载透明质酸与白藜芦醇介孔硅及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于生物医学工程领域，具体涉及载透明质酸与白藜芦醇介孔硅及其制备方法与应用。


背景技术：

2.介孔硅(msns)大多指的是具有2-50nm孔径的无定形氧化硅材料.，不同的合成方法、丰富的硅醇基表面和优异的介孔结构使msns具有粒径可调、功能化简单、比表面积大、孔体积大、孔径均匀等特点。这些特性使得msns成为药物递送应用的优良载体。白藜芦醇(resveratrol,简称res)又称为芪三酚,属于天然多酚类化合物,是植物为了应对如细菌或真菌入侵、紫外线辐射、外伤及压力等产生的植物抗毒素。研究发现它是某些草药治疗炎症、脂类代谢和心脏疾病的有效成分。然而由于水溶性和溶解性差，其生物利用度不足，这极大地限制了其治疗效果。透明质酸是人体皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一,有“天然保湿因子”之称。透明质酸作为一种天然的生物大分子物质,具有优异的生物相容性、独特的分子结构、超强锁水保湿特性及在体内存在透明质酸受体等特点。中国专利——一种氧化白藜芦醇纳米乳液及其制备方法与应用的制备方法是先将氧化白藜芦醇溶于食品级油相中，然后将食品用表面活性剂溶于水相中，并边搅拌边缓慢加入上述油相溶液，待完全加入后加速搅拌一段时间，最后经高压均质得到氧化白藜芦醇纳米乳液，将白藜芦醇制备成纳米乳液形式从而增加其稳定性与水溶性，进而发挥美白作用。通过将白藜芦醇制备成白藜芦醇纳米乳液是一种提高白藜芦醇溶解度的好方法，微乳虽然具有诸多优势，但是由于黏附力差、涂展性不佳，在皮肤上难以长时间滞留等缺陷，使其应用受限。同时，微乳溶液对温度和盐浓度的变化敏感，当低于或高于可形成微乳的临界温度或盐浓度时，微乳结构可能被破坏，最终发生相分离。与纳米微乳相比，介孔硅性质稳定，不易受到外界条件的影响，在储存上具有优势。


技术实现要素：

3.本发明提供了载透明质酸与白藜芦醇介孔硅及其制备方法，并将其用于生物医学领域。
4.本发明要解决的问题是，将透明质酸与白藜芦醇负载于棒状介孔硅上，与白藜芦醇单药相比，大大增强了其清除自由基的能力，并且具有更长的释药时间。同时负载透明质酸之后，使其具有更好的保湿与修护作用。
5.本发明是通过以下技术方案来实现的:
6.载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)介孔硅的制备方法：将十六烷基三甲基氯化铵(ctac)水溶液与水、碱性溶液加热搅拌反应，然后加入正硅酸乙酯(teos)，继续搅拌反应，反应结束后，进行离心，乙醇洗涤，水洗后置于真空干燥箱干燥，待干燥完成后转移至马弗炉中干燥，得到介孔硅；
8.(2)介孔硅的氨基化修饰：将步骤(1)得到的介孔硅第一次加入异丙醇，超声，再向
其中第二次加入异丙醇，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，加热搅拌，搅拌完成后离心，异丙醇洗涤，冻干，得到氨基化修饰的介孔硅；
9.(3)介孔硅的透明质酸修饰：将透明质酸钠加入缓冲液中，水合完全后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺，反应结束后，随后加入氨基化修饰的介孔硅，搅拌，离心，水洗后进行冷冻干燥，得到透明质酸修饰的介孔硅；
10.(4)载药方法：将透明质酸修饰的介孔硅加入到旋转蒸发瓶里，接着加入白藜芦醇的醇溶液，超声，使两者充分接触，然后干燥得到粉末，最终获得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅，精密称取载透明质酸与白藜芦醇介孔硅分散在水里，超声，离心后上清液过滤，测吸光度。
11.进一步地，介孔硅的制备方法：将1ml的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)水溶液与120ml的水、0.876ml 2m的naoh在80℃下搅拌1h，后加入1ml的正硅酸乙酯，反应两小时后，进行离心，乙醇洗2次，水洗2次后置于真空干燥箱干燥，待干燥完成后转移至马弗炉，600℃干燥5h。
12.进一步地，介孔硅的氨基化修饰：将0.2g介孔硅加入20ml异丙醇超声30min，将异丙醇补充至100ml，加入2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷,80℃下搅拌24h，离心，异丙醇洗数次，冻干。
13.进一步地，介孔硅的透明质酸修饰：将012g的透明质酸钠加入ph5.5的pbs溶液中，水合完全后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺，在600℃反应1h，随后加入30mg氨基修饰后的纳米粒，常温搅拌24h，离心，水洗2次后进行冷冻干燥。
14.进一步地，载药方法：将10mg介孔硅纳米载体加入到旋转蒸发瓶里，接着加入5ml浓度为30mg/ml的白藜芦醇乙醇溶液，超声30分钟，使两者充分接触。然后再利用旋转蒸发仪，旋转蒸发2小时获得干燥粉末。收集到的产物放到真空干燥箱里干燥过夜，最终获得终产物载药介孔硅纳米载体。精密称取10.0mg装载白藜芦醇的介孔硅分散在10ml的去离子水里，超声30min，离心后上清液用0.22um的微孔滤膜过滤下，用紫外分光光度计在305nm处测吸光度。
15.进一步地，所述载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的介孔硅形状、孔径均一，热稳定性好，具有良好的生物相容性，大的载药量与缓慢的药物释放速度，载药后其大大增加了白藜芦醇的生物利用度，同时具有保湿的作用。
16.进一步地，步骤(1)所述碱性溶液为naoh溶液或氨水；步骤(1)所述碱性溶液的浓度为1.5～2.5mol/l；步骤(1)中十六烷基三甲基氯化铵(ctac)、正硅酸乙酯(teos)、碱的摩尔比值为1：(5～6.6)：(2～2.6)；步骤(1)所述加热的温度为75～85℃；步骤(1)所述加热的时间为0.5～1.5h；步骤(1)所述继续搅拌反应的时间为1.5～2.5h；步骤(1)所述干燥的温度为550-600℃。
17.进一步地，步骤(2)所述介孔硅与3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)的质量比为1：(5～14)；步骤(2)所述超声的时间为10～30min；步骤(2)所述介孔硅的质量与第一次加入异丙醇的体积比为0.005～0.015g/ml；步骤(2)所述第一次加入异丙醇与第二次加入异丙醇的体积比为0.10～0.4；步骤(2)所述加热的温度为75～80℃；步骤(2)所述加热的时间为20～28h。
18.进一步地，步骤(3)所述透明质酸钠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比值为1：(1～2):(1～2)。
19.进一步地，步骤(3)所述缓冲液为pbs缓冲液、hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液或tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液；步骤(3)所述缓冲液的ph值为5～6；步骤(3)所述透明质酸钠与氨基化修饰的介孔硅的质量比为(2-6)：1。
20.进一步地，步骤(3)所述反应的时间为1-3h；步骤(3)所述搅拌的时间为20-28h。
21.进一步地，步骤(4)所述白藜芦醇的醇溶液为白藜芦醇的乙醇溶液或白藜芦醇的甲醇溶液；步骤(4)所述白藜芦醇的醇溶液的浓度为25～35mg/ml；步骤(4)所述透明质酸修饰的介孔硅与白藜芦醇的质量比为1：(12.5-17.5)；步骤(4)所述超声的时间为10-30min。
22.本发明提供了所述制备方法制备得到的载透明质酸与白藜芦醇介孔硅。
23.进一步地，所述制备方法所制备的载药系统能够增加白藜芦醇水溶性与生物利用度，从而进一步增强清除紫外照射所产生的活性氧的能力。同时由于其具有透明质酸，因此具有优秀的保湿抗氧化作用。
24.本发明还提供了所述载透明质酸与白藜芦醇介孔硅用于生物医学中。
25.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
26.(1)本发明所制备的载透明质酸与白藜芦醇介孔硅形状、孔径均一，热稳定性好，具有良好的生物相容性，大的载药量与缓慢的药物释放速度。
27.(2)本发明所制备的载透明质酸与白藜芦醇介孔硅载透明质酸后其分散性得到了优化，进一步载白藜芦醇后具有良好的抗氧化能力。
28.(3)本发明提供了一种用于涉及一种用于补水抗氧化的载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的制备方法，与先前的专利进行对比，在改善其水溶性与稳定性的基础上，增加了具有保湿特性的透明质酸，在应用时，不仅可以发挥其抗氧化的作用，并且由于透明质酸的加入，也兼有保湿修护的作用。其二，由于人体皮肤真皮层等组织存在透明质酸，透明质酸的加入导致载透明质酸与白藜芦醇介孔硅生物相容性增强，从而增强了其保湿抗氧化的作用。
附图说明
29.图1为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的sem(扫描电子显微镜)图。
30.图2为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的直径分布图。
31.图3分别为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅和白藜芦醇的药物体外释放图。
32.图4为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅处理的细胞活性图。
33.图5分别为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅与白藜芦醇清除ros能力图。
具体实施方式
34.以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常
规产品。所述的ctac购自sigma-aldrich，白藜芦醇、透明质酸钠、正硅酸乙酯、naoh粉、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷购自阿拉丁公司，naoh水溶液为实验室配置。
35.实施例1
36.(1)介孔硅的制备方法：将1ml十六烷基三甲基氯化铵(ctac)水溶液(ctac水溶液的浓度为25wt％，0.756mol/l)与120ml的水、0.876ml 2m的naoh水溶液在80℃下搅拌1h，后加入1ml的正硅酸乙酯(98％的teos溶液，4.388mol/l)，反应2小时后，进行离心，乙醇洗2次，水洗2次后置于真空干燥箱干燥，待干燥完成后转移至马弗炉，600℃干燥5h，得到介孔硅；
37.(2)介孔硅的氨基化修饰：将0.2g介孔硅加入20ml异丙醇超声20min，将异丙醇补充至100ml，加入2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(4.2mol/l)，80℃下搅拌24h，离心，异丙醇洗数次，冻干，得到氨基化修饰的介孔硅；
38.(3)介孔硅的透明质酸修饰：将0.12g的透明质酸钠加入ph值为5.5的pbs缓冲液中，水合完全后加入86.26mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与51.8mgn-羟基丁二酰亚胺，在常温下反应2h，反应结束后，随后加入30mg氨基化修饰的介孔硅，常温搅拌24h，离心，水洗2次后进行冷冻干燥，得到透明质酸修饰的介孔硅。
39.(4)载药方法：将10mg透明质酸修饰的介孔硅加入到旋转蒸发瓶里，接着加入5ml浓度为25mg/ml的白藜芦醇的乙醇溶液，超声10分钟，使两者充分接触。然后再利用旋转蒸发仪，旋转蒸发2小时获得干燥粉末。收集到的产物放到真空干燥箱里干燥过夜，最终获得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅，精密称取10.0mg载透明质酸与白藜芦醇介孔硅分散在10ml的去离子水里，超声30min，离心后上清液用0.22um的微孔滤膜过滤下，用紫外分光光度计在305nm处测吸光度。
40.载药率％＝(载透明质酸与白藜芦醇介孔硅里白藜芦醇的质量/载透明质酸与白藜芦醇介孔硅质量)
×
100％
41.装载fitc的纳米粒制备：首先，将200mg msns(空白介孔硅)分散于10ml乙醇中。然后加入200μl aptes，在70℃、500rpm搅拌速率下持续搅拌12h。离心收集产物，用乙醇洗涤三次，50℃真空干燥。然后将500mg这些产物分散在10ml乙醇中，加入4.0mg fitc(异硫氰酸荧光素)，室温下以500rpm的搅拌速度搅拌24h。用乙醇洗涤三次，在50℃真空干燥后得到。
42.实施例2
43.将1ml十六烷基三甲基氯化铵(ctac)水溶液(ctac水溶液的浓度为25wt％，0.756mol/l)与120ml的水、0.784ml 2.5m的naoh水溶液在85℃下搅拌0.5h，后加入1.14ml的正硅酸乙酯(98％的teos溶液，4.388mol/l)，反应1.5小时后，进行离心，乙醇洗2次，水洗2次后置于真空干燥箱干燥，待干燥完成后转移至马弗炉，550℃干燥5h，得到介孔硅。
44.(2)介孔硅的氨基化修饰：将0.37g介孔硅加入25ml异丙醇超声30min，将异丙醇补充至275ml，加入2ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(4.2mol/l),75℃下搅拌28h，离心，异丙醇洗数次，冻干，得到氨基化修饰的介孔硅。
45.(3)介孔硅的透明质酸修饰：将0.12g的透明质酸钠加入ph值为6的hepes缓冲液中，水合完全后加入115mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与69mgn-羟基丁二酰亚胺，在常温下反应3h，反应结束后加入60mg氨基化修饰的介孔硅，常温搅拌28h，离
心，水洗2次后进行冷冻干燥，得到透明质酸修饰的介孔硅。
46.(4)载药方法：将10mg透明质酸修饰的介孔硅加入到旋转蒸发瓶里，接着加入5ml浓度为35mg/ml的白藜芦醇的甲醇溶液，超声30分钟，使两者充分接触。然后再利用旋转蒸发仪，旋转蒸发2小时获得干燥粉末。收集到的产物放到真空干燥箱里干燥过夜，最终获得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅，精密称取10.0mg载透明质酸与白藜芦醇介孔硅分散在10ml的去离子水里，超声30min，离心后上清液用0.22um的微孔滤膜过滤下，用紫外分光光度计在305nm处测吸光度。
47.载药率％＝(载透明质酸与白藜芦醇介孔硅里白藜芦醇的质量/载透明质酸与白藜芦醇介孔硅质量)
×
100％
48.实施例3
49.将1ml十六烷基三甲基氯化铵(ctac)水溶液(ctac水溶液的浓度为25wt％，0.756mol/l)与120ml的水、1ml 1.5m的氨水在75℃下搅拌1.5h，后加入0.85ml的正硅酸乙酯(98％的teos溶液，4.388mol/l)，反应2.5小时后，进行离心，乙醇洗2次，水洗2次后置于真空干燥箱干燥，待干燥完成后转移至马弗炉，575℃干燥5h，得到介孔硅。
50.(2)介孔硅的氨基化修饰：将0.136g介孔硅加入27ml异丙醇超声10min，将异丙醇补充至95ml，加入2ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷(4.2mol/l)，77.5℃下搅拌20h，离心，异丙醇洗数次，冻干，得到氨基化修饰的介孔硅。
51.(3)介孔硅的透明质酸修饰：将0.12g的透明质酸钠加入ph值为5的tris-hcl缓冲溶液中，水合完全后加入58mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与34.5mgn-羟基丁二酰亚胺，在常温下反应1h，反应结束后加入20mg氨基化修饰的介孔硅，常温搅拌20h，离心，水洗2次后进行冷冻干燥，得到透明质酸修饰的介孔硅。
52.(4)载药方法：将10mg透明质酸修饰的介孔硅加入到旋转蒸发瓶里，接着加入5ml浓度为30mg/ml的白藜芦醇的甲醇溶液，超声20分钟，使两者充分接触。然后再利用旋转蒸发仪，旋转蒸发2小时获得干燥粉末。收集到的产物放到真空干燥箱里干燥过夜，最终获得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅，精密称取10.0mg载透明质酸与白藜芦醇介孔硅分散在10ml的去离子水里，超声30min，离心后上清液用0.22um的微孔滤膜过滤下，用紫外分光光度计在305nm处测吸光度。
53.载药率％＝(载透明质酸与白藜芦醇介孔硅里白藜芦醇的质量/载透明质酸与白藜芦醇介孔硅质量)
×
100％
54.图1为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的sem(扫描电子显微镜)图。由图1可知空白纳米粒形态规则，呈圆球状，粒径分布均一。
55.图2为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的直径分布图。由图2可知纳米粒的粒径分布较为均一、直径大多在100nm左右，可以顺利的进入细胞并且发挥高渗透长滞留效应。
56.药物释放的能力：采用透析法检测载药系统中白藜芦醇的体外释放曲线。简单地说，释放是在磷酸缓冲盐溶液(pbs，ph值为7.4)中进行的。将白藜芦醇和实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅以10mg/ml的终浓度分散在pbs中，分别封装在透析袋(分子量截止值[mwco]10000kda)中，并在37℃和100rpm搅拌下浸入100ml pbs中。在预定的采样时间(2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h)，采集3ml样品，并添加等量的新鲜pbs。然后，对提取
的样品进行过滤、稀释，并在305nm处用uvevis分光光度计(紫外分光光度计)进行分析。
[0057]
图3分别为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅和白藜芦醇的药物体外释放图。由图3可知与白藜芦醇对比，载透明质酸与白藜芦醇介孔硅释放白藜芦醇的速度较慢，具有缓释的作用。
[0058]
细胞活性测试：采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵(mtt)比色法测定细胞活力。hacat细胞以8
×
103细胞接种-1在96孔板中。分别将0、20μm、40μm、60μm、80μm、100μm的实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅处理24小时，然后，移除培养基并用mtt(噻唑蓝)溶液(0.5mg/ml)在37℃下培养4小时后，100μl二甲基亚砜溶解甲赞晶体，并使用微孔板读取器(cytation 5，biotek，usa)在490nm处测量吸光度。
[0059]
图4为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅处理的细胞活性图。由图4可知随着载透明质酸与白藜芦醇介孔硅的浓度增加，细胞活性降低，并且具有显著的差距。
[0060]
细胞摄取：将1
×
105hacat细胞培养在12孔板中，24h后，移除培养基并装载fitc(异硫氰酸荧光素)的纳米粒培养1小时、2小时、4小时和8小时。在不同的暴露时间后，细胞被pbs清洗，用胰蛋白酶-edta溶液(0.25％v/v)消化、离心后,采用bd-c6流式细胞仪(bdc6)(facs)记录结果。对于每个实验，每个样本共选通10000个细胞，每个样本进行三次。
[0061]
清除ros(活性氧)的能力：hacat细胞以5
×
10^5密度铺板，24h后在6孔板中分别加入实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅、白藜芦醇，无血清培养基培养12h后，uvb(10w紫外灯)照射30min后，24h后用活性氧试剂盒进行检测。
[0062]
图5分别为实施例1所得载透明质酸与白藜芦醇介孔硅与白藜芦醇清除ros能力图。由图5可知经h
202
诱导过后，细胞内ros的水平显著增强。从结果图上看，白藜芦醇能够降低细胞内ros的水平。载透明质酸与白藜芦醇介孔硅与白藜芦醇相比，清除细胞内ros水平的能力更加显著。说明构建纳米载药系统后，增强了白藜芦醇的清除自由基的能力。
[0063]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。