一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用与流程

1.本发明涉及微生物合成生物学技术领域，特别涉及一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用。


背景技术：

2.1.抗病代谢途径的标准化与模块化设计
3.随着耐药菌株的不断增加，目前迫切需要寻找绿色安全的抗生素替代品，而微生物可产生多种多样具生物活性的天然次级代谢产物，将在医疗、农业和食品等领域有着广阔的应用前景，有望作为新药产生的主要来源之一。但目前存在某些次级代谢产物的生物合成基因簇处于沉默状态，产物不易制备以及产量低等问题。
4.合成生物的应运而生将有助于解决以上难题。合成生物学是在系统生物学的研究基础上，引入工程学原理和方法，从头构建具有可预测行为的人工生物装置和系统，包括计算模型和模块化dna，通过标准的设计和模块组件间的相互连接从而建立代谢途径并构建生物回路来控制细胞行为。因此基于系统生物学与合成生物学的微生物底盘细胞的设计与开发，可实现优良细胞工厂的构建与改造。目前，科学家已开发出异源表达合成生物学平台，而大肠杆菌因有完善的遗传工具箱，已被认为是高效的异源宿主，通过异源表达途径重建与基因工程相结合，从而达到发现新化合物，阐明产物合成途径，优化产品产量的目的。
5.2.短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)
6.短小芽孢杆菌可产生多种具抗菌活性的代谢产物包括表面活性素，丰霉素，杆菌素d和几丁质酶，具有生物防治及促生功能，是一种良好的生物防治剂。但近年来发现，短小芽孢杆菌不仅可作为生防菌，还可引起人类各种感染，包括血液感染，皮肤感染，食物中毒，新生儿败血症，心内膜炎等。万古霉素治疗被认为是芽孢杆菌感染的首选药物，同时可使用青霉素，β-内酰胺抗生素，头孢曲松等抗生素治疗短小芽孢杆菌感染，但对克林霉素具有抗性。
7.3.细菌素(bacteriocin)
8.细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽。细菌素具有分子量小、易被蛋白酶降解而无残留，对人体无毒副作用等优点，目前可用于食品防腐、人类疾病防治和生物防治等。细菌素的合成通常需要多个模块相互作用。
9.4.耐硼赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus boronitolerans)
10.在我们此前的工作中分离获得一株耐硼赖氨酸芽孢杆菌，并对其进行研究，研究发现，该菌株及其发酵液对于槟榔根腐病菌、水稻纹枯病菌、稻瘟病菌等病菌均具有良好的抑菌活性(参见专利文献cn111100806a、cn111100805a、cn111187726a)，但对于耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制短小芽孢杆菌方面、其细菌素基因以及合成生物学方面的研究尚未涉及。


技术实现要素：

11.鉴以此，本发明提出一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法及其在抑制短小芽孢杆菌中的应用。
12.本发明以实验室保存的一株可拮抗多种病原细菌和病原真菌的潜在拮抗生防菌耐硼赖氨酸芽孢杆菌为研究对象，对其基因组进行分析，挖掘细菌素基因簇，再以大肠杆菌为底盘宿主细胞，通过异源表达细菌素基因簇，使用合成生物学针对特定目标重新设计系统的方法，最终生产出具有生物学活性的细菌素抗菌活性物质。
13.优选的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus boronitolerans)于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏编号为cctcc no.m 2019773。
14.本发明的技术方案主要包括以下内容：
15.本发明提供一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物在抑制短小芽孢杆菌中的应用。
16.优选的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物为通过底盘宿主细胞异源表达细菌素基因簇所得，该基因簇的核苷酸序列如如seq id no.1所示。
17.优选的，所述抑制为抑制短小芽孢杆菌的生长。
18.一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物的制备方法，包括以下步骤：
19.1)耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组dna：采用过夜培养的耐硼赖氨酸芽孢杆菌菌液提取基因组dna；
20.2)基因簇的pcr扩增：以步骤1)提取的基因组dna为模板进行pcr扩增，扩增结束后，对pcr产物进行纯化回收，得目的基因簇dna片段；
21.3)质粒的双酶切及凝胶回收：用限制性内切酶对质粒进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切下含目的载体的凝胶，纯化，得克隆载体；
22.4)无缝克隆连接：使用无缝克隆连接的方法连接步骤2)的目的基因簇dna片段和步骤3)的克隆载体，得重组质粒；
23.5)转化：将步骤4)的重组质粒转化底盘宿主细胞，转化结束后，筛选含有重组质粒的细胞；
24.6)培养：将步骤5)筛选出的细胞进行培养，得发酵液，提取发酵液，得细菌素类似物。
25.优选的，所述pcr扩增的引物为bac(10)-f和bac(10)-r。
26.优选的，所述bac(10)-f的核苷酸序列如seq id no.2所示。
27.优选的，所述bac(10)-r的核苷酸序列seq id no.3所示。
28.优选的，所述pcr扩增的扩增体系为50μl，包括：2
×
pcr mix 25μl、模板1μl、bac(10)-r(10μmol/l)1μl、bac(10)-f(10μmol/l)1μl、余量为ddh2o。
29.优选的，所述pcr扩增的扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，tm-5℃退火30s，72℃延伸，根据目的条带大小，按照1kb/min计算延伸时间，循环30次；72℃延伸10min；4℃。
30.优选的，所述限制性内切酶为bamhi和ecori。
31.优选的，所述双酶切的体系为30μl，包括：质粒xμl，限制性内切酶a 1μl，限制性内切酶b1μl，10
×
cutsmartbuffer 3μl，余量为ddh2o。
32.优选的，所述转化为电击转化法。
33.优选的，所述电击转化法，具体包括以下步骤：将感受态细胞置于冰上使其溶解，加入步骤4)的重组质粒，吹打混匀，得菌液，然后将菌液转移到已灭菌预冷后的电转杯中，进行电击转化，转化结束后加入lb液体培养基，复苏，离心，收集菌体，弃上清，加入lb液体培养基，悬浮菌体，涂布到壮观霉素抗性平板上，在37℃培养12-16h。
34.优选的，所述复苏为在37℃、150rpm复苏1h。
35.优选的，所述底盘宿主细胞为感受态细胞，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌bl21感受态细胞。
36.优选的，所述提取为采用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取得到细菌素类似物，具体步骤为向发酵液中添加硫酸铵，使硫酸铵饱和度为80％，所得沉淀即为细菌素类似物。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
38.1.与传统的抗生素相比，细菌素具有分子量小，易被蛋白酶降解而无残留，对人体健康和环境无害等优点。本发明结合成生物学以及基因工程的方法进行生物合成改造，获得了耐硼赖氨酸芽孢杆菌细菌素类似物，经验证该细菌素类似物对短小芽孢杆菌生长具有明显的抑制作用，可用于防治由短小芽孢杆菌引起的病害。
39.2.通常从原始菌株中分离纯化细菌素，该过程费时费力，并且细菌素的产量一般很低。本发明提供了一种有效的细菌素生产的替代方法，有助于快速获得细菌素并能提高细菌素产量，且成本低廉。
40.3.本发明根据目的片段比较大的特点，采用无缝克隆进行载体的构建，不仅成功率高而且操作简便。
附图说明
41.图1中a部分为本发明bacteriocin类似物生物合成基因簇的pcr扩增凝胶电泳图，得到的pcr产物条带清晰，大小约为8932bp，与预期的大小一致，表明成功从耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组上扩增出该基因簇；
42.图1中b部分为本发明基因簇异源表达重组质粒菌落pcr凝胶电泳图，使用验证引物进行菌落pcr扩增验证，得到581bp左右的验证片段，符合预期的片段大小，说明载体构建成功；
43.图2为本发明重组e.coli bl21发酵液对短小芽孢杆菌生长的影响；
44.图3为本发明使用滤纸片法检测采用硫酸铵沉淀法提取得到的bacteriocin类似物对短小芽孢杆菌的抑制作用，图中a为对照组，是用含空质粒的e.coli bl21 28h的发酵液处理短小芽孢杆菌，b为实验组，是用含基因簇的重组质粒的e.coli bl21 28h发酵液处理短小芽孢杆菌。
具体实施方式
45.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本发明做进一步的说明。
46.本技术中出现的一些名词具有如下释义：
47.本发明所述的细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有
抑菌活性的蛋白或多肽。细菌素具有分子量小、易被蛋白酶降解而无残留，对人体无毒副作用等优点，目前可用于食品防腐、人类疾病防治和生物防治等。
48.本发明所述的发酵液是指菌经发酵后产生的具有细菌素类似物的液体，例如本发明中含重组质粒的e.coli bl21发酵液为250ml菌液(初始od约0.02od
600
/ml)/1000mllb培养基的装液量，在37℃下以150r/min转速培养约28h得到的发酵产物，发酵结束后，9000r/min离30min去除沉淀，收集发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤，即得到无菌的发酵滤液。
49.本发明所述的硫酸铵沉淀法是指用不同浓度硫酸铵溶液对蛋白质进行沉淀和分离的技术。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
50.本发明所述的试管法是指将发酵液与指示菌混合，每隔一段时间测量混合培养液的od
600
值，从而监测细菌的生长情况。
51.本发明所述的滤纸片法是指将已灭菌的滤纸片放置在涂有指示菌的lb固体培养基表面，滴加待测溶液，通过观察滤纸片周围的透明圈的大小从而评估待测溶液的抗菌活性。
52.实施例1 bacteriocin类似物基因簇的预测
53.上传基因组文件至可接受带注释的genbank，embl以及fasta格式的文件的基因簇预测网站，本实施例使用的网站为antismash网站；在基因簇预测完成后进行下游分析，包括结构域的分析和注释，核心化学结构的预测；然后进行clusterblast基因簇比较分析以及smcog(secondary metabolite clusters of orthologous groups of groups)分析。
54.实施例2使用无缝克隆的方法构建基因簇异源表达载体
55.1)耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组dna：取5ml过夜培养的耐硼赖氨酸芽孢杆菌菌液，按照vazyme biotech细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组dna。
56.2)基因簇的pcr扩增：以提取的耐硼赖氨酸芽孢杆菌全基因组为模板，分别以bac(10)-f和bac(10)-r为引物，pcr扩增目的基因簇，并进行凝胶电泳检测。最终得到条带清晰，与预期的大小一致(8932bp)的dna片段，表明成功的从耐硼赖氨酸芽孢杆菌基因组上扩增出该基因簇。pcr反应体系及扩增程序如表1和表2所示：
57.bac(10)-f：
58.taaggatgatttctggaattcggctaagtttttatatgagtaatgtcac；
59.bac(10)-r：
60.gttccacagggtagcggatccgccttctgttaccacttcatcaag；
61.表1 pcr扩增体系
[0062][0063][0064]
表2 pcr扩增程序
[0065][0066]
3)pcr产物纯化回收：根据vazyme biotech产物纯化试剂盒说明书进行产物纯化回收，得目的基因簇dna片段。
[0067]
4)p15a质粒的双酶切及凝胶回收：将p15a质粒用bamhi和ecori限制性内切酶进行双酶切，37℃反应6h，用1％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，在紫外灯下快速切下含目的载体的凝胶，置于1.5ml的ep管中，后续纯化步骤按照vazyme biotech产物纯化试剂盒说明书进行，得克隆载体；双酶切体系如表3所示：
[0068]
表3限制性内切酶双酶切体系
[0069][0070]
5)无缝克隆连接：按照ultra one step cloning kit试剂盒进行操作。连接体系如表4所示：
[0071]
表4无缝克隆连接体系
[0072][0073]
①
按照以下公式进行片段和载体使用量的计算，对于单片段同源重组反应。
[0074]
最适克隆载体使用量＝[0.02
×
克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)，最适插入dna片段使用量＝[0.04
×
dna片段碱基对数]ng(0.06pmol)；
[0075]
注：若插入片段的碱基数远大于克隆载体的碱基数时，要将克隆载体当做插入片段计算。
[0076]
②
按照表4进行连接体系的配制。
[0077]
③
在50℃反应5min，降至4℃或立即置于冰上冷却。
[0078]
6)电击转化bl21感受态细胞：设置电击转化程序为bacteria(细菌)。取出已灭菌预冷的电转杯。将感受态细胞置于冰上1min左右使其溶解，加入1～2μl连接产物或质粒，吹打混匀，快速将菌液转移到电转杯的凹槽中，轻轻震荡3-5下，快速擦拭电转杯外壁水珠，进行电击转化。电转完毕，加入1ml lb液体培养基，吹打混匀，37℃，150rpm复苏1h。6000rpm离心3min收集菌体，弃上清，加入100μl lb液体培养基，悬浮菌体，涂布到壮观霉素抗性平板上，37℃培养12-16h。
[0079]
7).重组质粒的筛选与鉴定：挑取抗性平板上的单菌落到装有40ul无菌水的1.5ml ep管中，置于100℃金属浴中加热10min，使菌体完全裂解，12000rpm离心1min，取1μl上清作为菌落pcr的模板，使用f3：ccttctgccactggtcgtttatc和r3：ggctttacagaaccgacaccaa t作为引物进行pcr扩增，然后通过1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行大小判断，取阳性克隆子进行质粒提取，送往上海生工责任有限公司进行测序鉴定。
[0080]
实施例3使用试管法测定发酵液对短小芽孢杆菌的抑菌活性
[0081]
挑取短小芽孢杆菌(指示菌)单菌落于5ml的lb液体培养基中37℃，150rpm过夜培养，按od
600
＝0.02的初始接种量转接至20ml的新鲜lb液体培养基中，培养至od
600
＝0.4-0.6，再以od
600
＝0.005的初始接种量转接至3ml含基因簇重组质粒的e.coli bl21菌株的发酵液中，以含有p15a空质粒的e.coli bl21菌株的发酵液作为对照，在37℃，150rpm振荡培养，分别在培养3h、5h和7h时使用分光光度计测量指示菌的od
600
值，每个时间点设置三个重复，统计数据，使用graphpad作图，结果见图2。
[0082]
从图2中可以看出，与含有空质粒的对照相比，采用表达基因簇的菌株的发酵液处理指示菌后，该指示菌的生长受到明显的抑制。
[0083]
实施例4使用滤纸片法检测采用硫酸铵沉淀法提取的细菌素类似物对短小芽孢杆菌的抗菌活性
[0084]
提取方法：向含基因簇重组质粒的e.coli bl21发酵液或空质粒的e.coli bl21的发酵液中添加硫酸铵，使硫酸铵饱和度为80％，4℃过夜沉淀。8000rpm离心10min，收集沉淀，取1g沉淀用pbs(ph7.0)溶解并定容至10ml，分别得到含有细菌素类似物或含有空质粒
e.coli bl21的发酵液提取物溶液。
[0085]
挑取指示菌的单菌落于5ml的lb液体培养基中，37℃，150rpm培养12h。按od
600
＝0.02的初始接种量转接20ml lb液体培养基中，培养至od
600
＝0.4-0.6。取108菌液于1.5ml的ep管中，6000rpm离心3min，弃上清，加入1ml的新鲜lb培养基，吹打混匀，吸取500μl至lb固体培养基上，用无菌棉签涂布均匀。将6mm的无菌滤纸片(5层)置于涂有指示菌的培养基表面。将提前准备的细菌素类似物溶液滴至滤纸片上，总量为80μl(多次少量滴加)，另滴加空质粒e.coli bl21的发酵液提取物溶液作为对照，设置三个平行板。置于30℃培养12h后观察指示菌的生长情况。
[0086]
从图3中可以看出，图3b中出现明显的抑菌圈，而图3a中未出现抑菌圈，说明含有空载质粒的对照重组大肠杆菌并不具有抑制活性，说明本发明的来源于耐硼赖氨酸芽孢杆菌的细菌素类似物，经异源表达后，能够赋予重组大肠杆菌以抑制短小芽孢杆菌的生防活性，表明短小芽孢杆菌可被本发明提取得到的来源于耐硼赖氨酸芽孢杆菌的细菌素类似物所抑制。
[0087]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。