一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物的制作方法

1.本发明属于微生物技术以及益生菌健康食品或药品领域，具体涉及一种拮抗幽门螺旋杆 菌的组合物。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，简称hp)，是一种革兰氏阴性菌。菌体单极、多鞭 毛、末端钝圆，长2.5～4.0μm、宽0.5～1.0μm，微需氧，螺旋形弯曲的细菌。生存于人胃部 及十二指肠的各区域内。幽门螺旋杆菌生存于胃内绒毛下，能分泌产生氨，其在胃内的生存 微环境偏微碱性，因此其能在胃内ph1-3的环境下生存；它是引起胃黏膜轻微的慢性发炎， 甚或导致胃炎及十二指肠溃疡与胃癌的元凶。幽门螺旋杆菌感染造成的肠胃疾病给患者的健 康生活造成了巨大影响。
3.目前，临床上主要采用使用三联或四联疗法来清除幽门螺旋杆菌而对其引起的胃肠疾病 进行治疗；包括一种铋剂、一种抗酸药物和一种或两种抗生素联合用药，而采用抗生素治疗 容易出现食欲减退、上腹不适、恶心、大便颜色发黑、上腹烧灼、疼痛等不适感；同时长期 使用容易造成人体对抗生素产生耐药性等表现。
4.国内外也有采用益生菌来治疗幽门螺旋杆菌的报道，如嗜酸乳杆菌la-1，酪酸梭菌 cgmcc0313.1等菌株，采用单一的乳酸菌分泌产生的细菌素对幽门螺旋杆菌的杀菌效果较 弱，所以单一采用乳酸菌类益生菌来治疗幽门螺旋杆菌的应用效果并不都尽如人意；而采用 益生菌和植物精油组合来清除幽门螺旋杆菌，国内外尚未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，所述的拮抗幽门螺旋杆菌的组合物包含植物乳杆菌 (lactobacillus plantarum)组分和玫瑰茄植物精油组分。
8.优选地，所述的拮抗幽门螺旋杆菌的组合物中植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)组 分的重量百分含量为5％-95％；玫瑰茄植物精油组分的重量百分含量为5％-95％。
9.优选地，所述的拮抗幽门螺旋杆菌的组合物中植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)组 分的重量百分含量为50％；玫瑰茄植物精油组分的重量百分含量为50％。
10.进一步地，所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)组分为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)活菌干菌粉或植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)死菌及其代谢产物混合干粉。
11.进一步地，所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)活菌干粉是由菌体和冷冻干燥 保护剂组成；其中保护剂干重占菌体干重的重量百分比为20-80％。
12.进一步地，所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)死菌及其代谢产物混合干粉是 由死菌体及其代谢产物和载体组成；其中载体干重占菌体及其代谢产物干重的重量百分比为 20-80％。
13.优选地，所述的冷冻干燥保护剂由脱脂奶粉、海藻糖、麦芽糊精、甘油、乳糖、谷氨酸 钠、l-半胱氨酸盐酸、维生素c中的至少三种组成。
14.优选地，所述的载体由玉米淀粉、马铃薯淀粉、水溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精、变 性淀粉、抗性糊精中的一种或多种组成。
15.进一步地，所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)为hh-lp78保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏单位地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏号为cctcc no：m2021723， 保藏日期为2021年6月15日。
16.进一步地，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hh-lp78分离自传统发酵泡菜； 该菌株经测序分析，其16srrna序列如seq id no.1所示，将测序得到的序列与nt数据库 进行比对，获得近源物信息，为植物乳杆菌，菌株号为hh-lp78。
17.进一步地，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hh-lp78在mrs固体培养基上 菌落呈白色、偶尔呈浅黄或深黄色，表面光滑、中央凸起、呈圆形。
18.进一步地，所述的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hh-lp78的菌体形态呈圆端直 杆型，大小为0.8～1.0μm
×
4.0～7.0μm；
19.进一步地，所述的玫瑰茄植物精油组分是经包被材料包被处理的玫瑰茄植物精油的固体 形态，所述的包被材料干重占植物精油的重量百分比为25％-75％。
20.进一步地，所述的包被材料为天然高分子材料包括β-环糊精、麦芽糊精、抗性淀粉、海 藻酸钠、阿拉伯胶、黄原胶、壳聚糖或明胶中的至少一种。
21.所述的玫瑰茄植物精油是从玫瑰茄植物种子和花萼中提炼出的植物挥发油。
22.玫瑰茄(hibiscus sabdariffa linn)是锦葵科木槿属植物。一年生直立草本，高达2米， 茎淡紫色，无毛。叶异型，下部的叶卵形，不分裂，上部的叶掌状3深裂，裂片披针形。花 单，生于叶腋，近无梗；小苞片8-12，红色，肉质，披针形。蒴果卵球形，直径约1.5厘米， 密被粗毛，果爿5；种子肾形，无毛；已有研究证明，玫瑰茄精油中含有丰富的多酚、原花 青素和高量植物有机酸，具有清热、解渴、降血压的作用；能够有效减少病菌在黏膜表面的 附着，改善长期较顽固的大肠杆菌与白色念珠菌的侵扰，其具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、 保护肝脏和保护心血管的作用。
23.本发明经体外抑菌试验证明，从玫瑰茄植物种子以及花萼张中提取的玫瑰茄精油具有强 烈地杀灭幽门螺旋杆菌的效果；但其在胃内很难直接接触到幽门螺旋杆菌，从而很难发挥其 应有的杀菌效果。
24.本发明的植物乳杆菌分泌抗菌物质如植物乳杆菌素等细菌素，具有拮抗幽门螺旋杆菌的 作用，同时，植物乳杆菌菌体与幽门螺旋杆菌菌体有特异性结合位点，玫瑰茄精油与植物乳 杆菌组合物通过植物乳杆菌与幽门螺旋杆菌受体蛋白特异性结合，杀菌物质就能直接作用到 幽门螺旋杆菌菌体，起到强烈杀菌作用；
25.本发明的有益效果
26.本发明提供了一种拮抗幽门螺旋杆菌的植物乳杆菌hh-lp78，保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏号为cctcc no：m2021723。将该植物乳杆菌与玫瑰茄精油构成组合物，
可作 为益生菌健康食品和药品，植物乳杆菌与玫瑰茄精油在拮抗幽门螺旋杆菌中协同作用，采用
ꢀ“
生物占位，化合物拮抗”原理，清除人胃幽门螺旋杆菌，受试人群临床试服，统计清除率 ≥53％，且无不良反应。
具体实施方式
27.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述，实施例中所述的试验方法若 无特殊说明均为常规方法，所述的试剂和生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得； 同时下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
28.实施例1
29.植物乳杆菌hh-lp78菌株的筛选以及鉴定
30.1.菌种筛选
31.取自然发酵酸菜醪液，在超净工作台上进行无菌操作，用接种针蘸取发酵醪液1环，转 接在mrs琼脂固体培养基上，进行划线操作，36℃～38℃培养24～48h，再挑取单菌落，用 显微镜镜检有无杂菌。如菌落不纯，重复上述划线操作，直至单菌落镜检无杂菌为止。该菌 菌落白色、偶尔呈浅黄或深黄色，表面光滑、中央凸起、呈圆形。菌体形态呈圆端直杆型， 通常为0.8～1.0μm
×
4.0～7.0μm，单个、成对或短链状。
32.所述的mrs琼脂固体培养基由葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、乙 酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.25％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、吐温
ꢀ‑
80 0.1％、琼脂1.8％组成，ph6.8～7.0；
33.用mrs液体培养基培养菌种可获得发酵菌液，保藏得到菌株hh-lp78。
34.2.菌种鉴定
35.分离、纯化菌种：经16srrna基因作为marker片段，通用引物扩增出基因中16srrna 序列，再进行电泳检测，使用3730xl测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件， 通过软件组装后，与nt数据库进行比对，获得近源物信息，为植物乳杆菌，菌株编号为 hh-lp78，其16srrna特征序列如seq id no.1所示：
[0036][0037]
3.菌种保藏
[0038]
植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hh-lp78，保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏号为cctcc no：m2021723，保藏日期为2021年6月15日。
[0039]
实施例2
[0040]
植物乳杆菌hh-lp78菌体干粉制备：
[0041]
将植物乳杆菌经发酵培养获得发酵液、发酵液经离心、乳化、冷冻干燥、粉碎生产工艺 条件制备植物乳杆菌hh-lp78活性菌体干粉，备用；
[0042]
所述发酵培养基为mrs液体培养基，其由葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏 0.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.25％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、 吐温-80 0.1％组成，ph6.8～7.0。所述冷冻干燥保护剂按照固含量百分比即为脱脂奶粉50％、 麦芽糊精30％、乳糖20％。其中保护剂干重占菌体干重的重量百分比为20-80％。
[0043]
植物乳杆菌hh-lp78死菌体及其代谢产物的混合干粉的制备：
[0044]
将植物乳杆菌经发酵培养获得发酵液、发酵液经三效降膜浓缩或低温真空浓缩，向浓缩 液中添加载体后经喷雾干燥制备死菌体及其代谢产物的混合干粉，备用；
[0045]
所述发酵培养基为mrs液体培养基，其由葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏 0.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.25％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、 吐温-80 0.1％组成，ph6.8～7.0；所述喷雾干燥载体为麦芽糊精；麦芽糊精干重占菌体及其代 谢产物干重的重量百分比为20-80％；
[0046]
实施例3
[0047]
玫瑰茄植物精油组分的制备：用传统方法从玫瑰茄植物种子和花萼中提炼出来玫瑰茄植 物挥发油，植物挥发油经包被材料包被处理后即可获得固体形态玫瑰茄植物精油组分；所述 的包被材料干重占植物精油的重量百分比为25％-75％；所述包被材料按照固含量百分比即为 β-环糊精90％、明胶10％。
[0048]
实施例4
[0049]
植物乳杆菌对幽门螺旋杆菌的拮抗作用
[0050]
(1)幽门螺旋杆菌菌液制备
[0051]
取幽门螺旋杆菌保存菌种，活化后转接于幽门螺旋杆菌增菌液体增菌培养基(蛋白胨 1％、牛脑浸出粉1％、牛心浸出粉0.9％、氯化钠0.5％、葡萄糖0.2％、磷酸氢二钠0.25％， ph7.4
±
0.2)中，装量为50ml三角瓶装40ml液体培养基，35℃-37℃厌氧培养。将上述培养 好菌液用无菌生理盐水稀释，调整菌悬液吸光值od
600nm
为1.0(用紫外分光光度计测定)； 同时用无菌生理盐水做空白对照。
[0052]
(2)幽门螺旋杆菌检测培养基制备
[0053]
在幽门螺旋杆菌增菌液体培养基中加入2％纯琼脂粉，制备成固体培养基。将已灭菌的幽 门螺旋杆菌固体培养基置室温待其冷却至48-50℃时，按100ml上述无菌固体培养基加入 100μl菌悬液(od
600nm
＝1.0)，迅速摇匀；吸取含菌固体培养基10ml，迅速移至φ90mm培 养皿中，使其在φ90mm培养皿底内均匀摊布，放置在水平台面上使其凝固备用。
[0054]
(3)植物乳杆菌待测样制备
[0055]
取实施例2中制备获得的植物乳杆菌hh-lp78活性菌体干粉或死菌体及其代谢产物的混 合干粉，用适量无菌生理盐水溶解，溶解后室温静止15分钟，倒出上清液，备用。
[0056]
(4)抑菌效果测定
[0057]
将制备好的幽门螺旋杆菌检测培养基，用已经灭菌处理过的打孔器(孔径φ2.7mm)打 孔，取3个平板每板至少打1孔，重复3板；重复上述操作制作3组板；
[0058]
分别用无菌针筒吸取植物乳杆菌hh-lp78活性菌体干粉上清液、植物乳杆菌hh-lp78 死菌体及其代谢产物的混合干粉上清液以及mrs液体培养基(阴性对照组)，每孔中分别加 入5ul的上述待测样品溶液，置于35℃-37℃培养箱中，厌氧培养24h后，观察测量抑菌圈大 小，结果记录于表1。
[0059]
表1.植物乳杆菌hh-lp78菌体干粉对幽门螺旋杆菌的抑菌圈大小
[0060]
组别平均抑菌圈大小(φmm)mrs液体培养基2.7植物乳杆菌活性菌体干粉5.6植物乳杆菌死菌体及其代谢产物的混合干粉7.8
[0061]
由表1数据可以看出，植物乳杆菌死菌体及其代谢产物的混合干粉对幽门螺旋杆菌的抑 菌效果优于植物乳杆菌活性菌体干粉。
[0062]
实施例5
[0063]
一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，其是由以下重量百分比的原料组成：5％植物乳杆菌 hh-lp78组分和95％玫瑰茄植物精油组分；
[0064]
其中，所述的植物乳杆菌hh-lp78组分是植物乳杆菌hh-lp78死菌体及其代谢产物的 混合干粉(实施例2方法制备)，该混合干粉中载体干重占菌体及其代谢产物干重重量百分 比为60％；所述的植物精油组分中包被材料干重占植物精油的重量百分比为65％。
[0065]
实施例6
[0066]
一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，其是由以下重量百分比的原料组成：25％植物乳杆菌 hh-lp78组分和75％玫瑰茄植物精油组分；
[0067]
其中，所述的植物乳杆菌hh-lp78组分是植物乳杆菌hh-lp78死菌体及其代谢产物的 混合干粉(实施例2方法制备)，该混合干粉中载体干重占菌体及其代谢产物干重重量百分 比为60％；所述的植物精油组分中包被材料干重占植物精油的重量百分比为65％。
[0068]
实施例7
[0069]
一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，其是由以下重量百分比的原料组成：50％植物乳杆菌 hh-lp78组分和50％玫瑰茄植物精油组分；
[0070]
其中，所述的植物乳杆菌hh-lp78组分是植物乳杆菌hh-lp78死菌体及其代谢产物的 混合干粉(实施例2方法制备)，该混合干粉中载体干重占菌体及其代谢产物干重重量百分 比为60％；所述的植物精油组分中包被材料干重占植物精油的重量百分比为65％。
[0071]
实施例8
[0072]
一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，其是由以下重量百分比的原料组成：65％植物乳杆菌 hh-lp78组分和35％玫瑰茄植物精油组分；
[0073]
其中，所述的植物乳杆菌hh-lp78组分是植物乳杆菌hh-lp78死菌体及其代谢产物的 混合干粉(实施例2方法制备)，该混合干粉中载体干重占菌体及其代谢产物干重重量百分 比为60％；所述的植物精油组分中包被材料干重占植物精油的重量百分比为65％。
[0074]
实施例9
[0075]
一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，其是由以下重量百分比的原料组成：95％植物乳杆菌 hh-lp78组分和5％玫瑰茄植物精油组分；
[0076]
其中，所述的植物乳杆菌hh-lp78组分是植物乳杆菌hh-lp78死菌体及其代谢产物的 混合干粉(实施例2方法制备)，该混合干粉中载体干重占菌体及其代谢产物干重重量百分 比为60％；所述的植物精油组分中包被材料干重占植物精油的重量百分比为65％。
[0077]
实施例10
[0078]
一种拮抗幽门螺旋杆菌的组合物，其是由以下重量百分比的原料组成：50％植物乳杆菌 hh-lp78组分和50％玫瑰茄植物精油组分；
[0079]
其中，所述的植物乳杆菌hh-lp78组分是植物乳杆菌hh-lp78活菌体干粉，该干粉混 合物中保护剂干重占菌体干重重量百分比为60％；所述的植物精油组分中包被材料干重占植 物精油的重量百分比为65％。
[0080]
临床试验
[0081]
将本发明的拮抗幽门螺旋杆菌的组合物用于感染幽门螺旋杆菌患者的治疗，受试人群为 检测幽门螺旋杆菌感染为阳性(同位素c
13
或c
14
呼吸仪检测)的患者；选取在病情、性别等 无显著差异且无其他基础疾病的患者210例(具有可比性)，随机分为7组，每组30例，其 中1组为对照组，2-7组为试验组；对照1组给予常规三联疗法，(奥美拉唑20mg/次，每 日2次；阿莫西林胶囊，每次2粒(500mg)，每日2次，甲硝唑片，每次2粒(400mg)， 每日2次；)；试验组2-7组分别口服本发明实施例5-10中的拮抗幽门螺旋杆菌的组合物； 每天早晚各服用一次，每次2g，治疗2周后，c
14
呼吸仪进行检测，检测转阴人群数，统计 幽门螺旋杆菌的清除率；患者服药期间以及治愈后跟踪观察记录患者的病情，统计分析结果 如表2所示(差异显著性p《0.05)。
[0082]
表2.
[0083]
组别组合物清除率/％不良反应率/％1对照组196.67
±
2.73a93.33
±
3.30a2实施例560.00
±
2.12d3.33
±
0.22b3实施例666.67
±
2.08
c0±
0.00b4实施例776.67
±
1.63
b0±
0.00b5实施例866.67
±
1.88
c0±
0.00b6实施例953.33
±
0.98
e0±
0.00b7实施例1066.67
±
2.36
c0±
0.00b[0084]
由表2数据可以看出，本发明的组合物用于感染幽门螺旋杆菌患者的治疗，幽门螺旋杆 菌的清除率达到了53％以上，表现出良好的治疗效果，且患者不存在不良反应；治愈患者停 药后无复发；
[0085]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。