一种甲氨蝶呤和叶酸代谢通路的检测方法与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种甲氨蝶呤和叶酸代谢通路的检测方法。


背景技术：

2.高剂量甲氨蝶呤(hdmtx)是治疗急性淋巴细胞白血病(all)、骨肉瘤、脑肿瘤和淋巴瘤的重要组成部分。然而甲氨蝶呤(mtx)对于人体组织具有很强的毒性，且mtx的毒性与使用剂量以及在组织中暴露的时间有关。因此，为了避免这种hdmtx治疗带来的剧烈的器官毒性、水毒性以及尿碱等不良反应，通常会使用亚叶酸(fa，或5甲酰四氢叶酸thf)进行挽救治疗。
3.叶酸是机体细胞生长和繁殖所必须的物质，可以帮助蛋白质的代谢，同时也是制造红血球必不可少的物质。叶酸通过二氢叶酸还原酶(dhfr)被还原成二氢叶酸(dhf)，dhf再通过dhfr生成thf。而mtx会抑制dhfr的活性，因此严重影响了叶酸的代谢途径(叶酸与mtx代谢图见附图1)。进行fa给药则绕过了这一效应，因为它绕过了dhfr途径提供了四氢叶酸的替代来源。因此进行fa给药可以通过恢复四氢叶酸水平来抵消mtx对细胞中叶酸周期的影响。
4.然而，进行fa给药会导致fa和mtx在进入细胞以及聚谷氨酰胺化的过程产生竞争，使其在较高mtx浓度下作为拯救剂的有效性降低。因此，不同的治疗方案在hdmtx期间对fa给药的剂量建议是存在很大差异的。这些差异可能是一个严重的限制，因为fa挽救治疗一方面需要平衡避免器官毒性，另一方面还需要平衡mtx的最佳抗肿瘤效果。因此，监测fa的药代动力学以及叶酸周期的代谢物对个体患者有益，因为在治疗后积累的fa可能会中和mtx在后续hdmtx治疗中的抗肿瘤作用。所以基于mtx、mtx代谢物、fa和叶酸循环代谢物水平综合评价的个体化调整fa挽救治疗可能是优化mtx抗白血病作用的一个有价值的工具。
5.但是，关于如何使mtx达到与fa功能等效剂量的研究很少。并且还缺乏同时检测mtx、fa和所有代谢物的方法。公开号为cn113325171a的专利发明了一种检测人体红细胞叶酸含量的试剂盒、检测方法及用途，但是该方法只能检测叶酸的浓度水平，不能检测整个叶酸代谢通路，并且也不能检测mtx水平。公开号cn112666274a的专利发明了一种检测红细胞中甲氨蝶呤类物质的试剂盒，但是不能检测甲氨蝶呤代谢物以及叶酸代谢通路。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种甲氨蝶呤和叶酸代谢通路的检测方法，测量准确灵敏且通量高，可用于在高剂量甲氨蝶呤治疗过程中同时研究甲氨蝶呤和亚叶酸的药代动力学，并且可用于优化高剂量甲氨蝶呤和亚叶酸在个体患者中的挽救治疗。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种甲氨蝶呤和叶酸代谢通路的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.(1)取标准品，分别进行精密称量后溶解于氢氧化铵溶液中，之后将各个含有标准
品的溶液进行混合，再利用牛血清白蛋白溶液进行稀释得到标准溶液；
9.(2)取50ul不同浓度的所述标准溶液以及血清样本分别放置在1.5ml离心管中，加入200ul含有内标的甲醇溶液，涡旋振荡2分钟后，13000rpm高速离心5分钟，吸取100ul上清液进行检测分析；
10.(3)对步骤2得到的上清液进行液相色谱串联质谱检测，得到标准品与内标的峰面积的比值、血清样本内待检测物与内标的峰面积的比值；
11.(4)分别以标准溶液的标准品的浓度为横坐标，以标准品与内标的峰面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线；
12.(5)将血清样本内待检测物与内标的峰面积的比值带入直线回归方程的纵坐标，即可得到血清样本内待检测物的浓度。
13.进一步地，所述标准品为甲氨蝶呤、7-羟基甲氨蝶呤、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-甲酰基四氢叶酸和叶酸。
14.进一步地，所述内标为甲氨蝶呤-d3和亚叶酸-13c5。
15.进一步地，在步骤3中质谱检测的参数如下：离子化方式：esi ；扫描方式：mrm；离子源温度：150度；脱溶剂气温度：500度；脱溶剂气流速：600l/h；锥孔电压：3.0kv。
16.进一步地，在步骤3中色谱检测的参数如下：色谱柱：luna omega 1.6μm,polar c18；两个流动相为0.5％甲酸水溶液和0.5％甲酸甲醇溶液；流速：0.4ml/min；柱温：40度。
17.进一步地，所述牛血清白蛋白溶液由牛血清白蛋白和纯水混合而成。
18.本发明的有益效果：本发明包括测量亚叶酸fa,甲氨蝶呤mtx及其两种代谢物，以及叶酸循环代谢物的同时检测方法。该方法准确灵敏且通量高，可用于在高剂量甲氨蝶呤hdmtx治疗过程中同时研究mtx和fa的药代动力学，并且可用于优化hdmtx和fa在个体患者中的挽救治疗。
附图说明
19.图1是本发明的标准溶液浓度表。
20.图2是本发明的流动相梯度洗脱程序表。
21.图3是本发明的mrm扫描参数表。
22.图4是本发明的线性、准确度和精密度表。
23.图5是本发明的检测物质叶酸以及甲氨蝶呤代谢图。
具体实施方式
24.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
25.在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
26.参照图1至图5所示，本发明的一种甲氨蝶呤和叶酸代谢通路的检测方法的一实施
例，包括如下步骤：
27.(1)取标准品，分别进行精密称量后溶解于氢氧化铵溶液中，之后将各个含有标准品的溶液进行混合，再利用牛血清白蛋白溶液(由牛血清白蛋白和纯水混合而成)进行稀释得到标准溶液；
28.(2)取50ul不同浓度的所述标准溶液以及血清样本分别放置在1.5ml离心管中，加入200ul含有内标(内标为甲氨蝶呤-d3和亚叶酸-13c5，使得测量结果更加准确)的甲醇溶液，涡旋振荡2分钟后，13000rpm高速离心5分钟，吸取100ul上清液进行检测分析；
29.(3)对步骤2得到的上清液进行液相色谱串联质谱检测，得到标准品与内标的峰面积的比值、血清样本内待检测物与内标的峰面积的比值；
30.(4)分别以标准溶液的标准品的浓度为横坐标，以标准品与内标的峰面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线；
31.(5)将血清样本内待检测物与内标的峰面积的比值带入标准曲线的纵坐标，即可得到血清样本内待检测物的浓度。
32.在步骤1中，标准品为甲氨蝶呤、7-羟基甲氨蝶呤、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-甲酰基四氢叶酸和叶酸，表1为五种不同的标准溶液内的标准品的浓度，即本实施例利用五种不同标准溶液浓度的标准溶液来进行实验；
33.在步骤2中，将步骤1得到的五种不同标准溶液浓度的标准溶液和待检测的血清样本分别进行操作，每一种均得到100ul的上清液进行下一步的实验；
34.在步骤3中，质谱检测的参数如下：离子化方式：esi ；扫描方式：mrm(mrm扫描参数见图3)；离子源温度：150度；脱溶剂气温度：500度；脱溶剂气流速：600l/h；锥孔电压：3.0kv；
35.色谱检测的参数如下：色谱柱：luna omega 1.6μm,polar c18；两个流动相为0.5％甲酸水溶液和0.5％甲酸甲醇溶液；流速：0.4ml/min；柱温：40度，流动相梯度洗脱程序见图2，出峰时间：mtx、2.45min；7oh-mtx、3.26min；fa、2.44min；dhf、2.41min；thf、1.43min；5-甲基-thf、1.68min；5，10-甲酰基-thf、1.81min；叶酸、2.24min；d3-mtx、2.42min；13c5-fa、2.43min，错开出峰方便记录计算。
36.经过步骤3，得到标准品与内标的峰面积的比值、血清样本内待检测物与内标的峰面积的比值。
37.之后分别以标准品的浓度为横坐标，以标准品与内标的峰面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。各标准品的标准曲线的线性相关系数见表4，线性相关系数均大于0.995，说明本方法各检测物质线性良好。
38.然后将血清中各个待检测物(与标准品一一对应)与内标的峰面积的比值代入所求得的直线回归方程，即代入纵坐标，由此可以求得待检测物的横坐标也就是血清中各个待检测物浓度。
39.对于待检测物批内批间准确度精密度的说明：
40.对于批间精密度，在56天的时间里，在7个不同的日期分别进行7个分析序列，反复分析所有高低浓度的qc(质量控制)样品。每天都进行校准，以确保结果的正确性。准确度的
计算为qc样品在每个浓度水平上的测量平均值除以实际值。通过测量qc样品在同一天的三个不同时间的cv来评估批内精度，相关数据见图4。由表可知，所有物质在高浓度和低浓度下的批内和批间准确度精密度都在可接受范围内(cv＜15％，准确度在85％-115％之间)，说明本方法检测值准确、精密。
41.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。