快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条的制作方法

1.本发明属于诊断材料领域，具体涉及一种快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条。


背景技术：

2.新冠病毒的快速检测显得至关重要，目前采用较多的是核酸检测，通常需要数小时。
3.免疫检测可以实现对新冠肺炎患者体内的特异性抗体的特异性检测，目前快速免疫检测常用的手段就是免疫层析试纸条。常见的免疫层析试纸条包括胶体金免疫层析试纸条、量子点荧光纳米球免疫层析试纸条。而相较于胶体金而言，量子点荧光纳米球的灵敏度较高，可通过机器检测也可通过人眼识别。
4.然而，如上所述，通常的免疫检测所针对的是特异性抗体，而不是病毒自身。对于需要检测病毒的情况(例如检测环境病毒残留，或者患者抗体水平较低的情形等)来说，这样的检测手段就无法达到检测目的。


技术实现要素：

5.本发明是为了解决上述问题而进行的，提供了一种能够对新冠病毒进行快速特异性检测的量子点纳米球免疫层析试纸条。
6.本发明提供了一种快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，其特征在于，包括：底板，以及依次设置在底板上的样品垫、结合垫、反应垫以及吸水垫，其中，样品垫用于加样本，结合垫包被有由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体，其中，反应垫上包被有第二新冠病毒n蛋白检测抗体，形成为t线，反应垫上还包被有covid-19重组蛋白，形成为c 线，t线相对地更靠近结合垫，c线相对地更靠近吸水垫。
7.本发明提供的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，还可以包括：样品稀释液，用于稀释样本，该样品稀释液为包括质量体积百分比为0.05％牛血清白蛋白和2％triton x-100的pbs缓冲液。
8.本发明提供的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，还可以具有这样的技术特征，其中，样品垫为经过预处理的玻璃纤维膜，预处理的过程为：采用样品垫预处理液浸泡预定时间，然后干燥，样品垫预处理液为包括质量体积百分数为0.25％的tween 20、0.1％的牛血清白蛋白和0.25％的pvp的pbs溶液。
9.本发明提供的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，还可以具有这样的技术特征，其中，第二新冠病毒n蛋白检测抗体的工作浓度为1mg/ml。
10.本发明提供的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，还可以具有这样的技术特征，其中，吸水垫为棉绒浆滤纸。
11.本发明提供的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条的制备过程可以包括如下步骤：
12.步骤s2-1，将第二新冠病毒n蛋白检测抗体以及covid-19重组蛋白包被在硝酸纤维素膜上，分别形成t线以及c线；
13.步骤s2-2，将由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体溶液涂在玻璃纤维膜上，干燥得到结合垫片；
14.步骤s2-3，用样品垫预处理液浸泡玻璃纤维膜，干燥得到样品垫片；
15.步骤s2-4，将结合垫片、样品垫片以及作为吸水垫片的棉绒浆滤纸裁剪至适当的宽度，裁剪出尺寸合适的pvc片作为底板片，然后在底板片上依次粘贴裁剪后的反应垫片、结合垫片、样品垫片以及吸水垫片，再进行适当裁剪后即得。
16.进一步，上述步骤s2-4的粘贴过程还可以是：将样品垫的靠近结合垫的一端搭接在结合垫上，结合垫的靠近反应垫的一端搭接在反应垫上，且吸水垫的靠近反应垫的一端搭接在反应垫上，该三处搭接部分长度均为1mm-2mm。
17.发明的作用与效果
18.根据本发明所涉及的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，由于样品垫、结合垫、反应垫以及吸水垫依次设置，结合垫包被有由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体，反应垫上设有由第二新冠病毒n蛋白检测抗体形成的t线以及由covid-19重组蛋白形成的c线，且t 线相对地更靠近结合垫，因此，样本溶液被加载至样品垫后，将流动至结合垫处，带动结合垫处的量子点往吸水垫方向移动，同时溶液中的抗原(如果存在的话) 会与第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体相结合，形成含有该抗体、抗原以及量子点的结合物；继续移动到达反应垫时，结合物中的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体将被第二新冠病毒n蛋白检测抗体捕获而被固定在t线处，多余的、未与第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体结合的量子点则会被 covid-19重组蛋白结合而被固定在c线处。
19.因此，当样本溶液中存在新冠n蛋白(即存在新冠病毒颗粒)时，在t线以及c线处均会有量子点荧光纳米球被固定；当样品中不存在新冠n蛋白时，t 线处不会有量子点荧光纳米球滞留，c线处则会存在量子点荧光纳米球。由于量子点荧光纳米球对常规紫外线即可测试，使用紫外灯笔进行照射或成像仪器检测即可以发现，阳性样本的检测结果为t、c线处均有亮光；阴性样本的检测结果为t线处不亮，c线处较亮。由此，即可通过t线以及c线的相对亮度判定样本溶液中是否存在新冠病毒颗粒。
20.采用本发明的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条，不仅能够直接对新冠病毒进行检测，相比于现有技术的新冠病毒检测方法还具有如下优势：
21.(1)检测方法简单易行，不需要训练即可操作，结果不易判断出错；
22.(2)与elisa、western blot等常规检测方法相比，检测速度快，通常20min 即可出结果；
23.(3)通过常见紫外灯照射可以直接通过肉眼观察或者通过仪器检测均可进行判读，且试纸条结构简单，因此实施成本低、制造成本低。
附图说明
24.图1是本发明的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条的结构图。
25.图2是本发明测试例的不同稀释倍数样本的检测试纸条在多功能成像系统中成像
的照片。
具体实施方式
26.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。以下实施例以及测试例中，所有试剂通过常规商业途径购得。
27.《实施例1》
28.本实施例提供了由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体的制备方法。
29.本实施例的制备方法包括如下步骤：
30.步骤s1-1，对量子点荧光纳米球进行活化。具体操作为：将量子点荧光纳米球放入ph为6.0的mes缓冲液中，加入10mg/ml edc进行活化，30min后离心机离心，去除上清，采用ph为6.0的mes缓冲液重悬。
31.步骤s1-2，将步骤s1-1得到的量子点荧光纳米球与第一新冠n蛋白检测抗体进行偶联。具体操作为：将步骤s1-1得到的重悬后的量子点荧光纳米球加入到第一新冠n蛋白检测抗体溶液中，室温孵育1h，得到偶联溶液；
32.步骤s1-3，在量子点荧光纳米球偶联第一新冠n蛋白检测抗体后进行封闭。具体操作为：将牛血清白蛋白封闭液加入到步骤s1-2所得到的偶联溶液中混匀，离心机离心去上清，洗涤一次，加入量子点荧光纳米球复溶液进行重悬，即得由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体溶液。
33.其中，量子点荧光纳米球复溶液为含有0.5％tween 20(w/v)、20％蔗糖 (w/v)、0.1％牛血清白蛋白(w/v)的pbs溶液。
34.另外，本实施例中，步骤s1-1所使用的量子点荧光纳米球的粒径为120nm。
35.《实施例2》
36.本实施例提供了采用实施例1的由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n 蛋白检测鼠单克隆抗体溶液制备检测试纸条的方法。
37.图1是本发明的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条的侧视结构图。如图1所示，本发明提供的快速检测新冠病毒的量子点纳米球免疫层析试纸条(以下简称检测试纸条)10包括底板1以及依次设置在底板1上表面的样品垫2、结合垫3、反应垫4以及吸水垫7。
38.其中，样品垫2用于加待测的样本，结合垫3包被有由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体(即实施例1制备得到的偶联有第一新冠n蛋白检测抗体的量子点荧光纳米球混悬液)，反应垫4上包被有第二新冠病毒n蛋白检测抗体以及covid-19重组蛋白。同时，第二新冠病毒n蛋白检测抗体形成t线5、covid-19重组蛋白形成c线6，二者中，t线5相对地更靠近结合垫3，c线6相对地更靠近吸水垫7，使得层析过程中样本溶液先经过t线5，再经过c线6。
39.本实施例所提供的检测试纸条1的制备方法包括如下步骤：
40.步骤s2-1，制备用于形成反应垫4的反应垫片，具体操作为：将第二新冠病毒n蛋白检测抗体、covid-19重组蛋白包被在硝酸纤维素膜上，分别形成t 线5以及c线6，作为反应
垫片干燥备用。
41.步骤s2-2，制备用于形成结合垫3的结合垫片，具体操作为：将实施例1 所得的由量子点荧光纳米球标记的第一新冠病毒n蛋白检测鼠单克隆抗体溶液涂在玻璃纤维膜上，干燥得到结合垫片，然后放置在低湿度环境中备用。
42.步骤s2-3，制备用于形成样品垫2的样品垫片，具体操作为：用样品垫预处理液浸泡处理玻璃纤维膜，干燥得到样品垫片，然后放置在低湿度环境中备用。其中，样品垫预处理液为包括质量体积百分数为0.25％的tween 20、0.1％的牛血清白蛋白和0.25％的pvp的pbs溶液。
43.步骤s2-4，组装检测试纸条10，具体操作为：将结合垫片、样品垫片以及作为吸水垫片的棉绒浆滤纸裁剪至适当的宽度，裁剪出尺寸合适的pvc片作为底板片，然后在底板片上依次粘贴裁剪后的反应垫片、结合垫片、样品垫片以及吸水垫片，再进行适当裁剪后，得到结构如图1所示的检测试纸条10。
44.其中，为保证层析效果，粘贴过程中，将样品垫2靠近结合垫3的一端搭接在结合垫3上，结合垫3靠近反应垫4的一端搭接在反应垫4上，且吸水垫7 靠近反应垫4的一端搭接在反应垫4上，该三处搭接结构的搭接部分长度均为 1mm-2mm。
45.《测试例》
46.本测试例为实施例2制备得到的检测试纸条10对新冠病毒检测能力的测试。
47.具体操作为：
48.使用样本稀释液将covid-19重组蛋白(含量为0.3mg/ml)进行稀释，最终得到阴性样本(不含covid-19重组蛋白)、50000倍稀释、10000倍稀释、5000 倍稀释、1000倍稀释、500倍稀释、100倍稀释的标准品。其中，样本稀释液为含有0.05％牛血清白蛋白(w/v)和2％triton x-100(w/v)的pbs缓冲液。
49.然后，取多根检测试纸条10，将上述不同稀释倍数的标准品溶液各滴入到检测试纸条10的样品垫2上，静置20min后使用紫外灯笔进行照射，通过肉眼观察或者使用仪器进行检测。
50.图2是本发明测试例的不同稀释倍数样本的检测试纸条在紫外灯照射下的照片。图2中，(1)为阴性样本，(2)-(7)分别为50000倍稀释、10000倍稀释、5000倍稀释、1000倍稀释、500倍稀释、100倍稀释的标准品。
51.如图2所示，在紫外灯笔照射下，各检测试纸条10中，对应于阴性样本的检测试纸条10的c线6最亮，t线5不亮；随着标准品浓度升高，检测试纸条 10中c线6逐渐变暗，t线5逐渐变亮。结果表明本发明的检测试纸条10具有较好的浓度依赖性，能够应用在实际的新冠病毒检测中。应用时，具体检测操作可以按如下步骤进行：
52.步骤s3-1，采集检测样本，使用样本稀释液稀释样品至80μl-100μl；
53.步骤s3-2，取出检测试纸条10置于操作台上；
54.步骤s3-3，将稀释后的检测样本加入至样品垫2中，等待20min；
55.步骤s3-4，使用紫外灯笔照射或仪器检测反应垫4的t线5、c线6处，根据二者的相对亮度判读结果。
56.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般
原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。