pcd19进行染色，通过共聚焦显微术成像，并对bcr与pcd19之间的相关系数进行定量。(c)通过蛋白质印迹分析的经sag刺激的wt和stat3 ko小鼠脾脏b细胞中的pcd19/cd19水平。(d和e)经sag刺激的小鼠脾脏b细胞中py和pbtk的共聚焦显微图像，并对bcr与py/pbtk之间的相关系数进行定量。(f)通过蛋白质印迹分析的经sag刺激的小鼠脾脏b细胞中的py和pbtk/btk水平。(g和h)通过共聚焦显微术分析的经sag刺激的小鼠脾脏b细胞中的pship，并对bcr与pship之间的相关系数进行测量。(i)经sag刺激的小鼠脾脏b细胞中pship/ship水平的蛋白质印迹。所示为三个独立实验的代表性结果。比例尺，2.5μm。使用nis elements ar 3.2软件对多于50个细胞的相关系数进行定量。曼-惠特尼u检验(图2b、图2e、图2h)。**p《0.05；***p《0.01。
29.图3：stat3的缺乏减少了由wasp和wip介导的f-肌动蛋白的积累以及bcr簇集和正
向信号复合体募集。
30.(a)wt和stat3 ko小鼠脾脏b细胞中的pwasp和肌动蛋白的共聚焦显微术分析。b细胞在37℃下经不同时间长度的sag刺激，然后固定、透化并针对pwasp和肌动蛋白(使用鬼笔环肽)进行染色。(b)将来自wt和stat3ko小鼠的脾脏b细胞用bv510-抗b220标记，在37℃下经不同时间长度的sag刺激，然后如a所述进行固定、透化和染色。通过流式细胞术测量pwasp和肌动蛋白的mfi。(c)通过蛋白质印迹分析的经sag刺激的wt和stat3 ko小鼠脾脏b细胞中的pwasp/wasp水平。(d)来自wt和stat3 ko小鼠(左小图)的脾脏b细胞中以及健康对照(hc)和功能丧失性(lof)stat3患者pbmc(右小图)中wip和dock8的表达。将gapdh用作上样对照。(e-j)将来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b细胞使用af546-单生物素化fab'-抗igg在膜拴系抗原(membrane-tethered antigen，mag)上经不同时间长度的刺激，然后固定、透化并针对pwasp和肌动蛋白进行染色。使用tirfm分析细胞，并测量bcr、pwasp和肌动蛋白的mfi，以及使用干涉反射显微术(irm)测量b细胞接触面积。所示为代表性图像和平均值(
±
sd)，其中使用nis elements ar 3.2软件分析了多于50个细胞。比例尺，2.5mm。*p《0.05；**p《0.01。曼-惠特尼u检验(图2g-图2j)。
31.图4：stat3缺乏导致pcd19、pbtk和py的募集减少，但pship的募集增加。
32.(a和d)将来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b细胞在37℃下经不同时间长度的mag刺激，然后固定、透化并针对pcd19进行染色。使用tirfm拍摄图像，并对b细胞接触区内pcd19的mfi进行分析。(b、e、f)使用tirfm对经mag刺激及针对pbtk和py进行染色的小鼠脾脏b细胞进行成像，并对接触区内pbtk和py的mfi进行测量。(c和g)使用tirfm对经mag刺激及针对pship进行染色的小鼠脾脏b细胞进行成像，并对接触区内pship的mfi进行测量。所示为代表性图像和平均值(
±
sd)，其中从3个独立实验使用nis elements ar 3.2软件分析了多于50个细胞。比例尺，2.5mm。*p《0.05；**p《0.01。曼-惠特尼u检验(图2d、图2e、图2f、图2g)。
33.图5：stat3缺乏降低pi3k-akt-mtorc1介导的代谢信号传导通路。
34.(a)将来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b细胞经不同时间的sag刺激，裂解，并使用蛋白质印迹探测ppi3k/pi3k、pakt/akt、pfoxo1/foxo1、pmtor/mtor和ps6/s6。(b)来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b细胞响应于抑制剂寡霉素、fccp(羰基氰对三氟甲氧基苯腙)和鱼藤酮治疗的基础耗氧率(ocr)。(c和d)将来自wt和stat3 ko小鼠(n＝4)的脾脏b细胞(1x106)用cell trace violet标记，并用lps和cpg刺激72小时。通过流式细胞术检测b220

细胞的增殖，并对增殖细胞的百分比进行定量。(e和f)用lps和cpg刺激72小时后，小鼠脾脏b220

细胞中膜联蛋白v的表达。对膜联蛋白v

细胞的百分比(n＝4)进行定量。所示为三个独立实验的代表性结果。**p《0.05；***p《0.01。
35.图6：来自stat3 lof患者的记忆b细胞破坏了早期bcr激活。
36.(a、d-f)将从hc和stat3 lof患者外周血(p1-p4)中分选的b细胞经不同时间长度的mag刺激，固定、透化并针对cd27(以标记记忆b细胞)和肌动蛋白(使用鬼笔环肽)进行染色。使用tirfm拍摄图像，使用irm分析b细胞接触面积，并测量接触区内bcr和肌动蛋白的mfi。(b和g)使用tirfm对经mag刺激及针对cd27和pcd19进行染色的hc和stat3 lof患者b细胞进行成像，并对接触区内pcd19的mfi进行测量。(c和h)使用tirfm对经mag刺激及针对cd27和py进行染色的hc和stat3 lof患者b细胞进行成像，并对接触区内py的mfi进行测量。所示为代表性图像和平均值(
±
sd)，其中从3个独立实验使用nis elements ar 3.2软件分
析了多于50个细胞。比例尺，2.5mm。*p《0.05；**p《0.01。曼-惠特尼u检验(图2d-图2h)。(i和j)hc以及stat3 lof(p1-p6)和gof(p7)患者pbmc(n＝6)的b细胞亚型的流式细胞术数据，以及初始b细胞、记忆b细胞、过渡b细胞和浆母细胞的定量百分比。(k和l)将从hc、stat3 lof(p1-p4)和gof(p7)患者pbmc中分选的b细胞经不同时间长度的sag刺激，并使用流式细胞术对初始和记忆b细胞(n＝4)的百分比进行分析。所示为三个独立实验的代表性结果。*p《0.05；**p《0.01。
37.图7：stat3缺乏通过增强mirna146a-14-3-3σ轴导致高ige。
38.(a)对来自wt和stat3-ko小鼠(n＝6)的脾脏b细胞中mirna146a和14-3-3σmrna的分析。(b)对来自hc和lof患者pbmc(n＝6)(p1-p7)的b细胞中mirna146a和14-3-3σmrna的分析。(c)使用蛋白质印迹检测的来自wt和stat3 ko小鼠脾脏(左小图)以及hc和lof患者pbmc(右小图)(p4-p6)的b细胞中14-3-3σ的表达。将gapdh用作上样对照。(d)对来自wt小鼠的b细胞中stat3与14-3-3σ启动子结合的pcr分析。将igg用作阴性对照。(e)将来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b细胞用或不用10μm r18处理1小时，用sag刺激，然后裂解并使用蛋白质印迹探测pakt和pfoxo1。将β-肌动蛋白用作上样对照。(f)对wt和stat3 ko小鼠用或不用r18(0.2μg/kg体重)腹膜内连续注射14天，然后将脾脏b细胞进行分离并用sag刺激，裂解，并使用蛋白质印迹探测pakt和pfoxo1。将β-肌动蛋白用作上样对照。(g-j)对wt和stat3 ko小鼠(n＝3)用或不用r18(0.2μg/kg体重)腹膜内连续注射14天，并通过流式细胞术分析fo和gc b细胞的百分比。(k和l)通过流式细胞术对经过或未经r18处理且经过或未经刺激的wt和stat3 ko小鼠测量ige

b细胞和ige转换b细胞的百分比。(m)通过elisa对经过或未经r18处理的wt和stat3 ko小鼠(n＝5)血清中的ige滴度进行测量。所示为三个独立实验的代表性结果。*p《0.05并且**p《0.01。
39.图8
40.(a)对来自wt和stat3-ko小鼠(n＝4)的脾脏b细胞中stat3 mrna的分析。(b和c)来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b220、mz、fo、t1和t2细胞中膜联蛋白v表达的流式细胞术数据以及细胞群(n＝8)的定量百分比。(d和e)来自wt和stat3 ko小鼠的脾脏b220、mz、fo、t1和t2细胞中ki67表达的流式细胞术数据以及细胞群(n＝8)的定量百分比。所示为三个独立实验的代表性结果。(f和g)对wt和stat3 ko小鼠用或不用r18(0.2μg/kg体重)腹膜内连续注射14天。数据显示对mz细胞的流式细胞术分析及其百分比(n＝3)。所示为三个独立实验的代表性结果。*p《0.05并且**p《0.01。
实施例
41.如下将详细解释本技术。
42.本研究中，我们发现在stat3 ko b细胞中，近侧正向bcr信号传导有所减少，但负向调节剂ship有所增强。在stat3 ko b细胞中，wasp的激活和由此产生的肌动蛋白重组减少了，并且b细胞的早期激活(包括bcr簇集、b细胞铺展和信号复合体募集)也受损。通过使用来自stat3 lof患者的外周血单个核细胞(pbmc)，我们发现记忆b细胞的早期激活和肌动蛋白的积累也有所减少。值得注意的是，我们发现记忆b细胞和浆母细胞减少了，但stat3 lof和gof细胞二者中的初始b细胞却增加了。另外，来自stat3 lof的初始b细胞易分化为记忆b细胞。在机制上，stat3 ko b细胞具有更多且在体外易形成ige

b细胞。最后，我们发现
在stat3 ko b细胞和stat3 lof患者中mirna146a和14-3-3σ的表达均有增强。
43.转录因子在维持正常发挥功能的免疫系统中起着至关重要的作用；因此，转录因子突变可导致免疫失调。stat3或dock8功能缺失性突变导致免疫缺陷和ige过度产生，称为高ige综合征(hies)，这种疾病的潜在机制很多尚不清楚。在本研究中，我们使用来自stat3功能丧失性(lof)和功能获得性(gof)患者的样品以及来自我们培养的stat3 b细胞特异性缺失小鼠(stat3 ko)的样品来研究hies的机制。有趣的是，我们发现stat3 ko小鼠的外周血b细胞稳态与stat3 lof患者的表型相似，其中的滤泡(fo)和生发中心(gc)b细胞均有减少，但边缘区(mz)b细胞、静息b细胞和激活ige b细胞却有所增加。另外，在抗原刺激下stat3 ko b细胞的b细胞受体(bcr)信号传导减少，这是因为bcr簇集以及wasp和f-肌动蛋白的积累均有减少。令人兴奋的是，一种中心枢纽蛋白14-3-3σ在stat3 ko小鼠和stat3 lof患者的b细胞中增多，14-3-3σ是增加ige产生所必不可少的。14-3-3σ的增加与上游介导物mirna146a的表达增加有关。在stat3 ko小鼠中用r18肽抑制14-3-3σ可将bcr信号传导以及fo、gc和ige b细胞分化挽救到野生型(wt)小鼠的程度。总之，我们的研究建立了stat3-mirna146a-14-3-3σ的新型调节途径，以调节bcr信号传导、外周血b细胞分化和ige产生，可为hies治疗提供靶标。
44.材料与方法
45.小鼠
46.通过将mb1
cre
小鼠(jackson laboratory)与stat3 flox/flox
小鼠
36
杂交获得具有c57/bl6背景的stat3条件性敲除小鼠(在这里称为stat3 ko小鼠)，具有相同遗传背景的stat3 flox/flox
小鼠用作野生型对照(wt)。根据重庆医科大学附属儿童医院动物中心的方案，所有小鼠均保存在单独的通风笼中。除非另有说明，否则在小鼠8-12周龄时对其进行分析。如先前所述对骨髓、脾脏单细胞悬浮液和b细胞进行分离
26
。对于体内用r18治疗，对wt和stat3 ko小鼠用r18(0.2μg/kg体重)腹膜内(ip)连续注射14天。所有动物实验均按照重庆医科大学儿童医院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
47.患者
48.从2017年到2018年，共有7名中国患者参与本研究，包括6名stat3功能丧失性(lof)患者和1名stat3功能获得性(gof)患者(表1)。
49.表1.患者信息，包括性别、年龄和stat3突变类型。
[0050][0051]
stat3 lof和gof患者的诊断是以临床体征、症状和stat3突变为依据做出。健康对照受试者由7名年龄相仿的受试者组成。收集人外周血单个核细胞(pbmc)，并使用easysep
tm
人b细胞分离试剂盒(17954；stemcell)从人pbmc中分离b细胞。经重庆医科大学儿童医院伦理委员会批准，已获得所有儿童父母的签字同意。
[0052]
r18肽合成
[0053]
通过gl biochem合成r18氨基酸序列nh
2-ygrkkkrqrrrphcvprdlswldleanmclp-cooh。
[0054]
细胞培养
[0055]
获得wt和stat3 ko小鼠脾脏b细胞(1x105)，并用在含有10％fcs(hyclone)的5ml rpmi 1640中的10μg/ml抗小鼠cd40(be0016-2，bioxcell)和8ng/ml il-4(r&d systems)刺激5天，然后通过流式细胞术分析细胞的ige表达。为了检测b细胞增殖，将小鼠脾脏b细胞(1x105)分离并用cell trace violet标记，然后在含有10％fcs(hyclone)、10mmol/lβ-巯基乙醇和1％链霉素-青霉素的rpmi 1640中与5mg/ml lps(sigma-aldrich)或10μg/ml b类cpg寡核苷酸(odn1826，invivogen)以200μl/孔的体积在96孔圆底板中培养5天，然后通过细胞计量术进行分析。
[0056]
流式细胞术和抗体
[0057]
为进行流式细胞术分析，从骨髓和脾脏分离单细胞悬浮液，并将所述单细胞悬浮液与fcγ受体(fcγr)阻断性抗体(抗小鼠cd16/cd32；bd bioscience)在冰上孵育，然后在具有2％fbs的pbs中用以下抗体(ab)染色。对于表面标记物，所使用的抗小鼠抗体包括fitc-抗cd127(135008；biolegend)、apc-抗cd43(143208)、pe-抗bp-1(108307；biolegend)、亮紫510-抗b220(103247；biolegend)、pe/cy7-抗cd24(101822；biolegend)和亮紫421-抗igm(406518；biolegend)、fitc-抗cd19(101506；biolegend)、fitc-抗cd95(554257；bd biosciences)、fitc-抗膜联蛋白v(640906；biolegend)、pe-抗cd23(101608；biolegend)、percp/cy5.5-抗igd(405710；biolegend)、apc-抗cd21(123412；biolegend)、alexa fluor 647-抗gl7(144606；biolegend)、亮紫421-抗igm(406518；biolegend)、pe-抗
technology)、ps6(4856s；cell signaling technology)、pfoxo1(9461s；cell signaling technology)和ppi3k(17366s；cell signaling technology)的免疫印迹。为检测总蛋白表达，将人或小鼠b细胞进行裂解，并进行针对btk(8547s；cell signaling technology)、ship(2728s；cell signaling technology)、wasp(sc-13139；santa cruz biotechnology)、akt(9272s；cell signaling technology)、s6(2217s；cell signaling technology)、foxo1(2880s；cell signaling technology)、mtor(7c10；cell signaling technology)、pi3k(4292；cell signaling technology)、cd19(3574；cell signaling technology)、btk(8547；cell signaling technology)、dock8(sc-292124；santa cruz biotechnology)、wip(sc-271113；santa cruz biotechnology)、人/小鼠/大鼠14-3-3σ抗体(af4424；bio-techne)的免疫印迹，并将抗小鼠gapdh和β-肌动蛋白用作上样对照。对于体外用r18处理，将来自wt和ko小鼠的脾脏b细胞在与sag孵育之前与媒介物或10μm r18孵育1h。
[0064]
seahorse测定
[0065]
使用生物素化抗小鼠igg f(ab)2在37℃下将从wt和stat3 ko小鼠中分离的脾脏b细胞与sag孵育1小时，然后在xf培养基(含有5mm葡萄糖、2mm l-谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠的无缓冲剂dmem)中孵育细胞。使用xf-24细胞外流量分析仪(seahorse bioscience)测量响应于1m寡霉素、2m氟羰基氰化苯腙(fccp)和1m鱼藤酮的耗氧率(ocr)。
[0066]
elisa
[0067]
从wt和stat3 ko小鼠中收集血清，并根据制造商说明书使用elisa试剂盒(ebioscience)测量ige水平。
[0068]
定量rt-pcr
[0069]
为检测wt和stat3 ko小鼠以及健康对照(hc)和lof患者中stat3、mirna146a和14-3-3δmrna表达的差异，从小鼠脾脏和患者pbmc中分离b细胞，然后通过rnapure试剂盒(rp1202；bioteke)分离rna，并用primescript rt试剂盒(rr037a；takara)进行逆转录。使用转录的cdna以在cfx96 touch real-time system(bio-rad)上用advanced sybr green supermix(bio-rad)分析不同基因的表达。stat3(小鼠)f:5
′‑
tgtcagatcacatgggctaaat-3
′
；stat3(小鼠)r:5
′‑
ggtcgatgatattgtctagcca-3
′
；14-3-3σ(小鼠)σf:5
′‑
agaacccagcgttactctcga-3
′
；14-3-3σ(小鼠)σr:5
′‑
cca ccacgttcttgtaagct-3
′
；14-3-3σ(人)σf:5
′‑
gaagttgcagctgattaaggac-3
′
；14-3-3σ(人)σr:5
′‑
tctggattagttgcattggcta-3
′
。根据制造商方案，使用taqman微rna转录和微rna测定试剂盒分析mirna146a的表达。
[0070]
染色质免疫沉淀(chip)测定
[0071]
根据制造商方案，使用酶解染色质ip试剂盒(琼脂糖珠)(9002s；cell signaling technology)进行chip研究。在室温下用甲醛对来自wt c57bl/6小鼠的b细胞处理10分钟。细胞裂解物经过超声处理产生长度为100-1000碱基对的剪切交联染色质。将可溶性染色质用针对stat3的抗体(9139s；cell signaling technology)进行免疫沉淀，并在bio-rad pcr仪器上进行pcr检测。所使用的引物如下：小鼠14-3-3σ启动子正向5
’‑
cacacccacactacctcaca-3’和反向5
’‑
gtggtagtgctgtccaggtg-3。
[0072]
统计学分析
[0073]
除非另有说明，否则使用prism 7软件通过双尾非配对学生t检验评估统计学显著
性(*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001)。数据表示为平均值 /-标准差(sd)。
[0074]
结果
[0075]
stat3对维持外周血b细胞的稳态至关重要，但对骨髓b细胞则不然。
[0076]
为研究骨髓b细胞发育过程中是否需要stat3，我们通过将mb1
cre
小鼠与stat3 flox/flox
小鼠杂交产生stat3 b细胞特异性敲除小鼠mb1
cre stat3
flox/flox
(stat3 ko)。stat3 mrna在stat3 ko b细胞中的表达显著降低，表明有效缺失(图8a)。用bp-1和cd24抗体对stat3 ko小鼠的骨髓b细胞亚类进行染色，以确定前祖b细胞、祖b细胞和早期前b细胞，同时使用b220 igm抗体鉴定晚期前b细胞、未成熟b细胞和再循环b细胞。除再循环b细胞频率呈下降趋势外，我们未观察到所有受检亚群有任何异常(图1a、图1b、图1c)。il-7信号传导对bm b细胞发育至关重要，然而，在wt与stat3 ko小鼠之间il-7受体表达(cd127)并无差异(图1d)。这表明stat3对于骨髓b细胞发育是不可或缺的。通过使用igm igd抗体对t1、t2和滤泡(fo)b细胞染色，使用cd23和cd21抗体定义边缘区(mz)b细胞，以及使用gl7和cd95抗体鉴定生发中心(gc)b细胞，我们进一步确定了stat3如何影响外周血b细胞。在stat3 ko小鼠中，t1 b细胞的百分比和数量正常，但t2 b细胞的百分比和数量有所减少(图1e、图1f、图1g)。值得注意的是，在stat3 ko小鼠中，fo的百分比和数量显著减少(图1e、图1h)，但mz b细胞的百分比和数量却增加了(图1i、图1j)。另外，stat3 ko小鼠的自发性gc b细胞的比率和数量也有所减少(图1k、图1l)。我们通过用ki67和膜联蛋白v染色检查了静息态b细胞的增殖和凋亡，并发现在wt与ko小鼠之间，ki67和膜联蛋白v在fo、mz、gc、t1和t2细胞中的表达均无差异(图8b-图8e)。其次，我们发现b1a细胞的百分比和数量正常，但b1b细胞的比率显著降低(图1m、图1n、图1o)。最后，我们检查了用il-4和抗cd40刺激5天的静息和激活b细胞的ige染色。有趣的是，我们发现stat3 ko b细胞在静息态和激活态下的ige百分比均显著增加(图1p-图1r)。我们还检测了wt和stat3 ko小鼠血清中的ige水平，并发现stat3 ko小鼠中的ige滴度也有所增加(图1s)。这些结果表明，stat3对维持外周血b细胞的稳态至关重要。
[0077]
stat3正向调节近侧bcr信号传导。
[0078]
由于stat3对于维持外周血b细胞的稳态至关重要，而外周血b细胞的稳态与抗原bcr信号传导高度相关
38-40
，因此我们对stat3如何调节bcr信号传导展开研究。我们使用共聚焦显微术检查stat3缺失对cd19时空组织的影响，cd19是一种参与放大上游bcr信号传导的共同受体。在sag刺激后的5分钟和10分钟，stat3 ko b细胞中pcd19与bcr之间的共定位显著减少(图2a、图2b)。此外，通过对在不同时间长度内用可溶性抗原(sag)刺激的脾脏b细胞的裂解物进行免疫印迹，确定了stat3 ko b细胞中pcd19水平降低(图2c)。总之，这意味着stat3影响cd19的时空组织和激活。接下来，我们使用与上文类似的条件通过共聚焦显微术和免疫印迹检查酪氨酸磷酸化蛋白(py)和pbtk(cd19的直接下游激酶)造成的总bcr信号传导水平。在stat3 ko b细胞中，py/pbtk与bcr之间的相关系数在10min时显著降低(图2d、图2e)。另外，stat3 ko b细胞中的py和pbtk水平显著降低(图2f)。最后，我们使用与上文相同的条件确定了stat3缺乏对pship与bcr之间的共定位以及ship(其为bcr信号传导的近侧负向调节剂)激活的影响。stat3 ko b细胞中bcr与pship之间的共定位在5min时显著降低(图2g、图2h)，并且stat3 ko b细胞中ship的磷酸化增强(图2i)。总之，这些结果表明stat3缺乏破坏了正向与负向bcr信号传导的平衡。
[0079]
stat3缺乏减少了由wasp和wip介导的f-肌动蛋白的积累以及bcr簇集和正向信号复合体募集。
[0080]
先前的报道证实了巨噬细胞系中stat3与肌动蛋白之间的相关性
41
。因此，我们试图确定stat3 ko b细胞中的异常bcr信号传导是否会导致肌动蛋白的破坏。为检查这一点，将经sag刺激的b细胞进行固定、透化，并分别使用特异性抗体和鬼笔环肽针对肌动蛋白调节剂pwasp和f-肌动蛋白进行染色，然后通过共聚焦显微术、免疫印迹和磷酸化流式细胞术进行分析。在stat3 ko b细胞的免疫印迹和磷酸化流式细胞术中，只有pwasp的表达降低，而总wasp的表达未降低(图3a-图3c)，这与肌动蛋白积累减少相关。为进一步探讨stat3如何促进pwasp表达的潜在机制，通过免疫印迹检查了wip的表达，wip可稳定wasp的磷酸化并防止wasp降解。不出所料，stat3ko鼠b细胞和stat3 lof患者的pbmc中的wip表达减少了(图3d)。这表明pwasp水平降低可能是由wip的表达减少所致。dock8在wasp的上游
15
，并且有报道表明dock8缺乏患者也患有hies
42
。因此，我们检查了dock8在stat3 ko小鼠和lof患者中的表达。有趣的是，stat3 ko鼠b细胞和stat3 lof患者pbmc中的dock8表达显著减少(图3d)。我们先前的研究表明，质膜上存在缺陷的f-肌动蛋白重组会影响bcr的速度以及后续的bcr簇集和bcr信号传导
43
。为研究stat3缺失对b细胞早期激活(包括bcr簇集和信号复合体积累)的影响，我们使用全内反射荧光显微术(tirfm)观察经膜拴系抗原(mag)刺激的b细胞。脾脏b细胞经不同时间长度的mag激活后，用鬼笔环肽、pwasp、pcd19、pbtk、py和pship染色。在stat3 ko b细胞中，通过接触区内的平均荧光强度(mfi)测量的b细胞铺展和bcr簇集显著减少(图3e、图3g、图3h)。在stat3 ko b细胞的接触区内，f-肌动蛋白和pwasp的募集也显著减少(图3f、图3i、图3j)。此外，在b细胞接触区内，pcd19(图4a、图4d)、pbtk和py(图4b、图4e、图4f)信号复合体的募集显著减少，但在stat3 ko b细胞中，pship的募集有所增强(图4c、图4g)。综上所述，这些结果表明stat3缺乏减少了由wasp在质膜上介导的f-肌动蛋白的募集，从而导致bcr簇集和bcr信号传导的减少，而这可能是由于缺乏将bcr隔离成簇的驱动力。
[0081]
stat3缺乏降低pi3k-akt-mtorc1介导的代谢信号传导通路。
[0082]
pi3k参与代谢信号传导通路，并且是btk激活的直接下游效应子
44
。因此，我们检查了由pi3k介导的mtorc1和mtorc2信号传导。首先，将经sag刺激的stat3 ko b细胞进行裂解并用ppi3k特异性抗体探测，并发现ppi3k水平降低(图5a)。接下来，我们使用类似条件检查了mtorc2信号传导分子，包括pakt和pfoxo1。经刺激后的stat3 ko b细胞中的pakt和pfoxo1水平也有所降低(图5a)。此外，经刺激后的stat3 ko b细胞中mtorc1和mtorc2的mtor共同亚基的磷酸化水平也有所降低(图5a)。最后，通过检查ps6水平确定了akt-mtorc1的下游激酶的激活。我们发现ps6水平也降低了(图5a)。由于mtorc活性与细胞代谢高度相关，我们利用seahorse xf技术对氧化磷酸化进行实时分析。耗氧率(ocr)用作氧化磷酸化的量度。首先用寡霉素处理细胞以阻断线粒体atp的产生，然后用羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙(fccp)处理细胞以诱导最大耗氧量，再用鱼藤酮加抗霉素处理细胞以抑制电子传递链。用sag刺激细胞后，stat3 ko b细胞的基础和最大呼吸速率均低于wt b细胞(图5b)。我们还使用膜联蛋白v和cell trace violet染色通过流式细胞术检查受lps或cpg脉冲的b细胞的增殖和凋亡，并发现stat3ko b细胞的增殖有所增加(图5c、图5d)，但膜联蛋白v的表达未见差异(图5e、图5f)。因此，stat3 ko b细胞在受到刺激时不存在增殖缺陷，也不会衰弱和因
凋亡而死亡。总之，这些结果意味着stat3缺乏抑制了b细胞代谢来对bcr刺激作出响应。
[0083]
来自stat3 lof患者的记忆b细胞破坏了早期激活。
[0084]
cd19的激活对记忆b细胞的早期激活至关重要
45
，并且为确定stat3缺乏对人记忆b细胞早期激活的影响，我们通过tirfm检查了hc和stat3 lof患者的b细胞在经mag刺激时的bcr簇集和b细胞铺展。与hc的记忆b细胞相比，stat3 lof患者的记忆b细胞(鉴定为cd27

)的接触面积显著减少(图6a、图6d)。与hc相比，stat3 lof患者的记忆b细胞接触区内的bcr簇集也显著减少(图6a、图6e)。接下来，我们通过鬼笔环肽染色来检查记忆b细胞中的肌动蛋白重组，并发现来自stat3 lof患者的记忆b细胞接触区内的肌动蛋白积累显著减少(图6a、图6f)。为进一步确定stat3缺乏对记忆b细胞中信号复合体募集的影响，我们检查了接触区内的py和pcd19水平。与hc相比，stat3 lof患者的记忆b细胞接触区内的py和pcd19水平显著降低(图6b、图6c、图6g、图6h)。这些结果表明stat3缺乏阻断了记忆b细胞的早期激活。我们通过不同的抗体染色组合进一步分析了stat3 lof和gof患者的免疫表型。有趣的是，我们发现stat3 lof和gof患者的记忆b细胞的百分比显著降低，而stat3 lof和gof患者的初始b细胞的百分比却有所增加(图6i、图6j)。值得注意的是，stat3 lof患者的过渡b细胞的频率显著增加，而stat3 gof患者的过渡b细胞的频率显著降低。最后，stat3lof和gof患者的浆母细胞的百分比均有所降低(图6i、图6j)。接下来，我们研究了在体外stat3缺乏对初始b细胞向记忆b细胞过渡的影响。将来自stat3 lof患者的pbmc用sag刺激5min，并针对igd和cd27进行染色。我们发现在stat3 lof患者中，初始b细胞(igd

cd27-)的频率显著降低，而记忆b细胞(igd-cd27-)的频率显著升高(图6k、图6l)。这些结果表明，缺乏stat3的初始b细胞易形成记忆b细胞，这可能符合stat3 lof患者的高ige模型。
[0085]
stat3缺乏通过增强mirna146a-14-3-3σ轴导致高ige。
[0086]
先前的研究表明，mirna146a通过上调14-3-3σ表达促进ige转换
18
。为确定stat3是否调节mirna146a-14-3-3σ轴，我们使用rt-pcr和免疫印迹检查了stat3 ko小鼠或stat3 lof患者的b细胞中mirna146a和14-3-3σ的表达。有趣的是，stat3 ko b细胞中mirna146a和14-3-3σ的mrna水平增强(图7a)，并且stat3 ko小鼠b细胞中14-3-3σ蛋白的表达也显著增加(图7c)。在stat3 ko小鼠中发现的表型在stat3 lof患者中得到重现(图7b、图7c)。在机制上，我们使用chip发现stat3通过结合14-3-3σ启动子来调节14-3-3σ表达(图7d)。为进一步证实stat3通过中心枢纽14-3-3σ调节bcr信号传导、ige产生和b细胞分化，将stat3 ko b细胞或小鼠分别在体外或体内用14-3-3σ抑制剂肽r18处理。我们发现，在stat3 ko b细胞中，诸如pakt和pfoxo1等bcr信号传导分子的水平被挽救到wt b细胞的程度(图7e、图7f)。另外，我们分析了经14-3-3σ抑制剂处理的stat3 ko小鼠外周血b细胞亚类、ige

b细胞和ige血清的百分比，并且发现除mz b细胞(图8f、图8g)外，fo(图7g、图7h)、gc(图7i、图7j)和ige

b细胞(图7k、图7l)的百分比在静息态和激活态下均被挽救至wt小鼠的程度。此外，注射了14-3-3σ抑制剂的stat3 ko小鼠的血清ige滴度(图7m)也被挽救。这些结果表明stat3-mirna146a-14-3-3σ轴对bcr信号传导、ige产生以及fo和gc b细胞分化是重要的。
[0087]
讨论
[0088]
stat3缺乏导致hies，但其潜在分子机制尚不清楚。通过使用stat3缺失的小鼠模型和患者样品研究b细胞发育的早期阶段，我们发现fo、mz和gc b细胞的分化被破坏。令人振奋的是，stat3 ko小鼠中在体外的ige

b细胞生成和ige同种型转换均有增强，从而证明
该模型是研究stat3缺乏引起的高ige的分子机制的最佳模型。另外，我们发现stat3破坏了正向和负向bcr信号传导的平衡，并减少了bcr信号传导。在机制上，我们发现在初始b细胞中，bcr簇集、b细胞铺展和bcr信号复合体募集减少，这可能是由于缺乏来自肌动蛋白的驱动力。此外，在stat3缺乏的细胞中，记忆b细胞的早期激活(包括b细胞铺展、bcr簇集和bcr信号复合体募集)也有所减少。在机制上，我们发现决定ige同种型转换的关键因素是stat3 ko b细胞中14-3-3σ表达的增强，以及其上游介导物mirna146a。有趣的是，我们发现体外或体内抑制14-3-3σ可以将stat3 ko b细胞或stat3 ko小鼠的bcr信号传导和ige产生挽救到正常水平。这是首次报道stat3 ko b细胞中14-3-3σ表达增强。
[0089]
14-3-3σ在b细胞中的作用此前已被研究过。14-3-3σ缺乏小鼠具有减少的外周血b细胞(如fo、mz和再循环b细胞)以及非t细胞依赖性抗原应答
46
。在stat3 ko小鼠中，虽然14-3-3σ表达增强了，但mz b细胞却减少了，这表明14-3-3σ的最佳表达对外周血b细胞的稳态至关重要。14-3-3σ缺乏小鼠经抗igm刺激后，pakt和perk1/2信号传导减少了
46
。我们的stat3 ko小鼠在抗原刺激下，近侧和远侧bcr信号传导也减少了。这也表明14-3-3σ的最佳表达对正常bcr信号传导是重要的。
[0090]
bcr信号传导与ige产生之间的关系仍有待阐明。dock8患者患有hies，并且我们发现dock8缺乏的b细胞中bcr信号传导水平降低
15
。类似地，在stat3患者中，我们还发现dock8表达减少且bcr信号传导水平降低。这些结果意味着，bcr信号传导的减少可导致ige同种型转换。先前的研究表明，bcr交联通过添加具有il-4的lps来阻断igg1和ige的类别转换
47
。
[0091]
在我们的研究中，14-3-3σ抑制剂r18对stat3 ko b细胞中bcr信号传导的抑制减少了ige的产生。因此，我们确定低bcr信号传导有利于ige同种型转换。我们还发现stat3表达对记忆b细胞的早期激活至关重要。值得注意的是，stat3 lof和gof患者的记忆b细胞均有减少而初始b细胞均有增加，这表明stat3的最佳表达对于维持b细胞的记忆应答至关重要。
[0092]
剩下的一个问题就是stat3调节bcr信号传导的详细分子机制。stat3ko b细胞中cd19、btk和ship的转录水平完全没有改变，这表明stat3不会调节近侧bcr信号传导基因的转录。关键在于，要使用chip测定和stat3抗体作为诱饵来寻找目标基因的调节区。stat3已被证明与诸如nf-kb、rela、hif1a、jun、stat1、mtor和icos等若干蛋白质相互作用
26、48-53
。
[0093]
一个矛盾是stat3患者的记忆b细胞减少了，但stat3 ko初始b细胞却毫无缘由地易形成记忆b细胞，这可能是由于一种补偿机制。先前的研究表明，记忆b细胞可能需要较少的stat3活性来对细胞因子作出响应，从而进行浆母细胞分化
35
。我们的结果证明，stat3-ko初始b细胞易于变成记忆b细胞和ige转换型浆母细胞；这可能是由于mirna146a和14-3-3σ蛋白具有较高表达。我们需要进一步确定stat3 ko b细胞中激活诱导脱氨酶(aid)的表达。但stat3患者的记忆b细胞为何减少仍不明确。最近的一项研究表明，mtorc1缺乏导致ag特异性记忆b细胞以及浆细胞和gc b细胞减少
54
。我们的结果表明，stat3 ko b细胞中mtorc1和mtorc2活性均降低，并且stat3-mtorc轴调节记忆b细胞的形成。此外，stat3 ko初始b细胞的代谢活性较低，这可能是初始b细胞向记忆b细胞转换的原因。
[0094]
总体来说，我们的研究通过使用优化的小鼠模型和患者样品揭示了stat3患者高ige综合征的潜在机制。stat3 ko小鼠中14-3-3σ表达的增强导致增加的ige

b细胞生成和较低的bcr信号传导。
[0095]
参考文献
[0096]
1.yuan zl,guan yj,wang l,wei w,kane ab,chin ye.central role of the threonine residue within the p 1loop of receptor tyrosine kinase in stat3constitutive phosphorylation in metastatic cancer cells.mol cell biol 2004；24:9390-400.
[0097]
2.takeda k,noguchi k,shi w,tanaka t,matsumoto m,yoshida n,et al.targeted disruption of the mouse stat3 gene leads to early embryonic lethality.proc natl acad sci u s a1997；94:3801-4.
[0098]
3.yang xo,panopoulos ad,nurieva r,chang sh,wang d,watowich ss,et al.stat3 regulates cytokine-mediated generation of inflammatory helper t cells.j biol chem 2007；282:9358-63.
[0099]
4.ma cs,chew gy,simpson n,priyadarshi a,wong m,grimbacher b,et al.deficiency of th17 cells in hyper ige syndrome due to mutations in stat3.j exp med 2008；205:1551-7.
[0100]
5.renner ed,rylaarsdam s,anover-sombke s,rack al,reichenbach j,carey jc,et al.novel signal transducer and activator of transcription 3(stat3)mutations,reduced t(h)17cell numbers,and variably defective stat3phosphorylation in hyper-ige syndrome.j allergy clin immunol 2008；122:181-7.
[0101]
6.al khatib s,keles s,garcia-lloret m,karakoc-aydiner e,reisli i,artac h,et al.defects along the t(h)17 differentiation pathway underlie genetically distinct forms of the hyper ige syndrome.j allergy clin immunol 2009；124:342-8,8 e1-5.
[0102]
7.mcilwain dr,grusdat m,pozdeev vi,xu hc,shinde p,reardon c,et al.t-cell stat3 is required for the maintenance of humoral immunity to lcmv.eur j immunol 2015；45:418-27.
[0103]
8.levy de,loomis ca.stat3 signaling and the hyper-ige syndrome.n engl j med 2007；357:1655-8.
[0104]
9.minegishi y,saito m,tsuchiya s,tsuge i,takada h,hara t,et al.dominant-negative mutations in the dna-binding domain of stat3 cause hyper-ige syndrome.nature 2007；448:1058-62.
[0105]
10.milner jd,vogel tp,forbes l,ma ca,stray-pedersen a,niemela je,et al.early-onset lymphoproliferation and autoimmunity caused by germline stat3 gain-of-function mutations.blood 2015；125:591-9.
[0106]
11.zhang q,davis jc,lamborn it,freeman af,jing h,favreau aj,et al.combined immunodeficiency associated with dock8 mutations.n engl j med 2009；361:2046-55.
[0107]
12.yang l,fliegauf m,grimbacher b.hyper-ige syndromes:reviewing pgm3 deficiency.curr opin pediatr 2014；26:697-703.
energy transfer.nat immunol 2005；6:1168-76.
[0121]
26.huang l,zhang y,xu c,gu x,niu l,wang j,et al.rictor positively regulates b cell receptor signaling by modulating actin reorganization via ezrin.plos biol 2017；15:e2001750.
[0122]
27.seeley-fallen mk,liu lj,shapiro mr,onabajo oo,palaniyandi s,zhu x,et al.actin-binding protein 1 links b-cell antigen receptors to negative signaling pathways.proc natl acad sci u s a2014；111:9881-6.
[0123]
28.liu c,miller h,hui kl,grooman b,bolland s,upadhyaya a,et al.a balance of bruton's tyrosine kinase and ship activation regulates b cell receptor cluster formation by controlling actin remodeling.j immunol 2011；187:230-9.
[0124]
29.sharma s,orlowski g,song w.btk regulates b cell receptor-mediated antigen processing and presentation by controlling actin cytoskeleton dynamics in b cells.j immunol 2009；182:329-39.
[0125]
30.chou wc,levy de,lee ck.stat3 positively regulates an early step in b-cell development.blood 2006；108:3005-11％uhttp://www.bloodjournal.org/cgi/doi/10.1182/blood-2006-05-024430.
[0126]
31.fornek jl,tygrett lt,waldschmidt tj,poli v,rickert rc,kansas gs.critical role for stat3 in t-dependent terminal differentiation of igg b cells.blood 2006；107:1085-91.
[0127]
32.ding c,chen x,dascani p,hu x,bolli r,zhang hg,et al.stat3 signaling in b cells is critical for germinal center maintenance and contributes to the pathogenesis of murine models of lupus.j immunol 2016；196:4477-86.
[0128]
33.speckmann c,enders a,woellner c,thiel d,rensing-ehl a,schlesier m,et al.reduced memory b cells in patients with hyper ige syndrome.clin immunol 2008；129:448-54.
[0129]
34.meyer-bahlburg a,renner ed,rylaarsdam s,reichenbach j,schimke lf,marks a,et al.heterozygous signal transducer and activator of transcription 3 mutations in hyper-ige syndrome result in altered b-cell maturation.j allergy clin immunol 2012；129:559-62,62 e1-2.
[0130]
35.deenick ek,avery dt,chan a,berglund lj,ives ml,moens l,et al.naive and memory human b cells have distinct requirements for stat3activation to differentiate into antibody-secreting plasma cells.j exp med 2013；210:2739-53.
[0131]
36.takeda k,kaisho t,yoshida n,takeda j,kishimoto t,akira s.stat3 activation is responsible for il-6-dependent t cell proliferation through preventing apoptosis:generation and characterization of t cell-specific stat3-deficient mice.j immunol 1998；161:4652-60.
[0132]
37.jing y,kang d,liu l,huang h,chen a,yang l,et al.dedicator of cytokinesis protein 2 couples with lymphoid enhancer-binding factor 1 to regulate expression of cd21 and b-cell differentiation.j allergy clin immunol 2019.
[0133]
38.pillai s,cariappa a.the follicular versus marginal zone b lymphocyte cell fate decision.nat rev immunol 2009；9:767-77.
[0134]
39.cariappa a,tang m,parng c,nebelitskiy e,carroll m,georgopoulos k,et al.the follicular versus marginal zone b lymphocyte cell fate decision is regulated by aiolos,btk,and cd21.immunity 2001；14:603-15.
[0135]
40.thomas md,srivastava b,allman d.regulation of peripheral b cell maturation.cell immunol 2006；239:92-102.
[0136]
41.carruthers nj,stemmer pm,chen b,valeriote f,gao x,guatam sc,et al.phosphoproteome and transcription factor activity profiling identify actions of the anti-inflammatory agent utl-5g in lps stimulated raw 264.7 cells including disrupting actin remodeling and stat-3 activation.eur j pharmacol 2017；811:66-73.
[0137]
42.grimbacher b,holland sm,puck jm.hyper-ige syndromes.immunol rev 2005；203:244-50.
[0138]
43.song w,liu c,upadhyaya a.the pivotal position of the actin cytoskeleton in the initiation and regulation of b cell receptor activation.biochim biophys acta 2014；1838:569-78.
[0139]
44.kikuchi h,kuribayashi f,takami y,imajoh-ohmi s,nakayama t.gcn5 regulates the activation of pi3k/akt survival pathway in b cells exposed to oxidative stress via controlling gene expressions of syk and btk.biochem biophys res commun 2011；405:657-61.
[0140]
45.depoil d,fleire s,treanor bl,weber m,harwood ne,marchbank kl,et al.cd19 is essential for b cell activation by promoting b cell receptor-antigen microcluster formation in response to membrane-bound ligand.nat immunol 2008；9:63-72.
[0141]
46.su yw,hao z,hirao a,yamamoto k,lin wj,young a,et al.14-3-3sigma regulates b-cell homeostasis through stabilization of foxo1.proc natl acad sci u s a 2011；108:1555-60.
[0142]
47.jabara hh,chaudhuri j,dutt s,dedeoglu f,weng y,murphy mm,et al.b-cell receptor cross-linking delays activation-induced cytidine deaminase induction and inhibits class-switch recombination to ige.j allergy clin immunol 2008；121:191-6 e2.
[0143]
48.ysebrant de lendonck l,eddahri f,delmarcelle y,nguyen m,leo o,goriely s,et al.stat3 signaling induces the differentiation of human icos( )cd4 t cells helping b lymphocytes.plos one 2013；8:e71029.
[0144]
49.jung je,kim hs,lee cs,shin yj,kim yn,kang gh,et al.stat3 inhibits the degradation of hif-1alpha by pvhl-mediated ubiquitination.exp mol med 2008；40:479-85.
[0145]
50.zhang x,wrzeszczynska mh,horvath cm,darnell je,jr.interacting regions in stat3 and c-jun that participate in cooperative transcriptional activation.mol cell biol 1999；19:7138-46.
[0146]
51.yu z,zhang w,kone bc.signal transducers and activators of transcription 3(stat3)inhibits transcription of the inducible nitric oxide synthase gene by interacting with nuclear factor kappab.biochem j 2002；367:97-105.
[0147]
52.xia l,wang l,chung as,ivanov ss,ling my,dragoi am,et al.identification of both positive and negative domains within the epidermal growth factor receptor cooh-terminal region for signal transducer and activator of transcription(stat)activation.j biol chem 2002；277:30716-23.
[0148]
53.yokogami k,wakisaka s,avruch j,reeves sa.serine phosphorylation and maximal activation of stat3 during cntf signaling is mediated by the rapamycin target mtor.curr biol 2000；10:47-50.
[0149]
54.raybuck al,cho sh,li j,rogers mc,lee k,williams cl,et al.b cell-intrinsic mtorc1 promotes germinal center-defining transcription factor gene expression,somatic hypermutation,and memory b cell generation in humoral immunity.j immunol 2018；200:2627-39.