一种基于固相糖蛋白富集和Tn糖肽酶切的分析方法和应用与流程

一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物分子分析试剂技术领域，具体涉及一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析(spgale)方法和应用。


背景技术：

2.tn糖肽是一种肿瘤相关碳水化合物抗原，通常不在外周组织或血细胞中表达。在大多数人类癌症中均发现了该抗原，其表达源于正常o-糖基化合成途径的阻断，其中聚糖从常见的前体galnac-ser/thr(tn糖肽)延伸。tn糖肽是一种截短的o-聚糖，体积小结构简单。它在人体中具有非生理性聚糖结构，因此它可被免疫系统识别为外来物。tn糖肽测试可以在任何活检发现癌症之前检测到大多数癌症。由于tn糖肽是血液和皮肤细胞表面的蛋白质，可以被免疫系统抗体识别，因此可以作为诊断或预后的疾病生物标志物。这些抗原的浓度因癌症类型和阶段而异。然而很少有方法可用于详细鉴定癌症中完整蛋白质被o-galnac修饰，尤其是在其早期阶段。在本发明中，我们开发了一种化学酶促方法来鉴定o-galnac位点及其相关糖蛋白。这些糖蛋白是潜在的癌症生物标志物。
3.因此，有必要研发一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法和应用来解决现有技术中鉴定tn糖肽糖蛋白标志物的问题。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法和应用。
5.本发明的一种技术方案是：
6.一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法，包括步骤：
7.1)固相结合；
8.2)tn糖肽确定；
9.3)tn糖肽位点确定。
10.进一步的，在步骤1)中，所述固相结合是指糖肽制备和与球状树脂共价固相结合，包括步骤：
11.(1)蛋白质提取和浓度测量：
12.在细胞中加入ripa裂解液、蛋白酶抑制剂，用超声破碎仪破碎后获得样本，将所述样本放入冰中冷却，反复这一步骤直至样本澄清为止；
13.取所述样本，用去离子水稀释，用pierce bca蛋白定量分析试剂盒测试所述样本中的蛋白浓度；
14.(2)蛋白酶解
15.根据所述样本测定的蛋白浓度，取所述样本溶于尿素去离子水溶液中，轻微振荡，确保所述样本中的蛋白完全溶解；
16.在所述样本中加入二硫苏糖醇溶液反应；
17.再加入碘乙酰胺溶液暗室反应；
18.用去离子水将所述样本稀释，加入碳酸氢铵溶液；
19.加入测序级胰蛋白酶，轻微振荡样本至水解，此时样本中包含多肽；
20.(3)多肽纯化
21.在样本中加入三氟乙酸(tfa)，直至样本ph下调至2-3；
22.c18萃取柱预处理后，加入样本至c18萃取柱中，经过萃取柱的过滤液收集，再将此过滤液加入到同一个c18萃取柱，以增加样本中多肽的回收率；
23.用tfa清洗萃取柱至过滤液去除，用乙腈洗脱样本中的多肽；
24.将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化的多肽；
25.(4)糖肽氧化和固相结合
26.将多肽重新溶于tfa和acn溶液，加入氧化剂高碘酸钠反应，使多肽中糖肽上的各种糖氧化，得到氧化的糖肽；
27.将所述氧化的糖肽真空冷冻干燥，重新溶于tfa，使用c18纯化氧化的糖肽和余下的多肽后，将氧化的糖肽和余下的多肽溶于tfa；
28.取表面具有酰肼或氨基的球状树脂，加入到离心管中，将球状树脂预处理，将氧化的糖肽与球状树脂结合，在室温下反应2-4小时；
29.对球状树脂清洗，得到纯化的结合有氧化糖肽的球状树脂。
30.进一步的，在步骤2)中，所述tn糖肽确定是指共价结合tn糖肽确定，包括步骤：
31.将n-糖苷酶加入nh4hco3缓冲液，配制完成后加入到scsc中结合有氧化糖肽的球状树脂中反应；
32.离心，去除过滤液，再加入hplc水，清洗球状树脂并离心去除过滤液，去除糖肽上的n聚糖；
33.加入tn糖苷酶，同时加入tris缓冲液反应；
34.离心收集过滤液，再加入hplc水，离心后收集过滤液，并重复此步骤，将所有过滤液合并；
35.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽。
36.进一步的，在步骤1)中，所述固相结合是指凝集素固相结合糖肽的富集tn，包括步骤：
37.(1)蛋白质提取和浓度测量：
38.在细胞中加入ripa裂解液、蛋白酶抑制剂，用超声破碎仪破碎30秒后获得样本，将所述样本放入冰中冷却，反复这一步骤直至样本澄清为止；
39.取所述样本，用去离子水稀释，用pierce bca蛋白定量分析试剂盒测试蛋白的浓度；
40.(2)n-聚糖酶切去除
41.根据所述样本测定的蛋白浓度，取所述样本；
42.将pngase f和nh4hco3加入到样本中反应，使所述样本中的含糖蛋白的n-聚糖酶解去除；
43.(3)蛋白酶解
44.根据所述样本测定的蛋白浓度，取所述样本溶于尿素去离子水溶液中，轻微振荡，确保所述样本中的蛋白完全溶解；
45.在所述样本中加入二硫苏糖醇溶液反应；
46.再加入碘乙酰胺溶液暗室反应；
47.用去离子水将所述样本稀释，加入碳酸氢铵溶液；
48.加入测序级胰蛋白酶，轻微振荡样本至水解，此时样本中包含多肽；
49.(4)凝集素固相结合糖肽
50.取vvl凝集素树脂加入到scsc中；
51.用去离子水清洗vvl凝集素树脂，在离心机上除去水，重复本步骤；
52.将所述多肽溶于vvl凝集素树脂结合缓冲液中；
53.将含有多肽的vvl凝集素树脂结合缓冲液加入到scsc中反应；
54.使具有o-galnac结构的糖肽结合到vvl凝集素树脂上，而非糖肽则保留在上清液中；
55.用hplc水清洗，离心去除上清液，重复此步骤，得到与vvl凝集素固相结合糖肽。
56.进一步的，在步骤2)中，所述tn糖肽确定是指凝集素结合tn糖肽确定，包括步骤：
57.将n-糖苷酶加入nh4hco3缓冲液，配制完成后加入scsc中与与凝集素固相结合的具有o-galnac结构的糖肽反应；
58.离心，去除过滤液，再加入hplc水，清洗vvl凝集素树脂并离心去除过滤液，去除糖肽上的n糖，使洗脱后的vvl凝集素树脂上仅保留粘蛋白型o-糖肽和o-galnac糖肽。
59.进一步的，在步骤3)中，所述tn糖肽位点确定是指凝集素结合糖肽酶切得到具有tn位点的多肽，具体包括步骤：
60.在具有粘蛋白型o-糖肽和o-galnac糖肽的vvl凝集素树脂中加入tn糖苷酶，同时加入tris缓冲液反应；
61.离心收集过滤液，再加入hplc水，离心后收集过滤液，重复此步骤，将所有过滤液合并；
62.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽。
63.进一步的，在步骤3)中，所述tn糖肽位点确定是指凝集素结合糖肽洗脱得到tn糖肽，包括步骤：
64.在具有粘蛋白型o-糖肽和o-galnac糖肽的vvl凝集素树脂中加入洗脱缓冲液；
65.将vvl凝集素树脂在scsc中离心，收集过滤液；
66.再加入hplc水，混合后收集上清液，重复此步骤，合并所有上清液；
67.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽。
68.进一步的，在步骤3)中，所述tn糖肽位点确定是指tn糖苷酶用重水确定tn糖肽位点，包括步骤：
69.用氯化钠溶液、acn溶液、hplc水逐次清洗树脂，去除树脂表面杂质和其他非结合成分；
70.在固相结合的tn糖肽中，加入tn糖苷酶，同时加入溶剂为重水的tris缓冲液反应；
71.离心收集过滤液，再加入hplc水，离心后收集过滤液，重复此步骤，将所有过滤液合并；
72.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽；
73.将多肽c18纯化多肽真空冷冻干燥得到tn糖肽o-糖肽；
74.将样本重新溶于tfa，取1-2微升用于液相色谱-质谱分析；
75.得到的质谱数据用生物信息学软件分析，获得tn糖肽o-糖肽多肽序列和糖基化位点。
76.上述方式所制备的一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法在制备癌细胞诊断检测试剂中的应用。
77.本发明提供了一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法，能从复杂的蛋白多肽中，特异性富集分析tn糖肽o-糖肽，其能够广泛的应用各类分析中，如：
78.1)正常细胞和癌细胞中tn糖肽定性和定量分析；
79.2)临床体液和组织中tn糖肽定性和定量分析；
80.3)完整o-galnac糖肽的定性定量分析，避免使用抗体或点击化学带来的非特异性o-galnac糖肽结合，减少测试中的假阳性。本方法可以使用高通量处理和分析样本，提高样本处理效率、准确性和避免人工手动操作。
附图说明
81.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，
82.图1为本发明固相球形树脂结合糖肽的示意图；
83.图2为本发明中对共价结合的糖肽tn糖肽o-糖肽位点分析示意图；
84.图3为本发明中共价或亲和结合糖肽galnacexo酶切tn糖肽o-糖肽位点确定示意图；
85.图4为本发明中肺癌组织tn糖肽o-糖肽分析示意图。
具体实施方式
86.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
87.首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
88.其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。
89.实施例1
90.一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切分析(spgale)的方法，所述方法包括如下步骤：
91.1、糖肽制备和与球状树脂共价固相结合。请参阅图1，图1为本发明固相球形树脂结合糖肽的示意图。如图1所示，本方法(方法一)是将糖肽用氧化剂氧化，氧化的糖与酰肼
或氨基树脂共价结合，从而将糖肽与与非糖肽分开。具体包括如下步骤：
92.(1)蛋白质提取和浓度测量
93.在细胞中加入400-600微升1倍ripa裂解液(cell signal,上海)，8-12微升50倍蛋白酶抑制剂(promega,madison,wi,usa)，用超声破碎仪30-40％能量(最大能量为刻度100％)，破碎30秒后获得样本，将所述样本放入冰中冷却30秒，反复这一步骤4-6次，直至样本溶液澄清为止；
94.取2-4微升样本，用去离子水稀释5-10倍，用pierce bca蛋白定量分析试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)测试蛋白的浓度；
95.(2)蛋白酶解
96.根据测定的浓度，取800-1000微克总蛋白溶于体积为400-600微升的尿素去离子水溶液，尿素最终浓度为8m，轻微振荡样本，确保蛋白完全溶解；
97.加入80-100微升去离子水溶液配制的120mm二硫苏糖醇(dtt)(sigma-aldrich，st.louis,mo,usa)，样本在37℃反应1.0-1.5小时；
98.再加入80-100微升去离子水溶液配制的160mm碘乙酰胺(sigma-aldrich，st.louis,mo,usa)，样本室温暗室反应1.0-1.5小时；
99.用去离子水将样本稀释5-6倍，加入100-125微升hplc水溶液新配制的1m碳酸氢铵，最终碳酸氢铵浓度为25mm，测试样本ph介于7-9之间；
100.加入40-50微升50％g/l的测序级胰蛋白酶(promega,madison,wi,usa)，轻微振荡样本在37℃反应16-18小时水解，样本中包含多肽；
101.(3)多肽纯化
102.在样本溶液中加入三氟乙酸(tfa，》99％，w/v)(约10-20微升)，直至样本ph下调至2-3；
103.c18萃取柱预处理后，加入样本至c18萃取柱中，经过萃取柱的过滤液收集，再将此过滤液加入到同一个c18萃取柱，增加样本中多肽的回收率；
104.用0.1％tfa(体积比)清洗萃取柱5-6次(1.0-1.2毫升)，过滤液去除。400-500微升50％(体积比)含有0.1％tfa(体积比)的乙腈(acn)洗脱多肽，最后一步重复2次；
105.将洗出的多肽合并，真空冷冻干燥得到纯化的多肽；
106.(4)糖肽氧化和固相结合
107.将多肽重新溶于0.1％tfa(体积比)和50％acn(体积比)溶液，加入10-20mm氧化剂高碘酸钠(sigma-aldrich)，多肽在37℃反应1-2小时，将多肽中糖肽上的各种糖(n-聚糖、粘蛋白型o-聚糖和o-galnac或tn糖肽)氧化；
108.氧化的糖肽真空冷冻干燥，重新溶于1毫升0.1％tfa(体积比)(如溶解度不好，可先加入10-20微升50％acn(体积比))。使用c18纯化氧化糖肽和其它多肽后，将其溶于200-400微升0.1％tfa(体积比)；
109.取100-150微升表面具有酰肼或氨基的球状树脂(thermo fisherscientific,waltham,ma,usa)，加入到1.5-2.0毫升离心管。将球状树脂预处理，即400-500微升去离子水清洗两次，去掉过滤液后，把氧化糖肽与球状树脂结合，糖肽在室温下反应2-4小时；
110.通过对球状树脂清洗后，400-500微升50％acn(体积比)三次，400-500微升hplc水，得到纯化富集在球状树脂上结合的氧化糖肽。
111.2、共价结合tn糖肽确定，请参阅图2，图2为本发明中对共价结合的糖肽tn糖肽o-糖肽分析示意图。如图2所示，共价结合的糖肽，pngasef酶解切除n糖，树脂上结合为o-糖肽，采用galnacexo酶切后，上清液中即为tn糖肽o-糖肽。具体如下：
112.球状树脂共价结合经高碘酸钠氧化的糖肽，包括n-糖肽、粘蛋白型o-糖肽和o-galnac糖肽；
113.配制0.2-0.4微升n-糖苷酶在300-400微升的25mm nh4hco3缓冲液(ph 7.6-8.0)，将配好的溶液加入scsc结合有糖肽的球状树脂中，在37℃反应4-6小时；
114.将上述样本离心，2000rpm，90-120秒，去除过滤液。再加入400-600微升hplc水，清洗球状树脂并离心去除过滤液，重复这一步2-3次，将n-糖肽上的多肽酶切；
115.在样本中加入20-30u tn糖苷酶(galnacexo,genovis)，同时加入300-400微升20mm tris缓冲液(ph 6.8)，在37℃反应4-6小时；
116.离心收集过滤液(2000rpm，90-120秒)，再加入400-600微升hplc水，离心后收集过滤液，重复此步骤2-3次，将所有过滤合并；
117.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽(步骤与1(3)相同)。
118.3、tn糖苷酶切后用重水确定tn糖肽位点的方法包括如下步骤。请参阅图3，图3是共价结合或凝集素结合tn糖肽用重水确定位点示意图。具体如下：
119.用400-600微升1.0-1.5m氯化钠溶液、400-600微升10％acn(体积比)溶液、400-500微升hplc水逐次清洗树脂，去除树脂表面杂质和其他非结合成分；
120.在固相结合的tn糖肽中，加入20-30u tn糖苷酶(galnacexo,genovis)，同时加入300-400微升tris(ph 6.8)，所用溶剂为重水，在37℃反应4-6小时；
121.离心收集过滤液(2000rpm，90-120秒)，再加入400-600微升hplc水，离心后收集过滤液，重复此步骤2-3次，将所有过滤合并；
122.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽(步骤与1(3)相同)；
123.将c18纯化多肽真空冷冻干燥得到tn糖肽o-糖肽；
124.将样本重新溶于20-40微升0.1％tfa，取1-2微升用于液相色谱-质谱(lc-ms/ms)分析；
125.得到的质谱数据用生物信息学软件分析，获得tn糖肽o-糖肽多肽序列和糖基化位点。
126.实施例2
127.一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切分析(spgale)的方法。所述方法包括如下步骤：
128.1、凝集素固相结合糖肽的富集tn。请参阅图1，图1为本发明固相球形树脂结合糖肽的示意图。本方法(方法二)是将糖肽用pngasef酶解，去掉n-聚糖，再用凝集素富集o-糖肽。具体包括如下步骤：
129.(1)蛋白提取和浓度测定
130.在细胞中加入400-600微升1倍ripa裂解液(cell signal,上海)，8-12微升50倍蛋白酶抑制剂(promega,madison,wi,usa)，用超声破碎仪30-40％能量(最大能量为刻度100％)，破碎30秒后获得样本，将所述样本放入冰中冷却30秒，反复这一步骤4-6次，直至样本溶液澄清为止；
131.取2-4微升样本，用去离子水稀释5-10倍，用pierce bca蛋白定量分析试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)测试蛋白的浓度；
132.(2)n-聚糖酶切去除
133.根据测定的浓度，取800-1000微克总蛋白(如蛋白浓度为1微克/微升，则从提取的蛋白溶液中取80-100微升)；
134.将0.2-0.4微升pngase f(new england biolabs,ipswich,ma,usa)和2.0-2.5微升1m nh4hco3加入到80-100微升的蛋白溶液，混合样本在37℃反应4-6小时，将样本中所含糖蛋白的n-聚糖酶解去除；
135.(3)蛋白酶解
136.根据测定的浓度，取800-1000微克总蛋白溶于体积为400-600微升的尿素去离子水溶液，尿素最终浓度为8m，轻微振荡样本，确保蛋白完全溶解；
137.加入80-100微升去离子水溶液配制的120mm二硫苏糖醇(dtt)(sigma-aldrich，st.louis,mo,usa)，样本在37℃反应1.0-1.5小时；
138.再加入80-100微升去离子水溶液配制的160mm碘乙酰胺(sigma-aldrich，st.louis,mo,usa)，样本室温暗室反应1.0-1.5小时；
139.用去离子水将样本稀释5-6倍，加入100-125微升hplc水溶液新配制的1m碳酸氢铵，最终碳酸氢铵浓度为25mm，测试样本ph介于7-9之间；
140.加入40-50微升50％g/l的测序级胰蛋白酶(promega,madison,wi,usa)，轻微振荡样本在37℃反应16-18小时水解，样本中包含多肽；
141.(4)凝集素固相结合糖肽
142.取140-160微升vvl凝集素树脂(vector labs,burlingame,ca,usa)，加入到500-600微升体积的snap-cap spin-column(scsc)(thermo fisher scientific)；
143.用400-500微升去离子水清洗vvl凝集素树脂，在离心机上除去水(2000rpm，90-120秒)，重复此步骤2-3遍；
144.将多肽溶于300-400微升vvl凝集素树脂结合缓冲液，其组成为20mm tris.hcl(ph 7.4),150mm nacl,1m urea，1mm cacl2,1mm mgcl2,1mm zncl2,1mm mncl2；
145.将上述多肽与结合缓冲液加入scsc中，与vvl凝集素树脂混合，在室温反应2-4小时；
146.将具有o-galnac结构的糖肽结合到树脂上，而非糖肽则保留在上清液中；
147.注：凝集素可为vvl本身或vvl加上其他凝集素混合物；
148.用400-600微升hplc水清洗凝集素，离心去除上清液(2000rpm，90-120秒)，重复此步骤4-6次，得到与凝集素固相结合糖肽。
149.2、凝集素结合tn糖肽
150.请参阅图2，图2为本发明中对共价结合的糖肽tn糖肽o-糖肽位点分析示意图。具体如下：
151.配制0.2-0.4微升n-糖苷酶在300-400微升的25mm nh4hco3缓冲液(ph 7.6-8.0)，将配好的溶液加入scsc结合有糖肽的vvl凝集素树脂中，在37℃反应4-6小时；
152.将上述样本离心，2000rpm，90-120秒，去除过滤液。再加入400-600微升hplc水，清洗vvl凝集素树脂并离心去除过滤液，重复这一步2-3次，去除糖肽上的n糖；
600微升体积的snap-cap spin-column(scsc)(thermo fisher scientific)；
175.用400-500微升去离子水清洗vvl凝集素树脂，在离心机上除去水(2000rpm，90-120秒)，重复此步骤2-3遍；
176.将多肽溶于300-400微升vvl凝集素树脂结合缓冲液，其组成为20mm tris.hcl(ph 7.4),150mm nacl,1m urea，1mm cacl2,1mm mgcl2,1mmzncl2,1mm mncl2；
177.将上述多肽与结合缓冲液加入scsc中，与vvl凝集素树脂混合，在室温反应2-4小时；
178.将具有o-galnac结构的糖肽结合到树脂上，而非糖肽则保留在上清液中；
179.注：凝集素可为vvl本身或vvl加上其他凝集素混合物；
180.用400-600微升hplc水清洗凝集素，离心去除上清液(2000rpm，90-120秒)，重复此步骤4-6次，得到与凝集素固相结合糖肽。
181.2、凝集素结合tn糖肽
182.请参阅图2，图2为本发明中对共价结合的糖肽tn糖肽o-糖肽位点分析示意图。具体如下：
183.配制0.2-0.4微升n-糖苷酶在300-400微升的25mm nh4hco3缓冲液(ph 7.6-8.0)，将配好的溶液加入scsc结合有糖肽的vvl凝集素树脂中，在37℃反应4-6小时；
184.将上述样本离心，2000rpm，90-120秒，去除过滤液。再加入400-600微升hplc水，清洗vvl凝集素树脂并离心去除过滤液，重复这一步2-3次，将n-糖肽上的多肽酶切；
185.3、凝集素结合糖肽洗脱得到tn糖肽
186.在vvl凝集素树脂中加入300-400微升洗脱缓冲液，其成分为200mm galnac in 1x pbs(ph 7.4)；
187.将vvl凝集素树脂(在scsc中)离心2000rpm，90-120秒，收集过滤液；
188.再加入400-600微升hplc水，混合后理性收集上清液(2000rpm，90-120秒)，重复此步骤2-3次，合并所有上清液；
189.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽(步骤与1(3)相同)。
190.实施例4
191.一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切分析(spgale)的方法。所述方法包括如下步骤：
192.1、凝集素固相结合糖肽的富集tn。请参阅图1，图1为本发明固相球形树脂结合糖肽的示意图。本方法(方法二)是将糖肽用pngasef酶解，去掉n-聚糖，再用凝集素富集o-糖肽。具体包括如下步骤：
193.(1)蛋白提取和浓度测定
194.在细胞中加入400-600微升1倍ripa裂解液(cell signal,上海)，8-12微升50倍蛋白酶抑制剂(promega,madison,wi,usa)，用超声破碎仪30-40％能量(最大能量为刻度100％)，破碎30秒后获得样本，将所述样本放入冰中冷却30秒，反复这一步骤4-6次，直至样本溶液澄清为止；
195.取2-4微升样本，用去离子水稀释5-10倍，用pierce bca蛋白定量分析试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)测试蛋白的浓度；
196.(2)n-聚糖酶切去除
500微升hplc水逐次清洗树脂，去除树脂表面杂质和其他非结合成分；
219.在固相结合的tn糖肽中，加入20-30u tn糖苷酶(galnacexo,genovis)，同时加入300-400微升20mm tris缓冲液(ph 6.8)，所用溶剂为重水，在37℃反应4-6小时；
220.离心收集过滤液(2000rpm，90-120秒)，再加入400-600微升hplc水，离心后收集过滤液，重复此步骤2-3次，将所有过滤合并；
221.加入tfa调节至酸性，用c18纯化多肽(步骤与1(3)相同)；
222.将c18纯化多肽真空冷冻干燥得到tn糖肽o-糖肽；
223.将样本重新溶于20-40微升0.1％tfa，取1-2微升用于液相色谱-质谱(lc-ms/ms)分析；
224.得到的质谱数据用生物信息学软件分析，获得tn糖肽o-糖肽多肽序列和糖基化位点。
225.实施例5
226.请参阅图4，图4为本发明中肺癌组织tn糖肽o-糖肽分析示意图。如图4所示，运用spgale分析细胞中tn糖肽o-糖肽，并比较与正常或良性组织的具体步骤为：
227.将细胞均质化，首先把组织置于2毫升样本管，在细胞中加入400-600微升1倍ripa裂解液，用超声破碎仪30-40％能量，破碎30秒后将样本放入冰中冷却，反复这一步骤4-6次，直至样本溶液澄清为止；
228.bca测出样本蛋白质浓度，取900-1000微克蛋白质，用前面所述方法酶解、纯化、结合到固相树脂、对蛋白处理；
229.正常组织和癌症组织含有tn糖肽o-糖基化位点不同的糖蛋白；
230.用实施例1-4中所述方法，即spgale提取富集tn糖肽；
231.将tn糖肽o-糖肽用液相色谱-质谱分析，获得一级和二级质谱，色谱方法10-50％acn，质谱能量ce30，用生物信息学解析质谱数据，测序多肽序列和tn糖肽o-糖肽位点；
232.共价结合的tn糖肽o-糖肽位点通过重水鉴定，质谱显示丝氨酸或苏氨酸分子量增加1da；
233.凝集素亲和的tn糖肽o-糖肽位点通过重水鉴定，如使用洗脱，则质谱显示丝氨酸或苏氨酸分子量增加203da。如使用galnacexo酶切，则丝氨酸或苏氨酸分子量增加1da。
234.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于固相糖蛋白富集和tn糖肽酶切的分析方法和应用，能从复杂的蛋白多肽中，特异性富集分析tn糖肽o-糖肽，并能够广泛的应用于各类分析中。
235.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。