一种抗炎促生长促免疫的大菱鲆饲料及其制备方法与流程

1.本发明属于鱼饲料技术领域，具体涉及一种抗炎促生长促免疫的大菱鲆饲料及其制备方法。


背景技术：

2.鱼粉具有必需氨基酸和脂肪酸含量高、碳水化合物含量低、适口性好、抗营养因子低、被养殖动物消化吸收好等特点，是水产饲料中不可缺少的优质蛋白质来源(burel et al.，2000)。随着集约化水产养殖及水产饲料产业的发展，对于鱼粉的需求逐年增加，然而由于海洋渔业资源衰退导致鱼粉资源的紧缺、价格不断上涨，来源不稳定等因素，已成为限制水产养殖业发展的关键因素之一(brinker&friedrich，2012)。因此，充分开发、高效利用新型蛋白源替代鱼粉是水产饲料行业现在及未来发展的必然趋势。
3.豆粕由于其蛋白质含量高、供应稳定、成本较低，已被广泛应用于水产饲料中部分替代鱼粉(gasco，gai，maricchiolo，genovese，&caruso，2018)。但是由于豆粕中含有蛋白酶抑制剂、大豆皂苷、植酸等抗营养因子，饲料中添加高比例豆粕对水产动物的生长性能以及肠道健康产生负面影响(francis，makkar，&becker，2001)。
4.目前，丙酸盐作为一种重要的防腐防霉剂已经被广泛应用于食品和饲料生产中，其水产饲料的添加量通常为0.1％，主要以游离的丙酸发挥作用(luckstadt&resources，2009)。丙酸作为动物体肠道产生的主要短链脂肪酸之一，其对人和动物体的安全性已被证明，世界卫生组织(who)和联合国粮农组织(fa0)已经批准在国际上以丙酸钙作为食品防腐剂。
5.大菱鲆(scophthalmus maximus l.)原产于大西洋东北沿岸，1992年引入我国之后已成为优势的海水养殖品种，目前我国大菱鲆工厂化养殖规模居全球之首。已有报告显示在大菱鲆饲料中添加40％豆粕时，导致鱼体生长迟缓，出现明显的肠炎症状，同时免疫力下降(gu，bai，zhang，&krogdahl，2016)。已有的研究结果也表明，在添加高比例豆粕的大菱鲆饲料中添加0.2％丁酸钠增强鱼体的消化吸收能力，抑制肠道炎症，并恢复大菱鲆的肠道稳态(liu et al.，2019)。此外，白藜芦醇作为一种潜在的免疫增强剂，可提高肉食性鱼类对植物蛋白源的利用(castro et al.，2008)。针对大菱鲆的养殖实验表明，在豆粕代替45％鱼粉蛋白的饲料中添加0.05％白藜芦醇可提高大菱鲆肝脏的抗氧化能力，并有效缓解其肠道炎症，但并不能改善饲料中高比例豆粕添加对大菱鲆生长性能所造成的负面影响(tan et al.，2019)。
6.但是根据已有的研究报道，饲料中添加丁酸盐可能存在以下问题：(1)对于肠道最主要的三种短链脂肪酸，包括丁酸、丙酸和乙酸，动物肠道上皮细胞主要吸收利用丁酸作为碳源，其肠道和血清浓度远低于丙酸和乙酸(tran n.t.，2020)。同时丁酸的代谢速度也是三种短链脂肪酸中最快(holscher h.d.，2017)，其血清半衰期仅有6分钟(李雄彪，马庆英&崔云龙，2006)，相较而言丙酸的血清半衰期为20-30分钟(lyte m.，2013；johnson m.，1995)，因此直接口服或饲料添加丁酸盐在动物体的作用效率较低。在高等动物中使用丁酸
钠作为治疗药物时，常利用缓释技术减缓丁酸在肠道的吸收和代谢，从而使其达到有效的血药浓度。但该技术在饲料添加中的利用也将增加饲料成本。(2)丁酸钠有特殊的奶酪酸败样的脂臭味，饲料中的直接添加可能会影响饲料性状、动物采食以及其它不良应激反应。
7.同时，在饲料中添加白藜芦醇也存在一下可能的问题：(1)根据现有的研究结果，在高比例豆粕大菱鲆饲料中添加一定量的白藜芦醇可以缓解鱼体的肠道炎症，但是对鱼体的生长并未显现有益的影响。(2)此外，白藜芦醇主要提取于虎杖的根与茎，而虎杖主要集中生长于湖南和四川，年开采量已近饱和，而虎杖的人工栽培研究虽然已经起步，但目前尚未进行大面积种植。因此现阶段，白藜芦醇不适合作为饲料添加剂进行大规模使用。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种抗炎促生长促免疫的大菱鲆饲料，通过在含有高比例豆粕的大菱鲆饲料中添加0.5-1.0％的丙酸钠，可消除饲料中高比例豆粕添加对大菱鲆生长和免疫造成的负面影响，所检测的各项生长及免疫指标甚至超出纯鱼粉添加饲料组，为大菱鲆以及其它肉食性鱼类饲料产业充分利用豆粕，从而节约鱼粉、降低饲料成本、提高养殖效率提供可行性方案，并且能够有效克服现有技术中添加丁酸钠或者白藜芦醇存在的问题。
9.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
10.一种抗炎促生长促免疫的大菱鲆饲料，所述饲料由以下百分比的原料组成：鱼粉33％、豆粕35.69％、谷朊粉8.75％、小麦粉4.19％、啤酒酵母2％、鱼油5.31％、大豆卵磷脂2.5％、磷酸二氢钙0.5％、维生素预混料1.5％、矿物质预混料1.5％、氯化胆碱0.25％、丙酸钙0.1％、乙氧基喹啉0.05％、诱食剂1％、海藻酸钠0.5％、微晶纤维素2.16～2.66％、丙酸钠0.5～1％。所述饲料最终合计含有粗蛋白51％，粗脂肪12％。
11.上述抗炎促生长促免疫的大菱鲆饲料中，所述维生素预混料由以下物质混合而成：单位以mg/kg饲料来计，维生素b1 25；维生素b2 45；维生素b6 20；维生素b12 10；维生素k3 10；肌醇800；泛酸钙60；烟酸200；叶酸20；生物素60；维生素a 32；维生素d5；维生素e 240；维生素c 2000；乙氧基喹啉3；稻壳粉11470。
12.所述矿物质预混料由以下物质混合而成：单位以mg/kg饲料来计，cocl2·
6h2o 50；cuso4·
5h2o 10；feso4·
h20 80；znso4·
h2o 50；mnso4·
h2o 45；mgso4·
h2o 1200；na2seo
3 20；碘酸钙60；沸石粉13512。
13.所述诱食剂为甜菜碱∶二甲基-β-丙酸噻亭∶甘氨酸∶丙氨酸∶5-磷酸肌苷＝4∶2∶2∶1∶1(重量比)。
14.本发明还公开了上述抗炎促生长促免疫的大菱鲆饲料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：首先将鱼粉和豆粕粉碎，之后所有原料过80目筛，过筛后的原料根据配方表比例按照原料所占比例从小到大的顺序，采用逐级放大的方法从小到大逐一混匀，再与鱼油、大豆卵磷脂充分混合，最后加入30％的水混匀以增加粘合性，于双螺杆制粒机中加工成3mm大小的颗粒饲料，45℃干燥12小时后，用双层塑料袋包装并封口，置于-20℃冰箱保存以备后续实验使用。
15.本发明还保护丙酸钠在作为抗炎促生长促免疫添加剂在大菱鲆饲料中的应用，通过在含有高比例豆粕的大菱鲆饲料中添加0.5-1.0％的丙酸钠，消除饲料中高比例豆粕添
加对大菱鲆生长和免疫造成的负面影响。
16.本发明的优点：
17.本发明针对渔用饲料中高比例植物蛋白替代鱼粉时出现鱼体生长性能下降、肠道炎症、免疫功能下降等现象，通过在含有高比例豆粕的大菱鲆饲料中添加0.5-1.0％的丙酸钠，有效缓解了饲料对鱼体产生的不利影响，同时达到节约鱼粉、降低饲料成本、提高养殖效率的效果。
18.通过实验验证，在豆粕替代45％鱼粉蛋白的大菱鲆饲料中添加0.5-1.0％的丙酸钠，可以有效改善饲料高比例豆粕引起的鱼体生长性能下降，以及缓解对大菱鲆肠道结构和功能所造成的损害；并且丙酸钠能够发挥有效的抗炎作用，显著抑制促炎因子的表达，同时增强抗炎因子的表达；此外，对大菱鲆腹腔注射病原菌的实验结果也表明，高比例豆粕组大菱鲆脾脏中病菌含量显著高于对照组，而饲粮中添加丙酸钠明显抑制大菱鲆脾脏中的病菌载量，并恢复体内溶菌酶活性至对照组相似的水平，同时添加丙酸钠组大菱鲆头肾巨噬细胞的杀菌能力也显著升高，由此可知，高比例豆粕饲料中添加丙酸钠可以有效增强大菱鲆的免疫杀菌能力从而抑制病原感染。总体而言，在含有高比例豆粕的大菱鲆饲料中添加0.5-1.0％丙酸钠可有效改善大菱鲆的生长性能、缓解体内炎症，增强大菱鲆的免疫抗感染能力，从而节约饲料鱼粉的使用，降低饲料成本。
附图说明
19.图1是本发明实验设计流程图；
20.图2是高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆肠道组织结构及通透性的影响；
21.图3是高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆体内炎症相关基因表达的影响；
22.图4是高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆抗感染免疫的影响；
23.图5是高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆头肾巨噬细胞免疫功能的影响；
具体实施方式
24.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
25.若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
26.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
27.一.实验方法
28.1.实验饲料设计与制作
29.实验设计了4种饲料，分别设置为对照组、45％豆粕替代组(采用豆粕替代45％的鱼粉蛋白)、0.5％丙酸盐组(45％豆粕替代组 0.5％丙酸盐)、1.0％丙酸盐组(45％豆粕替代组 1.0％丙酸盐)。首先将鱼粉和豆粕粉碎，之后所有原料过80目筛，过筛后的原料根据
配方表原料所占比例从小到大的顺序，采用逐级放大的方法从小到大逐一混匀，再与鱼油、大豆卵磷脂充分混合，最后加入30％的水混匀以增加粘合性，于双螺杆制粒机中加工成3mm大小的颗粒饲料，45℃干燥12小时后，用双层塑料袋包装并封口，置于-20℃冰箱保存以备后续实验使用。
30.2.大菱鲆的养殖
31.大菱鲆幼鱼初始体重约15g，饲养实验在流水系统中进行，实验用鱼用对照饲料驯化2周。在驯化期间，剔除畸形、表面损伤和活力低下的鱼类。实验开始时，禁食24小时后称重(22.0
±
0.2g)，随机分配到12个养殖桶(500l)中，每个处理均匀分配到3个养殖桶，每个重复50尾鱼。养殖过程中海水经水泵持续抽送到过滤池中，经沙滤以约1.5l/min的速度流到养殖桶中。养殖8周期间，每天于07:00和19:00表观饱食投喂2次，每次摄食后吸底、换水50％以保证水质。整个养殖期间，水温控制在16℃-18℃，ph 7.5-8.0，盐度27
‰‑
29％0，氨氮含量低于0.1mg/l，亚硝酸盐含量低于0.1mg/l，溶解氧含量约为7.0mg/l。所开展研究的大菱鲆饲养和处理严格按照《实验动物管理规则》进行。
32.3.样品采集
33.养殖实验结束后，所有鱼均禁食24小时。各组大菱鲆幼鱼用20mg/l三卡因麻醉。采样前测量每个养殖桶内的鱼体重，每个养殖桶内随机取4尾鱼，保存于-80℃下用于体成分测量。每个养殖桶再随机选取4尾鱼，采集每条鱼的肝脏称重，计算肝体指数，同时采集肠道样本，用4％多聚甲醛固定液固定，后续进行组织切片形态学检测。此外，每个养殖桶随机选取4尾鱼，使用肝素注射器从尾静脉采集血液样本，在4℃静置过夜后，在4℃下4000g离心10分钟，得到血清，同时采集鱼体的肝脏、脾脏和远端肠样本，立即在液氮中冷冻，-80℃保存以供进一步分析。
34.4.鱼体组成分析
35.对大菱鲆全鱼的水分、粗蛋白质、粗脂肪、灰分含量进行分析。将样品在105℃烘箱烘干48小时至恒重以测定水分含量。使用凯氏定氮仪(kjeltec tm 8400，foss，瑞典)测定粗蛋白含量。粗脂肪含量采用索氏法(buchi 36680，瑞士)进行乙醚萃取分析。灰分含量通过在马弗炉中550℃下焚烧16小时进行测量。
36.5.肠道组织切片
37.大菱鲆远端肠道固定组织段，按标准组织学程序，乙醇脱水，二甲苯平衡，石蜡包埋。使用旋转切片机(lecia jung rm 2016，德国)切取厚度约为7μm的组织片段，放置于载玻片上，并用苏木精和伊红(h&e)染色。利用图像分析软件image j pro6.0(media cybernetics，silver spring，md，美国)分析显微照片，确定绒毛高度、固有层宽度和肌层厚度。
38.6.rna提取和cdna的合成
39.使用rnaeasy
tm
动物rna抽提试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)提取rna，根据rna的浓度，使用hiscript ii q select
rt
supermix反转录试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司，南京)将所得rna反转录成cdna，具体步骤严格遵守试剂盒说明进行。所得cdna用于实时荧光定量pcr检测基因表达量。
40.7.实时荧光定量pcr
41.使用定量pcr仪(cfx96tm real-time system，bio-rad，美国)进行基因表达定量
分析，试剂为sybr premix ex taq
tm
(takara，日本)。反应程序为：95℃ 5min；95℃ 5s；58℃ 15s；72℃ 20s，共40个循环。
42.8.大菱鲆头肾巨噬细胞的分离与培养
43.分离大菱鲆头肾，用含有抗生素(100ku/ml青霉素、10mg/ml链霉素和25mg/ml两性霉素)l-15培养基清洗两遍，将其切成小块，过100μm细胞筛，得到的细胞悬液用培养基清洗两遍之后，用34％/51％percoll液进行密度梯度离心(400g，4℃，30min)，并收集位于交界处的细胞。用台盼蓝染色法检测细胞存活率在90％以上，并用细胞计数仪计数，加入细胞培养板中，24℃培养2小时后除去未贴壁的细胞，继续培养贴壁巨噬细胞用于后续试验。
44.9.细胞杀菌率测定
45.在大菱鲆头肾巨噬细胞培养板中，按照1∶1的比例加入迟钝爱德华氏菌。24℃培养2小时后，常温离心收集细胞，并在预冷的纯水中涡旋震荡破碎细胞，将细胞裂解液以适当的比例稀释，涂布到lb平板上，在28℃下过夜培养，并对活菌数目进行统计计算。
46.10.溶菌酶活性、一氧化氮(no)和活性氧(ros)含量的测定
47.细胞上清溶菌酶活力及细胞内no及ros的含量分别使用溶菌酶测试盒(建成生物工程研究所，南京)，daf-fm da(no荧光探针)(碧云天生物技术有限公司，上海)，活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)，具体操作严格遵循说明书进行。
48.本发明实验设计流程图见图1。
49.二.实验材料
50.其中，采用的饲料配方如表1所示。
51.表1试验中使用的不同饲料配方
[0052][0053]
三.实验结果
[0054]
1.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆幼鱼生长性能的影响
[0055]
研究结果表明，饲料中添加0.5％或1.0％丙酸钠可以有效改善饲料中高比例豆粕引起的鱼体生长性能下降，其中0.5％丙酸钠添加组大菱鲆完全达到甚至超出鱼粉蛋白源饲料喂养组(表2)。
[0056]
表2.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆幼鱼生长性能的影响
[0057][0058]
注：不同上标字母表示差异显著(p＜0.05)。
[0059]
2.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆幼鱼体组成的影响
[0060]
通过检测大菱鲆全鱼中水分、粗脂肪、粗蛋白以及灰分的组成发现，不同饲料投喂组对鱼体的体组成并无显著差异(表3)。
[0061]
表3.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆幼鱼体组成的影响
[0062][0063]
2.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆肠道组织结构及通透性的影响
[0064]
肠道组织形态学的研究结果(图2a)显示，当饲料中豆粕替代45％鱼粉蛋白后，大菱鲆的肠绒毛高度(图2b)和肌层厚度(图2d)显著降低，而肠固有层(图2c)显著增加(p＜0.05)。同时，肠道紧密连接蛋白的基因表达，包括z0-1(e)，occludin(f)和claudin(g)显著降低。而饲料中添加0.5％或1％丙酸钠组的大菱鲆，所有指标都恢复到对照组水平。这些结果说明当饲料中添加0.5-1.0％的丙酸钠能有效缓解饲料中添加高比例豆粕时对大菱鲆肠道结构和功能所造成的损害。
[0065]
3.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆体内抗炎因子的影响
[0066]
通过检测大菱鲆体内促炎因子(tnf-α、il-1β、il-6)以及抗炎因子(il-10、tgf-β)的基因表达发现，高比例豆粕饲料投喂大菱鲆引起鱼体系统性炎症，其肠道(图3a)、肝脏(图3b)和脾脏(图3c)中促炎因子的基因表达水平显著升高，而抗炎因子则显著下降。饲料中添加0.5％或1.0％丙酸钠显著抑制促炎因子的表达，同时提高抗炎因子的表达。
[0067]
4.高比例豆粕饲料中添加丙酸钠对大菱鲆抗感染免疫能力的影响
[0068]
投喂实验结束之后，每组随机选出10尾大菱鲆，每条鱼腹腔注射1
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107cfu爱德华氏菌，每6小时记录感染大菱鲆的死亡率。实验结果显示，高比例豆粕组大菱鲆在感染迟钝爱德华氏菌后36h全部死亡，对照组存活率为40％，而添加0.5％或1.0％丙酸钠组大菱鲆的存活率分别为25％和60％(图4a)。在感染12h后，检测每组大菱鲆脾脏含菌量，同时分析肠道和脾脏中溶菌酶的含量。结果表明，高比例豆粕组大菱鲆脾脏中病菌含量显著高于对照组(图4b)，而饲粮中添加丙酸钠抑制了大菱鲆脾脏中的病菌载量，同时恢复体内溶菌酶活性至对照组相似的水平(图4c-d)。
[0069]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的
变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。