一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法与流程

技术特征：
1.一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对苹果无融合生殖砧木进行全基因组测序；（2）在苹果无融合生殖砧木开花时期，去除柱头采收种子；（3）采收的种子低温冷藏层积后，进行诱变处理、消毒，然后再次低温冷藏层积，进行播种，待得到的萌发幼苗长出根系移栽水培；（4）鉴定水培幼苗的根系表型；（5）选取根系表型有差异的幼苗扦插生根，再次鉴定根系表型；（6）选取扦插生根的根系表型有差异的幼苗进行组织培养，诱导生根后鉴定根系表型，得到差异诱变砧木；（7）将差异诱变砧木进行全基因组测序和转录组测序，与步骤（1）全基因组测序结果进行比较获得诱变基因；（8）对诱变基因进行功能验证。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中采用pacbio hifi测序、oxford nanopore technology 测序和illumina 二代测序平台对苹果无融合生殖砧木进行全基因组测序；然后利用canu hifi 软件对得到的原始测序数据进行组装，组装结果用nextpolish 软件和二代illumina 数据进行校正并组装高质量基因组，利用已知苹果基因组序列和hi-c数据，采用allhic软件进行contig的分相和挂载，得到挂载到全部染色体的苹果无融合生殖砧木基因组序列，对挂载到染色体的基因组利用necat校正的ont测序数据进行gap closing, 然后利用pacbio hifi 数据进行gap closing，得到最终的染色体水平的分相的苹果无融合生殖砧木基因组。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）低温冷藏层积的步骤为：将采收的种子与潮湿沙土混匀置于4℃冰箱中层积25-50天。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱变处理为化学诱变，所述化学诱变的试剂包括ems、秋水仙素、5-溴尿嘧啶。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中根系表型的差异为侧根数量增多。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中采用solexa平台和solid平台对差异诱变砧木进行全基因组测序和转录组测序，通过比较基因组学和转录组wgcna分析，获得诱变基因的核苷酸序列。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）中利用诱变基因来构建目的基因超表达载体，转入发根农杆菌后，侵染野生型组培苗茎尖1.0 cm，经共培养和筛选培养后获得转基因根系，进行功能验证。8.利用权利要求1-7任一项所述的方法获得的诱变基因，其特征在于，所述诱变基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。9.根据权利要求8所述的诱变基因，其特征在于，所述诱变基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。10.权利要求8所述的诱变基因在用于鉴定无融合诱变系苹果砧木中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于全基因组诱变创制苹果无融合异源多倍体砧木的方法，包括步骤：苹果无融合生殖砧木全基因组测序；测序木本材料单株去掉柱头后采收种子；采收的种子低温冷藏层积；不同浓度EMS诱变，种子萌发并播种；收集种子进行层积萌发；水培并鉴定表型；差异材料植物组织培养，诱导生根鉴定根系表型；差异材料进行全基因组重测序和转录组测序；寻找诱变基因；发根农杆菌转化体系进行诱变基因功能验证。本发明利用苹果无融合生殖特性、根系表型分析及转录组高通量快速筛选鉴定新型无融合砧木，极大的节省了筛选的时间与空间，且方法流程简单、操作技术容易掌握，具有广阔的应用前景。用前景。用前景。


技术研发人员：张世忠 张步航 郑成超 李菡 齐琦 姜舒纳
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2022/3/25