一种磁性靶向的药物的制备方法与流程

1.本发明属于医用药物技术领域，尤其涉及一种磁性靶向的药物的制备方法。


背景技术：

2.长期以来，肺纤维化被认为是一种进行性发展、基本上不可逆的病理改变。确诊后的5年内，患者病死率超过50%。特发性肺纤维化的定义为原因不明、出现在成人、局限于肺、进行性致纤维化的间质性肺炎，临床表现为不明原因的慢性活动后呼吸困难、咳嗽等，少数急性加重的患者短时间内呼吸困难和呼吸衰竭。吸烟、环境暴露、微生物因素、胃食管反流、遗传因素的等均是潜在致病高危因素。肺纤维化的主要病理特征是成纤维细胞过度增值、活化，细胞外基质沉积增多，并伴有炎症损伤和组织结构破坏、最终导致患者肺功能丧失和呼吸衰竭。肺纤维化疾病危害严重、病死率高、临床治疗措施匮乏，因此，在深入了解其发病机制基础上开发新的抗纤维化、缓解症状的药物迫在眉睫。
3.以糖皮质激素和免疫抑制剂联合的治疗方案，作为主流治疗方案已经在临床沿用多年，但该方案存在严重的不良反应和副作用。肺纤维化的急性加重期常常需要大剂量糖皮质激素冲击联合免疫抑制剂治疗，根据病情和疗效逐渐减少至小剂量糖皮质激素联合免疫抑制剂。患者大剂量长时间服用这些药物会引起严重的毒副作用，因此研发一种新的药物递送方法，使药物用量减少、血液中浓度降低，同时提高药物分子在靶器官的富集并提高有效浓度至关重要。
4.可穿戴磁靶向技术是近年来发展起来的一种体外辅助控制药物递送的方法。主要原理是在外加磁场的作用下引导磁性纳米载体在靶器官富集，具有简便、无损伤、增加药物滞留率及降低全身毒副作用等优点。作为磁性靶向技术的核心，磁性纳米载体药物的设计尤为重要，需要根据药物分子的特性和治疗机理，选择适当载体并建立合理复合方法。基于磁靶向的治疗肺纤维化的思路，设计并制备一种磁靶向纳米药物复合粒子，以达到减少药物用量、毒副作用，提高药物靶向性、治疗效果的目的，是非常必要的。
5.目前，肺纤维化的治疗仍主要以糖皮质激素和免疫抑制剂联合为主。在肺纤维化患者中，有一定比例患者在疾病相对稳定的过程中突发急性加重，是影响肺纤维化患者预后和导致患者死亡的一个重要因素。目前急性加重期患者的治疗是大剂量糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗，根据患者病情和效果逐步减至维持量，而稳定期患者也常常采用小剂量糖皮质激素联合免疫抑制剂进行维持治疗。
6.现有的治疗方案，无论是短时间大剂量激素冲击治疗还是长时间小剂量激素维持治疗都会给患者带来严重的毒副作用。糖皮质激素进入血液后，在抑制肺部纤维化炎症反应的同时，作用于全身各个系统及器官引起感染、钠水潴留、骨质疏松及免疫抑制等不良反应。免疫抑制剂在对机体的免疫反应进行抑制的同时，常常会到引起骨髓抑制、脱发、膀胱炎等。由于药物上述的毒副作用严重影响了对肺纤维化的治疗效果及疾病预后。现有的治疗方案均无法做到药物在靶器官富集、减少药物毒副作用、提高靶器官的治疗效果。


技术实现要素：

7.本发明实施例的目的在于提供一种磁性靶向的药物的制备方法，旨在解决现有的肺纤维化治疗方案，无论是短时间大剂量激素冲击治疗还是长时间小剂量激素维持治疗都会给患者带来严重的毒副作用，且均无法做到药物在靶器官富集、减少药物毒副作用、提高靶器官的治疗效果的问题。
8.本发明实施例是这样实现的，一种磁性靶向的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：通过高温热分解法制备油酸修饰的fe3o4纳米粒子(nps)；步骤2：通过水包油的微乳液模板法制备fe3o4超粒子(sps)；步骤3：fe3o4/mps/ctx@pda超粒子(sps)的合成。
9.进一步的技术方案，所述步骤1的具体步骤包括：步骤1.1：将1mmol 乙酰丙酮铁、2.5mmol 1,2-十六烷醇、5 ml十八烯、3mmol油酸、3mmol 油胺依次加入圆底三颈烧瓶中，抽真空，然后在氮气保护下搅拌15 min后，将反应溶液升温至200 ℃并反应30 min；步骤1.2：以3℃/min的速率升温至265 ℃并反应30 min；步骤1.3：待反应溶液冷却至室温后加入15ml正已烷和20ml无水乙醇沉淀洗涤三次，离心后的固体产物使用甲苯分散，得到油酸修饰的fe3o4纳米粒子。
10.进一步的技术方案，所述步骤2的具体步骤包括：步骤2.1：将12.5 ml的5 mg/ml的十二烷基硫酸钠(sds)水溶液与4 ml的7 mg/ml 的fe3o4纳米粒子甲苯溶液加入到三颈烧瓶中，然后置于超声搅拌水浴加热装置中；步骤2.2：在室温条件下，超声搅拌10 min使fe3o4纳米粒子甲苯溶液在水中均匀分散，60 ℃水浴加热条件下至甲苯完全挥发，得到fe3o4超粒子的水溶液。
11.进一步的技术方案，所述步骤3的具体步骤包括：将10 ml fe3o4超粒子水溶液、2 ml 6 mg/ml的盐酸多巴胺(da)水溶液、10 mg环磷酰胺(ctx)、10 mg甲强龙（mps）依次加入40 ml三羟甲基氨基甲烷（tris）（10mm，ph=8.5）水溶液中，放置于摇床上室温震荡4.0h后离心取得产物。
12.进一步的技术方案，所述fe3o4纳米粒子为粒径范围在4nm-6nm的近球形粒子。
13.进一步的技术方案，所述fe3o4超粒子为粒径范围在60nm-80nm的球型结构。
14.本发明实施例提供的一种磁性靶向的药物的制备方法，所制备的fe3o4/mps/ctx@pda sps抗肺纤维化磁性靶向纳米药物复合粒子具有超顺磁性，粒子的粒径范围在70nm-95nm，壳层的厚度6.0-7.5nm，mps和ctx负载率分别为8.7%和6.3%，在实际应用于肺纤维化治疗中，提高mps和ctx药物在靶器官富集并释放药物，同时减低药物所致毒副作用。
附图说明
15.图1为3.1制备的fe3o
4 nps的透射电镜照片，尺寸为4-6 nm；图2为3.3制备的fe3o4/mps/ctx@pda sps的透射电镜照片，尺寸为70-95 nm；图3为4中不同浓度的fe3o
4 /mps/ctx@pda sps对ealy926细胞的毒性；图4为5中未穿戴和穿戴磁靶向设备的小鼠肺部fe3o
4 /mps/ctx@pda sps的富集量。
具体实施方式
16.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
17.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
18.1. 实验材料乙酰丙酮铁(纯度≥99.9%)、1,2-十六烷醇（纯度90%）、十八烯(ode，纯度90%)、油酸（oa，纯度90%）、油胺（ola，纯度70%）、盐酸多巴胺（da，99%）购自美国sigma-aldrich公司。甲苯（分析纯）购自北京化工厂。无水乙醇（分析纯）、正己烷（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司（京试）。十二烷基硫酸钠（sds，化学纯）购自国药集团化学试剂有限公司（沪试）。三羟甲基氨基甲烷（tris，纯度≥99.9%）、环磷酰胺（ctx，纯度97%）购自阿拉丁试剂有限公司。注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（mps，40 mg/支）由美国辉瑞公司生产。磷酸缓冲溶液（pbs，粉剂）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。细胞实验培养基采用sigma高糖rpmi-1640、血清采用gemini胎牛血清。动物实验采用辽宁长生生物技术股份有限公司km小鼠（雄性，28d龄）。所有试剂均直接使用，未做进一步纯化处理。所有实验步骤中配置样品与洗涤样品均使用无水乙醇和去离子水。
19.2. 分析测试仪器h-800型透射电子显微镜（tem），日本hitachi公司。rt-6000型酶标分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司。icp-5000型电感耦合等离子体原子发射光谱仪（icp-aes），杭州聚光科技股份有限公司。
20.3. 复合超粒子的制备3.1. fe3o4纳米粒子(nps)合成首先通过热分解法制备油酸(oa)修饰的fe3o
4 nps。将1mmol 乙酰丙酮铁、2.5mmol 1,2-十六烷醇、5 ml 十八烯(ode)、3mmol 油酸(oa)、3mmol 油胺(ola)依次加入圆底三颈烧瓶中，抽真空、氮气保护下搅拌15 min后，将反应溶液升温至200℃并反应30 min。然后以3℃/min的速率升温至265 ℃并反应30 min。待反应溶液冷却至室温后加入15ml正已烷和20ml 无水乙醇沉淀洗涤三次，离心后的固体产物使用甲苯分散，得到oa修饰的fe3o
4 nps。
21.利用本法合成的nps为近球形粒子，尺寸分布较均一，粒径范围在4nm-6nm。fe3o
4 nps表面修饰了oa，因此该nps可分散在甲苯等疏水溶剂中。
22.3.2. fe3o
4 超粒子(sps)合成进一步通过水包油的微乳液模板法制备fe3o
4 sps。将12.5 ml 5 mg/ml的十二烷基硫酸钠(sds)水溶液与4 ml 7 mg/ml的fe3o
4 nps甲苯溶液加入到三颈烧瓶中，置于超声搅拌水浴加热装置中。室温超声搅拌10 min使甲苯溶液在水中均匀分散，60 ℃水浴加热条件下至甲苯完全挥发，得到fe3o
4 sps的水溶液。
23.利用本法合成得到的fe3o
4 sps为粒径范围在60nm-80nm的球型结构，由fe3o
4 nps聚集而成。
24.3.3. fe3o4/mps/ctx@pda sps合成在室温条件下水溶液中制备了fe3o4/mps/ctx@pda sps。将10 ml fe3o
4 sps水溶液、2 ml 6 mg/ml 的盐酸多巴胺(da)水溶液、10 mg环磷酰胺(ctx)、10 mg甲强龙 mps依次
加入40 ml三羟甲基氨基甲烷（tris）（10mm，ph=8.5）水溶液中，放置于摇床上室温震荡4.0h后离心取得产物。
25.利用本法合成得到的fe3o4/mps/ctx@pda sps为粒径范围在70nm-95nm的球，表面能够清晰的观察到厚度6.0-7.5nm的pda壳层。
26.4. 细胞毒性试验在37 ℃、5% co2条件下将人肠系膜下腔动脉血管内皮细胞（ealy926细胞）以每孔5000个的密度接种在96孔板中，24h后将ealy926细胞与浓度分别为0，25，50，100，150，200 μg/ml的fe3o4/mps/ctx@pda sps共培养。24h后通过cck-8法检测细胞相对存活率。
27.fe3o4/mps/ctx@pda sps的毒性较低，材料浓度达到200μl/ml时，细胞存活率为85.3%，仍处于较高水平。
28.5. 动物磁性靶向实验km小鼠体内磁性靶向实验分为对照组和实验组两组，每组包含5只小鼠。在两组实验中，小鼠的给药方式和剂量相同，均为经尾静脉注射60 μl含有300 μg fe3o4/mps/ctx@pda sps的生理盐水。对照组不穿戴磁性靶向设备，实验组穿戴磁性靶向设备。24h后，对两组小鼠进行安乐死，解剖获取小鼠肺脏，微波消解后，用去离子水稀释。使用icp-aes测得溶液中铁离子含量，用于反映fe3o4/mps/ctx@pda sps在肺部的富集程度，验证磁性靶向效果。
29.可穿戴磁靶向设备组中，fe3o4/mps/ctx@pda sps在肺部的滞留率9.81%id/g，未穿戴磁靶向设备组中的滞留率8.93%id/g。fe3o4/mps/ctx@pda sps具有良好的磁性靶向肺部富集作用，在磁性靶向肺纤维化治疗中具有潜在的应用价值。
30.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。