一种抗痤疮丙酸杆菌的联合用药物组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种抗痤疮丙酸杆菌的联合用药物组合物及其应用。


背景技术：

2.痤疮是一种慢性细菌性皮脂腺炎性疾病，通常在青少年的面部和上躯干(前胸部和后背)上形成，其特征是形成粉刺，丘疹，结节，脓疱和囊肿。它是一种常见的皮肤病，在青春期感染者中占35％至90％以上。皮肤的微环境发生变化并导致宿主的炎症反应，促进痤疮病变。其中痤疮丙酸杆菌的过度生长被广泛认为是形成寻常痤疮的关键因素。
3.目前，口服或局部使用抗生素类药物为治疗痤疮的主要方法之一，但是抗生素耐药问题日趋严重。抗生素的泛滥使用导致耐药性的细菌不断出现，使得抗感染抗感染治疗愈加的困难和复杂化。传统的抗生素已经无法满足当前的治疗需求。以减少临床耐药和提高临床疗效为目的，开发出新型的抗痤疮丙酸杆菌的药物，是非常有意义的事情。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种抗痤疮丙酸杆菌的联合用药物组合物。
5.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
6.本发明提供的一种抗痤疮丙酸杆菌的联合用药物组合物，所述联合用药物组合物包括多肽rk12和克林霉素。
7.进一步的，所述联合用药物组合物为单一的复方制剂。
8.进一步的，所述联合用药物组合物为多肽rk12制剂和克林霉素制剂两种单独的制剂的组合，两种单独的制剂同时施用或依次施用
9.在本发明中，所述联合用药物组合物的给药途径包括经皮给药、口服给药、静脉注射和皮下注射等。
10.进一步的，所述联合用药物组合物的剂型包括药剂学上可接受的任意一种剂型。例如片剂、散剂、混悬剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、溶液剂、灌肠剂、泡沫剂、乳剂、膜剂、栓剂、贴剂、滴鼻剂或滴丸剂等
11.进一步的，所述联合用药物组合物还包括药剂学上可接受药用辅料中的任意一种或多种。
12.进一步的，所述联合用药物组合物为负载在药用载体上的联合用药物组合物。在具体的实施方案中联合用药物组合物可以负载于药用载体上，通过药用载体将有效活性成分传递到皮肤组织中。
13.进一步的，所述药用载体包括多孔材料、纳米乳、凝胶、脂质体、微乳、传递体和泡囊中的一种或多种。在具体的实施方案中多孔材料可以为介孔二氧化硅、树枝状聚合物、多孔碳纳米管、纳米纤维、微球、微海绵及其他多孔材料中的任一种或多种；
14.本发明还提供了上述负载在药用载体上的药物组合物制备治疗痤疮药物中的应用。
15.本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
16.本发明创造性地将药物小分子多肽rk12和药物克林霉素联合使用作为抗痤疮丙酸杆菌的联合用药物组合物，经过实验验证联合用药对痤疮丙酸杆菌和耐克林霉素痤疮丙酸杆菌都具有较好的抗菌作用。同时，小分子多肽rk12是通过细菌细胞壁膜的相互作用并诱导细胞内部内容物的泄漏，破坏细菌菌体的完整性导致细菌细胞死亡，并且可能还具有改变细菌细胞壁膜的通透性，干扰细菌细胞壁、蛋白质和dna合成以及降低酶活性，辅助抗生素等药物进入菌体内。该联合用药方法不仅可以加强抗菌肽和抗生素的杀菌效果而且有助于临床上限制抗生素耐药性的产生，为治疗痤疮提供了新策略和思路。
附图说明
17.图1为未给药组小鼠耳朵炎症程度变化图；
18.图2为给药64μg/ml克林霉素组小鼠耳朵炎症程度变化图；
19.图3为给药100μg/ml rk12组小鼠耳朵炎症程度变化图；
20.图4为给药25μg/ml rk12和32μg/ml克林霉素联合用药组小鼠耳朵炎症程度变化图。
具体实施方式
21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
22.本发明的联合用药组合物提供一种含有抗生素与抗菌肽的抗痤疮的组合物，能对痤疮丙酸杆菌产生协同的抗菌作用。
23.为了实现上述目的，本发明的多肽rk12的氨基酸序列为rwwrffkfwwkk，如seq id no.1所示，该肽是本技术人基于天然抗菌肽序列设计由akk8衍生而来的新型合成的抗菌肽，通过hplc技术分离纯化得到，对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌具有特异性的抗菌活性。另一方面本发明所述的抗生素是克林霉素，克林霉素是目前治疗痤疮的主流抗生素之一，对痤疮丙酸杆菌具有高效的抗菌效果。本发明通过抗菌肽和抗生素联合用药对由痤疮丙酸杆菌所致的痤疮具有较好的治疗效果，体外试验结果显示，本发明所述的组合物能对克林霉素耐药性痤疮丙酸杆菌产生协同的抗菌作用(联合用药指数《1)，动物试验也进一步证实了本发明所述的组合物能对痤疮丙酸杆菌所致小鼠耳朵痤疮模型产生协同的治疗作用。
24.实施例1
25.联合用药物组合物对痤疮丙酸杆菌的抑制作用
26.(1)小分子多肽rk12的制备
27.本发明采用的是α-氨基用fmoc(9-芴甲氧羰基)固相化学合成法合成氨基酸序列为rwwrffkfwwkk的抗菌肽，首先将树脂进行膨化(膨化树脂的目的是使树脂上活性基团暴露出来)，然后向膨化后的树脂中加入2.5ml的20％的哌啶去保护，同时进行氨基酸的活化。将已经活化好的氨基酸加入到已经去保护和清洗干净的树脂中进行偶联，偶联完成时候将管中液体抽干并用dmf清洗8次，全部合成完毕后将树脂转移到裂解管中加入裂解液(tfa：
phenol：tis：edt＝87.5：5：5：2.5)进行裂解。最后，向裂解液中加冰乙醚至45ml，在4000r/min转速下离心5min，取出弃上清液，重复两次后得到下层我们所需的肽链粗品。
28.hplc分离纯化的具体方法为：
29.合成的多肽粗品用制备型waters2615的反相高效液相色谱(rp-hplc，柱型:xb-c18反相柱)进行分离纯化，流动相使用超纯水和乙腈；检测波长215nm和280nm；流速为20ml/min；其中流动相a相为乙腈，b相为含0.1％tfa的超纯水。将每一个洗脱峰收集并用质谱进行目的峰的鉴定，将较纯的目的蛋白的洗脱峰收集，冻干机冻干后-20℃保存。
30.制备得到的小分子多肽rk12的纯度为95％，其氨基酸序列为rwwrffkfwwkk，其抗菌活性与其特定位置上特定氨基酸存在高度相关性，因此包括亲/疏水性、等电点和氨基酸组成等物理化学参数都会影响amps的抗菌活性。amps最初通过静电相互作用对微生物膜具有靶向作用，小分子阳离子多肽rk12的疏水性为-1.325，它能够识别阴离子微生物膜并结合，折叠形成两栖结构，其疏水面融入磷脂双层界面，导致膜破裂和崩溃。除此之外，小分子多肽rk12中富含具有高疏水性残基色氨酸和苯丙氨酸，不仅提高了该肽的抗微生物活性同时增加穿透细菌膜能力并改变其膜结构使抗菌肽不易产生耐药性。
31.(2)探究小分子多肽rk12与抗生素联合用药对耐药性痤疮丙酸杆菌的抗菌活性
32.将保藏的痤疮丙酸杆菌接种于bhi液体培养基上，37℃厌氧培养箱中培养48h后离心重悬，将菌液加入含有0.5
×
mic的克林霉素的bhi液体培养基中，混匀菌液后放入37℃恒温厌氧培养箱中培养48h，重复多次筛选出具有抗克林霉素的痤疮丙酸杆菌。
33.联合用药实验：选择抗克林霉素痤疮丙酸杆菌与抗菌肽rk12进行协同分析，确定克林霉素的mic后，使用微量稀释技术正交稀释活性最高到中等活性的克林霉素和抗菌肽，浓度范围为2倍mic到0.03倍mic。平板在37℃下孵育24小时在用酶标仪测定菌液在600nm处的吸收值。对照组采用空白培养基和加入单一药物的培养基，所有测定均以三个独立的重复进行。
34.联合用药对原始痤疮丙酸杆菌的抑菌作用见表1所示，在原始痤疮丙酸杆菌联合用药实验中，小分子多肽rk12对原始痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度为8μg/ml，克林霉素的最小抑菌浓度为0.04μg/ml，通过1/2mic rk12和1/32mic克林霉素联合用药对原始痤疮丙酸杆菌的抑菌效果由fici＝fica ficb＝a/mica b/mic计算得出联合用药指数，最后评估联合用药的作用效果。实验结果证实小分子多肽rk12和抗生素克林霉素联合用药的作用效果为协同作用，对原始痤疮丙酸杆菌的杀菌效果远远高于单独用药，为治疗痤疮提供了新策略和思路。
35.表1 rk12与克林霉素联用对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用(原始菌)
[0036][0037]
联合用药对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌的抑菌作用表2所示，在耐克林霉素痤疮丙
酸杆菌联合用药实验中，小分子多肽rk12对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌的最小抑菌浓度为8μg/ml，克林霉素的最小抑菌浓度为64μg/ml，通过1/2mic rk12和1/32mic克林霉素联合用药对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌的抑菌效果由fici＝fica ficb＝a/mica b/micb计算得出联合用药指数，最后评估联合用药的作用效果。实验结果证实小分子多肽rk12和抗生素克林霉素联合用药的作用效果为协同作用，对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌的杀菌效果远远高于单独用药，为治疗耐药性痤疮提供了新策略和思路。
[0038]
表2 rk12与克林霉素联用对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用(耐药菌)
[0039][0040]
(3)通过小鼠体内模型验证关于抗菌肽和抗生素联合用药对耐药性痤疮丙酸杆菌的协同抗菌作用
[0041]
取6周龄balb/c小鼠(22-25g)(n＝5)，随机分为4组，每组5只小鼠。一组是空白对照，剩余的三组小鼠耳内皮中注射浓度为1.0
×
108cfu/20μl的耐药性痤疮丙酸杆菌。之后，将分别施用于凡士林(50mg)的rk12(100μg)和克林霉素(64μg)以及25μg/mlrk12—32μg/ml克林霉素施用于右耳的表面。同时，将等量的凡士林应用于左耳作为对照。经过72h的皮肤涂抹给药后观察小鼠耳朵红肿情况。
[0042]
结果如图1-图4所示，对比单独克林霉素给药组小鼠，抗菌肽和抗生素联合给药治疗后，小鼠耳朵的红肿出现明显好转，组内小鼠也未见死亡现象。单独给药组相比空白对照组有一定好转但出现了组内小鼠出现了死亡现象，反映出联合用药中抗菌肽可能辅助抗生素等药物进入菌体内干扰细菌细胞壁、蛋白质和dna合成以及降低酶活性的抑菌机制与抗菌肽独特的破坏细菌壁膜的杀菌机制对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌起到双重抑菌的效果，同时对耐克林霉素痤疮丙酸杆菌导致的炎症反应也有较好的治疗效果。
[0043]
序列表
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《110》苏州佩德生物医药有限公司
[0045]
《120》一种抗痤疮丙酸杆菌的联合用药物组合物及其应用
[0046]
《141》2021-12-23
[0047]
《160》1
[0048]
《170》siposequencelisting 1.0
[0049]
《210》1
[0050]
《211》12
[0051]
《212》prt
[0052]
《213》artificial sequence
[0053]
《400》1
[0054]
arg trp trp arg phe phe lys phe trp trp lys lys
[0055]
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
[0056]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。