一种食用沙棘酵素及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于食品技术领域，具体涉及一种食用沙棘酵素及其制备方法和应用。


背景技术：

2.如今，快节奏的生活下，多数人生活作息紊乱、饮食不健康，使人体内由氧化胁迫肠道菌群紊乱所导致的消化系统疾病、代谢性疾病、心血管疾病等发病频繁。
3.食用果蔬酵素是一种以多种新鲜水果与蔬菜为原料，利用果蔬自身含有的有益微生物，通过自然发酵而产生的含有多种营养物质的酵素产品，属于功能性食品。酵素在发酵过程中既保持了果蔬自身营养成分，又产生新的生物活性成分，如各种有机酸、多酚、糖类以及多种生物功能性成分，可以改善肠胃功能、保持体内营养平衡、预防疾病等，同时其含有独特的口感与风味，是一种高质量、高营养的饮品。
4.近年来，食用果蔬酵素因其健康性和天然性，已经成为越来越受消费者欢迎的一类功能食品，主要被用于营养保健等领域。目前相关研究中，酵素在降脂性能方面的研究较少，经资料查询得知沙棘中含有多种生物活性物质，实验研究表明，其具有抗肿瘤、降血脂、抗氧化等功能。
5.沙棘(hippophae rhamnoides linn.)为胡颓子科沙棘属的落叶性灌木或小乔木，又名沙枣、酸柳和黑刺等，属于“药食同源”植物，营养成分和生物活性成分的含量均较高，被称为“维生素c之王”，维生素c含量极高，每100g果汁中含量可达825mg～1100mg，含糖7.5％～10％，含酸3％～5％。并且，我国沙棘产量巨大，种植面积占世界沙棘总面积的95％，沙棘的开发利用具有一定的经济效益。
6.在良好的市场前景下，研发具有特殊保健功能的酵素饮品具有重大意义，故从食品安全性、保健功效以及经济效益方面来考虑，沙棘是开发食用植物酵素的优良植物资源。
7.目前，对于食用沙棘酵素的研究主要集中在其体外抗氧化性上，而沙棘酵素的降脂功能相关研究较少。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种具有降油脂作用的食用沙棘酵素。
9.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
10.一种食用沙棘酵素，原料包括：沙棘，玫瑰花瓣或橙肉，红糖，水；
11.所述原料的用量为：沙棘180-360g，玫瑰花瓣90g或橙肉90g，红糖55-60g，水550-600g。
12.进一步地，所述食用沙棘酵素原料包括：沙棘180g，玫瑰花瓣90g，红糖57g，水570g。
13.上述食用沙棘酵素的制备方法，是将原料混合后，利用微生物自然发酵六个月制成。
14.上述食用沙棘酵素在制备降脂食品中的应用。
15.本发明以沙棘为主要原料，配合加入橙肉或食用玫瑰，通过微生物自然发酵制备具有一定降脂肪作用的食用沙棘酵素以及沙棘混合酵素，开发降脂功能的保健功能饮料，提高了沙棘资源的利用率和经济价值，并通过测定脂肪酶活性测试、胆固醇酯酶的活性抑制率及溶解度抑制率等指标，进一步确定该酵素饮品降脂效果，为以后降脂酵素的研究提供可行性思路，并可为沙棘酵素产品的工业化生产提供相应技术支持。
附图说明
16.图1为不同含量纯沙棘酵素中总糖含量的测定结果。
17.图2为不同含量纯沙棘酵素中总蛋白含量的测定结果。
18.图3为脂肪酶活性对比图的测定结果。
19.图4为胆固醇酯酶活性抑制率对比结果。
20.图5为胆固醇胶束溶解度抑制率对比结果。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
22.本发明主要以沙棘果实为原料，采用乐素昆博士制作酵素的方法，调整红糖、沙棘、水的比例，利用微生物自然发酵六个月。共设计了五种不同配方的沙棘酵素，其中三种为沙棘浓度不同的纯沙棘酵素，另外两种是分别添加了橙肉和玫瑰花瓣的混合酵素。
23.实施例1-实施例5的沙棘酵素的发酵原材料配方如表1所示。
24.表1 不同配方沙棘酵素的发酵原材料
[0025][0026]
下面对制得的沙棘酵素进行脂肪酶活性、胆固醇酯酶的活性抑制率及溶解度抑制率相关测试。
[0027]
1.总糖含量测定
[0028]
(1)标准曲线建立
[0029]
试管中分别加入浓度为8、16、24、32、40、48、56、64、72μg/ml的葡萄糖溶液，再加入3ml蒽酮试剂，震荡摇匀后立刻沸水浴加热5min，取出后放入冰水中迅速冷却(不断晃动)，以1ml蒸馏水为空白重复上述操作。所得试管内溶液在640nm波长下测定吸光度。以葡萄糖含量(μg/ml)为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
[0030]
(2)样品测定
[0031]
吸取酵素稀释液1ml于试管中，加入3ml蒽酮试剂，摇匀后立刻放置在沸水中水浴加热5min，取出后放入冰水中迅速冷却(不断晃动)，于640nm波长下测定吸光度值。将测得的吸光度值代入标准曲线方程，算出每毫升酵素所含葡萄糖含量。
[0032]
本发明总糖含量以葡萄糖计，采用蒽酮比色法，得标准曲线为y＝0.0074x 0.0029，y为640nm处的吸光度，x为葡萄糖溶液浓度，相关系数r2＝0.9951。三种纯沙棘酵素发酵过程中总糖含量测得如图1所示。
[0033]
发酵过程中，总糖含量呈现先上升后下降的趋势。发酵初始，原料中的糖类物质溶出，多糖类物质经过水解变成单糖和其它小分子物质，此时微生物生长繁殖速度较慢，所利用的糖类物质较少，整个发酵系统中含糖量逐渐达到最大值。随着发酵的继续进行，糖类作为主要营养物质被微生物逐渐消耗，直至发酵基本完成。由图1可见，实施例1(1号)和实施例2(2号)的酵素中总糖含量在发酵后期趋于稳定，而沙棘浓度最高的实施例3酵素总糖含量始终最高，且发酵六个月后测得发酵体系中残糖含量较高，发酵周期应随之延长。
[0034]
2.总蛋白含量测定
[0035]
(1)标准曲线建立
[0036]
分别精密移取牛血清蛋白标准溶液(0.1mg/ml)0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8ml于试管中，补加蒸馏水至1.0ml，混匀，加入5.0ml考马斯亮蓝g250溶液，摇匀后静置5min，595nm波长下测定吸光度，以蛋白溶液浓度(μg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
[0037]
(2)样品测定
[0038]
精密称取5组酵素稀释液1ml加入5ml考马斯亮蓝染液混匀，室温静置5min，于波长595nm处比色，读取吸光度值，查标准曲线得浓度。
[0039]
蛋白质是维持人体正常机能的重要存在，本发明采用考马斯亮蓝法测定总蛋白，y＝0.0007x 0.0111，y为595nm处的吸光度，x为蛋白溶液浓度，相关系数r2＝0.9937。三种纯沙棘酵素发酵过程中总蛋白测定结果如图2所示。
[0040]
发酵初始，原料中的蛋白质随着发酵的进行溶出，同时，酵液中充足的糖分和营养物质使微生物繁殖代谢生成蛋白质，总蛋白含量达到峰值。蒋增良等(树莓酵素在天然发酵过程中营养组成和抗氧化性能的变化)通过研究树莓发酵过程中蛋白质的含量变化发现，发酵前64d，蛋白质含量一直呈现上升趋势，在0～40d增长了近两倍，增长速率最快。后期由于微生物对糖类物质的利用和次级代谢产物的积累导致部分微生物和细胞分解成小分子物质，蛋白质含量下降。110d后，发酵液中的蛋白质含量轻微上升，可能是微生物对原料本身进行分解，导致原料蛋白质逐渐溶出或菌体自溶所致。
[0041]
经测定，在发酵过程中，实施例3(3号)中酵素总蛋白含量始终最高；发酵六月后，三种酵素中总蛋白含量大小为：实施例3(3号)》实施例2(2号)》实施例1(1号)，酵液中蛋白含量与原料中含量成正相关。
[0042]
3.脂肪酶活性的测定
[0043]
取若干个锥形瓶，加入1ml橄榄油与5ml磷酸缓冲液(0.025mol/l，ph＝7.5)，以不含橄榄油为空白，40℃水浴5min。将1ml稀释后的酵素加入锥形瓶中，摇匀计时5min后立即加入15ml 95％的乙醇，酶反应终止。在每个锥形瓶中加入2滴酚酞指示剂，用氢氧化钠溶液(0.05mol/l)滴定，记录消耗的naoh体积。按照下列公式计算脂肪酶活性：
[0044][0045]
式中：v为滴定样品时消耗naoh的体积；
[0046]v0
为空白试验消耗naoh的体积；
[0047]
50为1ml 0.05mol/l naoh溶液相当于脂肪酸50μmol；
[0048]
n为酵素稀释倍数；
[0049]
15为反应时间15min，以1min计。
[0050]
检测结果如图3所示。市售沙棘原浆中检测出脂肪酶活性最低，为26μmol/ml；实施例3(3号)与实施例4(4号)酵素脂肪酶活性相差不大，分别为67μmol/ml和63μmol/ml，略高于沙棘果汁；实施例5(5号)酵素脂肪酶活性最高，有其余酵素的两倍之多，为147μmol/ml。
[0051]
脂肪酶的本质是蛋白质，一般活性范围在80℃以下，当温度在100℃以上时，脂肪酶结构遭到不可逆的破坏，催化活性消失。市售沙棘原浆产品中的脂肪酶活性与其加工工艺有关，经检测，酶活性较低可能是由于产品的杀菌经过了高温。另外，ph值对脂肪酶活性有重要影响，过酸或过碱的环境下酶易失活，酵素的ph值普遍较低。这可能是测得脂肪酶活性不高的原因。食用玫瑰中含量丰富的原花青素能够提高脂肪酶活性，因此实施例5(5号)酵素脂肪酶活性较好。
[0052]
4.胆固醇酯酶活性抑制率的测定
[0053]
准确称取2.77g牛磺胆酸钠与5.844g氯化钠，用磷酸钠缓冲液(0.1mol/l，ph 7.0)定容至100ml，作为整个反应体系的缓冲液。对硝基苯基丁酸脂预先溶解在乙腈中，胆固醇酯酶预先溶解于无菌水中(1u/μl)。胆固醇酯酶加入后反应开始，室温反应5min，于酶标仪中415nm波长下测定吸光度。
[0054]
表2 胆固醇酯酶活性测定反应体系
[0055][0056]
注：-加入等体积蒸馏水。
[0057]
按如下公式计算胆固醇酯酶抑制活性：
[0058][0059]
式中：a为空白管溶液的吸光值；
[0060]
b为空白对照管溶液的吸光值；
[0061]
c为抑制管溶液的吸光值；
[0062]
d为背景对照管溶液的吸光值。
[0063]
胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶，抑制胆固醇酯酶的活性能够减少部分胆固醇的生成，降低其生物利用度。
[0064]
检测结果如图4所示。不同样品的胆固醇酯酶活性抑制率大小为：实施例5(5号)》实施例3(3号)》实施例4(4号)》果汁》原浆，分别为：62％、60％、51％、49％、45％。
[0065]
实施例3(3号)的纯沙棘酵素的胆固醇酯酶活性抑制率高于沙棘果汁和沙棘原浆，可能是因为在发酵过程中，发酵基质原有的能够抑制胆固醇酯酶活性的物质充分溶出，并产生了新的生物活性物质，其对胆固醇酯酶具有一定的抑制作用。
[0066]
5.胆固醇胶束溶解度抑制率的测定
[0067]
(1)胶束溶液的制备
[0068]
分别准确称取氯化钠、0.537g牛磺胆酸钠、0.077g胆固醇、0.141g油酸以及0.771g氯化钠，用磷酸缓冲液(ph7.4)定容至100ml，利用超声波均质，37℃隔夜静置。
[0069]
(2)样品测定
[0070]
将空白对照、100μl的酵素分别加入到4ml胶束溶液中，37℃培养2h，并在16000r/min下离心20min，收集上清液用总胆固醇试剂盒测定胶束中胆固醇含量。
[0071][0072]
进入人体肠道内的胆固醇需要溶解于胆固醇胶束内才能被吸收，抑制胆固醇胶束溶解度就能有效抑制胆固醇的吸收，降低血液中胆固醇含量。
[0073]
实验所用胆固醇酯酶活性为1u/μl，抑制剂(酵素、果汁、原浆)稀释10倍进行测定，即所得抑制率为不同样品对10u/μl的胆固醇酯酶的抑制率。
[0074]
经测定，不同样品的胆固醇酯酶活性抑制率大小为：实施例5(5号)》果汁》原浆》实施例3(3号)》实施例4(4号)，分别为：51％、43％、40％、38％、34％。
[0075]
植物甾醇能够有效抑制胆固醇胶束溶解度，槲皮素也具有一定抑制作用，实验测得的五个样品的胆固醇胶束溶解度抑制率相差不大，是多种物质作用的结果。
[0076]
经过以上脂肪酶活性、胆固醇酯酶活性抑制率及溶解度抑制率的测定，都表明沙棘酵素具有一定的降脂效果，特别是添加了食用玫瑰的混合酵素降脂性能优于其他酵素、沙棘果汁及沙棘原浆(市场购买)。因此，沙棘酵素有望应用于降血压、降血脂等医疗保健方面，功能性混合沙棘酵素的开发能够强化沙棘原本的降脂性能。