治疗肥胖和/或皮肤紊乱的方法和组合物与流程

治疗肥胖和/或皮肤紊乱的方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.在35u.s.c.
§
119(e)下，本技术要求2019年5月17日提交的美国临时申请号62/849,656和2020年2月10日提交的美国临时申请号62/972,462的优先权，其中每篇申请通过引用以其整体并入本文。
3.关于联邦资助研究的声明
4.本发明是在美国国立卫生研究院授予的hl111501的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。


背景技术：

5.肥胖和肥胖相关的紊乱如2型糖尿病(t2d)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)是世界各地的主要健康威胁，尤其是在发达国家。除了生活方式的改变和主要的外科手术之外，对这些病症可用治疗选择并不多。
6.因此，本领域需要允许受控的重量减轻的新组合物和/或方法。本发明解决了这种需要。


技术实现要素：

7.本发明提供治疗肥胖和/或肥胖相关的紊乱的方法。本发明进一步提供了一种治疗皮肤紊乱和/或改善头皮健康的方法。本发明进一步提供一种治疗眼部紊乱的方法。本发明进一步提供一种治疗、改善和/或预防皮肤紊乱的方法。本发明进一步提供了一种治疗、改善和/或预防受试者秃发症的方法。
8.在某些实施方式中，方法包括向有需要的受试者外用施用药学有效量的维生素d3类似物。在某些实施方式中，方法包括向有需要的受试者施用药学有效量的tslp抑制剂。本发明限定的进一步非限制性实施方式在本文其他地方叙述。
附图说明
9.附图通过示例而非限制的方式概括地示出了本技术的各种实施方式。
10.图1a-1d说明由于施用mc903，hfd喂食小鼠的预防重量增加和代谢参数改善。用正常食物(nc)或40％高脂肪饮食(hfd)喂食wt c57bl/6小鼠12周。在奇数周的星期一、星期三和星期五用载体(etoh)或mc903(2nmol/耳朵)在双耳上都对小鼠进行外用处理。(图1a)每周对小鼠称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。(图1b)在第12周对小鼠实施安乐死并称重附睾脂肪垫。(图1c、图1d)在第12周通过注射葡萄糖并随后测量血糖水平进行葡萄糖耐量试验。在第12周禁食过夜后进行homa-ir分析。*、**和***表示通过学生t-检验或anova的分别p《0.05、p《0.01和p《0.001的统计显著性。
11.图2说明mc903对hfd诱导的肝脂肪变性(hepatosteatosis)的预防。用正常食物(nc)或40％高脂肪饮食(hfd)喂食wt c57bl/6小鼠12周。在奇数周的星期一、星期三和星期五用载体(etoh)或mc903(2nmol/耳朵)在双耳上都对小鼠进行外用处理。显示了第12周肝
脏的代表性组织学图像。
12.图3显示mc903不会预防hfd喂食tslp-r ko小鼠的重量增加或改善代谢参数。用正常食物(nc)或40％高脂肪饮食(hfd)喂食tslp-r ko小鼠12周。在奇数周的星期一、星期三和星期五用载体(etoh)或mc903(2nmol/耳朵)在双耳上都对小鼠进行外用处理。在指示的时间点称重小鼠并绘制为平均值
±
sem。在第12周通过注射葡萄糖和随后测量血糖水平进行葡萄糖耐量试验。对gtt曲线进行auc分析。*表示通过学生t-检验的p《0.05的统计显著性。
13.图4说明aav8-tslp诱导hfd喂食小鼠的重量减轻。用40％高脂肪饮食(hfd)喂食wt c57bl/6小鼠4周。在第0天给小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp。每周对小鼠称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。**和***表示分别p《0.01和p《0.001的统计显著性。
14.图5说明aav8-tslp诱导先前肥胖的hfd喂食小鼠的重量减轻。用40％高脂肪饮食(hfd)喂食wt c57bl/6小鼠10周。然后在第10周给小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp。保持小鼠hfd并每周称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。*、**和***表示通过学生t-检验或anova的分别p《0.05、p《0.01和p《0.001的统计显著性。
15.图6说明aav8-tslp诱导皮下脂肪的损失。用40％高脂肪饮食(hfd)喂食wt c57bl/6小鼠10周。然后在第10周给小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp。保持小鼠hfd持续6周并进行安乐死用于组织学分析。显示的是小鼠皮肤的代表性组织学图像。
16.图7说明aav8-tslp诱导ob/ob小鼠的重量减轻。为ob/ob小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续6周。小鼠每周称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。*和***表示通过学生t-检验的分别p《0.05和p《0.001的统计显著性。
17.图8a-8e说明aav8-tslp在正常食物喂食的小鼠中诱导选择性脂肪组织损失。为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续14天。(图8a)在指示的天数为小鼠称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。在指示的天数对小鼠实施安乐死，并测量(图8b)ewat、(图8c)iwat、(图8d)bat和(图8e)股四头肌重量。**和***表示通过学生t-检验的分别p《0.01和p《0.001的统计显著性。
18.图9a-9c说明aav8-tslp不会改变肠道吸收的食物消耗。为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物或hfd持续12周。(图9a)平均每周食物消耗绘制为平均值
±
sem。在aav8注射后第10天，小鼠口服固定量的(图9b)葡萄糖或(图9c)橄榄油。测量随后的葡萄糖水平和甘油三酯水平并随时间绘制。
19.图10a-10b说明与aav8-对照处理的小鼠相比，aav8-tslp处理的小鼠排泄较少的粪便能量。为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续9天。在第9天和第11天之间收集粪便并测量单独笼养小鼠的食物消耗。对收集的粪便进行弹式量热法以测量粪便热量。(图10a)显示了aav8-对照或aav8-tslp处理的小鼠每天的粪便能量含量。(图10b)显示了每天的净能量摄入，如通过食物热量摄入减去aav8-对照或aav8-tslp处理的小鼠的粪便热量所计算的。通过学生t-检验进行统计分析。
20.图11说明aav8-tslp在注射后第7-10天之间增加了食物消耗。为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。在过去48小时内绘制每小时和累计食物消耗。
21.图12说明aav8-tslp在注射后第7-10天之间不会增加耗氧量。为wt c57bl/6小鼠
注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。分别绘制了过去48小时和72小时内的每小时(左图)和每天/每半天(右图)耗氧量。
22.图13说明aav8-tslp在注射后第7-10天之间不会增加二氧化碳输出。为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。分别绘制了过去48小时和72小时内的每小时(左图)和每天/每半天(右图)二氧化碳输出。
23.图14说明aav8-tslp在注射后第7-10天之间不会增加运动活动。为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。分别绘制了过去48小时和72小时内的每小时(左图)和每天/每半天(右图)运动活动。
24.图15说明aav8-tslp导致先前肥胖的hfd喂食小鼠出现油性皮毛。wt c57bl/6小鼠喂食40％高脂肪饮食(hfd)持续10周。然后在第10周给小鼠注射aav8-tslp。保持小鼠hfd持续6周。显示了第6周小鼠的代表性照片。
25.图16说明aav8-tslp不会诱导正常食物喂食的scd1 ko小鼠的脂肪组织损失。wt c57bl/6或scd1 ko小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp，并喂食正常饮食14天。将小鼠安乐死并测量ewat重量。通过学生t-检验进行统计分析。
26.图17a-17b说明aav8-tslp以t细胞依赖性方式诱导重量减轻。(图17a)rag ko小鼠和(图17b)tcr-βko小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp。在注射后第14天称重附睾白色脂肪组织(ewat)。数据绘制为平均值
±
sem。
27.图18不受理论束缚说明tslp诱导的脂肪组织损失的非限制性的提议模型。全身tslp的升高可以通过用mc903外用处理、注射重组tslp或使用病毒载体进行基因疗法来实现。全身tslp水平的增加直接或间接导致皮肤脂质分泌，这增加了生物体的脂肪能量需求。这导致脂肪和其他含有脂肪的(fat-harboring)组织中的脂肪储存的释放(脂解作用)。这最终导致重量减轻和肥胖的逆转。
28.图19说明在表达高水平tslp的小鼠中皮下脂肪明显减少的发现。
29.图20说明以剂量依赖方式表达高水平tslp的小鼠中内脏脂肪明显减少的发现。
30.图21显示注射aav8-tslp的小鼠展示了其皮毛上的皮脂成分增加。wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续10天。从小鼠身上剃去固定区域的背部皮毛并提取脂质。提取的脂质进行薄层层析，并将脂质成分分离为蜡单酯(wme)、蜡二酯(wde)、游离脂肪酸(ffa)和游离胆固醇(fc)。通过image j软件量化该量并绘制。**表示通过学生t-检验的p《0.01的统计显著性。
31.图22显示注射aav8-tslp的小鼠展示了ki67 基底层皮脂腺细胞增加。wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续10天。皮肤被移出并固定。石蜡包埋的皮肤组织切片用抗ki67抗体进行染色。计数ki67 基底层皮脂腺细胞的数量并计算ki67 /总皮脂腺细胞的分数。**表示通过学生t-检验的p《0.01的统计显著性。
32.图23显示与wt小鼠相比，tslp-r ko小鼠展示在其皮毛上的皮脂脂质成分减少。从wt c57bl/6小鼠或tslp-r ko小鼠剃去固定区域的背部皮毛并提取脂质。提取的脂质进行薄层层析，并将脂质成分分离为蜡单酯(wme)、蜡二酯(wde)、游离脂肪酸(ffa)和游离胆固醇(fc)。通过image j软件量化该量并绘制。**表示通过学生t-检验的p《0.01的统计显著性。
33.图24显示注射aav8-tslp的小鼠皮肤中具有抗微生物肽的增加表达。wt c57bl/6
小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物10天。移出皮肤并提取rna。通过qpcr测量了导管素(cathelicidin)抗微生物肽(camp)和防御素b4(def4b)这两种与皮脂相关的抗微生物肽的转录水平。*表示通过学生t-检验的p《0.05的统计显著性。
34.图25说明mc903的外用涂抹远距地(remotely)增加了人类个体的皮脂分泌。每天将mc903外用涂抹于个体的右臂。皮脂测量是通过用乙醇擦拭前额，静置15分钟，然后将皮脂带放置在前额上2分钟来获得的。胶带的蓝色和白色背景上的黑点表示治疗后每天存在皮脂。
35.图26说明mc903的外用涂抹可以远距地治愈人类个体的手部的干燥皮肤。每天将mc903外用涂抹于个体的右臂。显示了治疗后3或5天前后右手的照片。该个体总共治疗了14天，即使在治疗停止后至少9周内不需要护手霜。在某些实施方式中，皮脂分泌在停止治疗后持续。
36.图27说明mc903的外用涂抹远距地促进人类个体的头皮毛发生长。mc903每天外用涂抹于个体的左臂，持续14天(第一治疗)。治疗停止4周，然后每天在右臂上再重新开始治疗2周(第二治疗)。显示治疗前、第一治疗后2周、第二治疗2后11天和第二治疗后8周头皮的照片，以及显示了治疗后3天或5天后头皮的照片。
37.图28显示mc903的外用涂抹远距地改善了两个人类个体的干眼症状。每天将mc903外用涂抹于个体的左臂和另一个体的右腿，持续14天(第一治疗)。在治疗前后主观评价两个个体的干眼症状的存在。以条形图绘制响应。
38.图29a-29f说明1tslp诱导选择性白色脂肪损失并逆转肥胖和相关的代谢并发症。图29a：aav后hfd喂食的小鼠的重量(对照-aav或tslp-aav)。(n＝5小鼠/组)。肥胖小鼠的(图29b)重量、(图29c)葡萄糖耐量试验(gtt)、和(图29d)肝脏tg(在aav前hfd持续10w，n＝5nc，10hfd-ctrl，和8hfd-tslp小鼠)。图29e：注射aav的mcdd喂食的小鼠325的血清alt(n＝7小鼠/组)。图29f：aav后2w的nc喂食的小鼠的组织质量(n＝6小鼠/组)。数据为来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m.。anova(图29a-29c)或学生t-检验(图29d-29f)。统计数据：(图29a)f＝18.96,dfn＝1,dfd＝8。(图29b)f＝32.29,dfn＝1,dfd＝16。(图29c)nc vs.hfd-ctrl：f＝14.33,dfn＝1,dfd＝13,nc vs.hfd-tslp：f＝1.753,dfn＝1,dfd＝11,hfd-ctrl vs.hfd-tslp：f＝27.71,dfn＝1,dfd＝16。(图29d)t＝9.835,df＝23。(图29e)t＝2.560,df＝12。(图29f)ewat：t＝8.128,iwat：t＝7.226,bat：t＝1.150，和肌肉：t＝0.2566，具有df＝10，对于所有组织。
39.图30a-30f说明t细胞中的tslpr信号传导是tslp驱动的脂肪损失所需要的。aav后2w下述小鼠的ewat质量：(图30a)e-βko小鼠(n＝5小鼠/组)，(图30b)acd4
±
acd8-注射的wt小鼠(n＝4ctrl和6tslp小鼠，对于所有组)，(图30c-30d)转移有cd4 或cd8 t细胞(n＝5小鼠/组，对于所有组，除了cd8 t转移的-tslp小鼠，其中n＝6小鼠)和wt或tslpr ko t细胞(n＝8wt t和10tslpr ko t转移的小鼠)的rag ko小鼠，和(图30e)转移有wt或tslpr ko t细胞的tslpr ko小鼠(n＝8小鼠/组)。(图30f)抗体注射前(aav后2w,n＝4小鼠/组)，同种型(aav后4w,n＝5小鼠/组)或acd4 acd8抗体注射(aav后4w，n＝8ctrl和7tslp小鼠)后2w的aav注射的wt小鼠的ewat质量。数据为来自2个(图30a-c，30e-30f)或3个(图30d)独立实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验。统计数据：(图30a)t＝0.0466,df＝8。(图30b)acd4：t＝6.231,df＝8,acd8：t＝5.032,df＝8，和acd4
±
acd8：t＝0.1433,df＝8。(图30c)cd4 ：t＝
8.787,df＝8,cd8 ：t＝3.598,df＝9。(图30d)wt：t＝7.103,df＝12,tslpr ko：t＝0.2950,df＝18。(图30e)wt：t＝6.255,df＝14,tslpr ko：t＝0.8481,df＝14。(图30f)ab之前：t＝3.994,df＝6，同种型ab：t＝34.95,df＝8,acd4 acd8：t＝4.641,df＝13，ab之前tslp vs.acd4 acd8 tslp：t＝3.151,df＝9，同种型ab tslp vs.acd4 acd8 tslp：t＝11.17,df＝10。
40.图31a-31j说明tslp通过促进t细胞介导的皮脂分泌来诱导脂肪损失。(图31a)3天内的食物消耗(n＝7ctrl和8tslp小鼠)，(图31b)粪便热量(n＝5小鼠/组)，和(图31c)aav后9-11d 3nc喂食的小鼠的能量消耗(n＝7ctrl和8tslp小鼠)。aav后4w时hfd喂食的小鼠的(图31d)大体外观和(图31e)tlc量化(ce＝胆固醇酯，we＝蜡酯，tg＝甘油三酯，ffa＝游离脂肪酸，fc＝游离胆固醇，n＝9小鼠/组)。(图31f-31g)aav后10d nc喂食的小鼠的皮脂腺ki67染色和量化。(n＝78ctrl和50tslp皮脂腺，来自3小鼠/组)。(图31h)aav后2w来自wt和rag ko小鼠的皮毛脂质的tlc量化(n＝5小鼠/组)。(图31i)aav后10d皮肤cd3染色。(图31j)aav后2w wt vs scd1 ko小鼠的ewat质量(n＝5wt小鼠/组和6scd1 ko小鼠/组)。数据为来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验(图31a-31b、31e、31g-31h、31j)或anova(图31c)。统计数据。(图31a)t＝2.624,df＝13。(图31b)t＝3.046,df＝9。(图31c)f＝0.9142,dfn＝1,dfd＝13。(图31e)ce：t＝4.079,we：t＝2.931,tg：t＝3.721,ffa：t＝3.346,fc；t＝4.273,df＝16，对于所有比较。(图31g)t＝3.763,df＝12。(图31h)wt ce：t＝2.561,rag ko ce：t＝0.4456,wt we：t＝4.380,rag ko we：t＝1.163,wt ffa：t＝5.333,rag ko ffa：t＝1.990,wt fc：t＝3.388,ko fc：t＝1.632,df＝8，对于所有比较。(图31j)对于wt
–
ctrl vs.tslp：t＝4.858,df＝8。对于scd1 ko
–
ctrl vs tslp：t＝1.440,df＝10。对于wt
–
tslp vs.scd1 ko
–
tslp：t＝4.650,df＝9。
41.图32a-32f说明tslp和t细胞在体内平衡时调节皮脂分泌。(图32a)wt vs.tslpr ko小鼠的tlc量化(n＝11小鼠/组)。(图32b-32c)wt vs.tslpr ko皮脂腺的ki67染色和＝量化(n＝132wt和109tslpr ko皮脂腺，来自3小鼠/组)。(图32d)wt小鼠vs.e-βko小鼠的tlc量化(n＝4wt和3e-βko小鼠)。(图32e)公开可用的人类皮肤微阵列数据中tslp表达vs.皮脂腺(sg)基因表达的线性回归分析(n＝36健康个体)。(图32f)tslp驱动的皮脂分泌的药理学和稳态作用的说明性非限制性模型。数据是来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m(图32a-32d)。学生t-检验(图32a,32c-32d)，或pearson’s r和线性回归斜率检验(图32e)。统计数据：(图32a)ce：t＝1.530,we：t＝3.924,ffa：t＝1.748,fc：t＝1.052,df＝20，对于所有比较。(图32c)t＝3.139,df＝239。(图32d)ce：t＝4.219,we：t＝4.234,ffa：t＝1.555,fc：t＝1.636,df＝5，对于所有比较。(图32e)f＝9.393,dfn＝1,dfd＝34。
42.图33a-33j说明tslp刺激重量减轻并改善代谢参数。(图33a)aav后，hfd喂食的小鼠的％重量变化(n＝5小鼠/组)。aav后nc喂食的ob/ob小鼠的(图33b)重量和(图33c)％重量变化(n＝4小鼠/组)。aav后4w肥胖小鼠(之前喂食hfd持续10w)的(图33d)％重量变化(n＝9小鼠/组)，(图33e)ewat质量(n＝9ctrl和8tslp小鼠)，(图33f)禁食葡萄糖(n＝8小鼠/组)，(图33g)禁食胰岛素(n＝8小鼠/组)，(图33h)homa-ir(n＝8小鼠/组)，(图33i)gtt量化(n＝5nc，10hfd-ctrl，和8hfd-tslp小鼠)，以及(图33j)肝脏h&e组织学。数据显示为来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m.。带有sidak事后检验的anova (图33a-33d)或学生t-检验(图33e-33i)。统计数据：(图33a)f＝19.27,dfn＝1,dfd＝8。(图33b)f＝1.911,dfn＝1,dfd＝6。第1周：t＝0.4474,df＝4.910，第2周：t＝0.1274,df＝4.365，第3周：t＝1.543,df＝3.482，第4周：t＝2.524,df＝3.217，第5周：t＝3.282,df＝3.365。(图33c)f＝5.139,dfn＝1,dfd＝6。第1周：t＝1.857,df＝4.992，第2周：t＝0.1761,df＝4，第3周：t＝2.445,df＝5.674，第4周：t＝2.342,df＝5.967，第5周：t＝2.833,df＝5.914。(图33d)f＝10.05,dfn＝1,dfd＝16。(图33e)t＝10.81,df＝15。(图33f)nc vs.hfd-ctrl：t＝6.692,nc vs.hfd-tslp：t＝0.2312,hfd-ctrl vs.hfd-tslp：t＝6.129,df＝14，对于所有比较。(图33g)nc vs.hfd-ctrl：t＝2.757,fnc vs.hfd-tslp：t＝0.5797,hfd-ctrl vs.hfd-tslp：t＝3.144,df＝14，对于所有比较。(图33h)nc vs.hfd-ctrl：t＝4.381,nc vs.hfd-tslp：t＝1.899,hfd-ctrl vs.hfd-tslp：t＝3.783,df＝14，对于所有比较。(图33i)nc vs.hfd-ctrl：t＝3.688,df＝13,nc vs.hfd-tslp：t＝1.296,df＝11,hfd-ctrl vs.hfd647 tslp：t＝5.141,df＝16。
43.图34a-34l说明tslp改善了mcdd-驱动的肝脏损伤并诱导nc喂食的小鼠中选择性白色脂肪损失。(图34a)肝脏tgs(n＝5nc、10mcdd ctrl和10mcdd tslp小鼠)，(图34b-34d)aav后mcdd喂食的小鼠的picrosiriusred肝脏染色和量化(n＝15小鼠/组)。aav后2w nc喂食的小鼠的(图34e)ewat、(图34f)iwat、(图34g)bat、和(图34h)股四头肌质量(n＝6小鼠/组，对于所有组织)、(图34i)aav前(第0天)和后(第14天)的nmr分析(n＝5小鼠/组)、(图34j)bcs(n＝10小鼠/组)和(图34k)％重量变化(n＝6小鼠/组)。(图34l)aav后2w tslpr ko小鼠的ewat质量(n＝7小鼠/组)。数据显示为来自2个(图34a,34e-34h,34j-34l)或3个(图34c-34d)独立实验的平均值
±
s.e.m。学生t-检验(图34a,34c-34i,34l)或带有sidak事后检验的anova(图34j-34k)。统计数据：(图34a)nc vs.mcdd ctrl：t＝9.703,df＝13,nc vs.mcdd tslp：t＝13.17,df＝13,mcdd ctrl vs.mcdd tslp：t＝4.768,df＝18。(图34b-34d)％面积：t＝5.399,df＝28，积分密度：t＝5.640,df＝28。(图34e)第3天：t＝0.9539,第7天：t＝0.6498,第10天：t＝2.183,第14天：t＝8.128。(图34f)第3天：t＝0.3344,第7天：t＝0.6961,第10天：t＝5.972,第14天：t＝7.226。(图34g)第3天：t＝1.355,第7天：t＝0.1674,第10天：t＝2.829,第14天：t＝1.150。(图34h)第3天：t＝0.4126,第7天：t＝0.0925,第10天：t＝0.5618,第14天：t＝0.2566,df＝10，对于所有比较。(图34i)ctrl前vs.之后：t＝0.3241,tslp前vs.之后：t＝3.736,ctrl之后vs.tslp之后：t＝3.111,df＝8，对于所有比较。(图34j)f＝0.000,dfn＝1,dfd＝18。(图34k)f＝2.635,dfn＝1,dfd＝10.(图34l)t＝0.5779,df＝12。
44.图35a-35e说明造血细胞中的tslpr信号传导是tslp驱动的白色脂肪损失和重量减轻所需要的。wt或tslpr ko小鼠进行辐照并用wt或tslpr ko骨髓进行重构：aav后2w nc喂食的小鼠的(图35a)示意图和(图35b)ewat质量(n＝7wt
à
wt ctrl,9wt
à
wt tslp,9ko
à
wt ctrl,9ko
à
wt tslp,7wt
à
ko ctrl,和5wt
à
ko tslp小鼠)。(图35c-35e)aav后hfd喂食的嵌合体的重量(n＝6wt
à
wt ctrl,10wt
à
wt tslp,10ko
à
wt ctrl,11ko
à
wt tslp,11wt
à
ko ctrl,和14wt
à
ko tslp小鼠)。数据是来自3个独立实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验(图35b)或带有sidak事后检验的anova (图35c-35e)。统计数据。(图35b)wt
à
wt：t＝3.959,df＝14,ko
à
wt：t＝0.0661,df＝16,wt
à
ko：t＝4.807,df＝10。(图35c)f＝8.120,dfn＝1,dfd＝14。(图35d)f＝2.727,dfn＝1,dfd＝19。(图35e)f＝22.97,dfn＝1,dfd＝23。
45.图36a-36e说明tslp驱动的脂肪损失需要适应性免疫细胞，而不是dc、嗜酸性粒细
胞或treg细胞。aav后2w下述小鼠的ewat质量：(图36a)rosa-stop-flox-dta小鼠(n＝5ctrl和4tslp mice)以及cd11ccre-rosa-stop-flox-dta小鼠(n＝5ctrl和6tslp小鼠)，(图36)rosa-stop-flox-dta小鼠(n＝5ctrl和4tslp小鼠)以及eocre-rosa-stop-flox-dta小鼠(n＝6ctrl和6tslp小鼠)，(图36c)pbs或白喉毒素(dt)处理的foxp3-gfp和foxp3-dtr小鼠(n＝6小鼠/组，除了foxp3-dtr pbs小鼠，其中n＝5小鼠)，(图36d)注射pbs或wt t细胞的rag/il2rg dko小鼠(n＝6pbs ctrl，8pbs tslp，5t细胞ctrl，和5t细胞tslp小鼠)，和(图36e)rag ko小鼠(n＝10小鼠/组)。数据显示为来自2个(图36a-36d)或3个(图36e)独立实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验。统计数据。(图36a)dta：t＝5.135,df＝7,cd11ccre-dta：t＝7.114,df＝9。(图36b)dta：t＝5.135,df＝7,eocre-dta：t＝3.928,df＝10。(图36c)foxp3-gfp pbs：t＝5.375,df＝10,foxp3-gfp dt：t＝3.954,df＝10,foxp3-dtr pbs：t＝6.100,df＝9,foxp3-dtr dt：t＝4.593,df＝10。(图36d)pbs：t＝0.6571,df＝10,t cells：t＝7.710,df＝6。(图36e)t＝0.4072,df＝18。
46.图37a-37l说明tslp不影响能量摄入、代谢率、运动活动或尿液代谢物的排泄。在aav后9-11d之间将nc喂食的小鼠放入单独的代谢室，并监测以下情况：(图37a)食物消耗(n＝7小鼠/组)，(图37d-37e)运动活动，(图37f)o2消耗，(图37g)co2产生，和(图37h)呼吸交换比率(n＝7ctrl和8tslp小鼠)。(图37b-37c)口服gtt和oftt后，血浆葡萄糖和tg水平(n＝5小鼠/组)。(图37i)aav后2w wt和ucp1 ko小鼠的ewat质量(n＝5小鼠/组，除了ucp1 ko tslp小鼠，其中n＝7小鼠)。aav后10天尿(图37j)葡萄糖、(图37k)酮和(图37l)蛋白(n＝10小鼠/组)。数据来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m.。anova(图37a-37h)或学生t-检验(图37i)。统计数据。(图37a)f＝0.8248,dfn＝1,dfd＝12。(图37b)f＝0.3628,dfn＝1,dfd＝8。(图37c)f＝3.811,dfn＝1,dfd＝8。(图37d)f＝0.5290,(图37e)f＝0.0148,(图37f)f＝0.0851,(图37g)f＝0.0374,和(图37h)f＝0.8375,dfn＝1和dfd＝12，对于所有比较图37d-37h。(图37i)wt：t＝9.401,df＝8,ucp1 ko：t＝10.26,df＝10。
47.图38a-38k说明tslp增加皮脂分泌。aav后4w来自hfd喂食的小鼠的(图38a)脂质质量和(图38b)tlc曲线(n＝9小鼠/组)。aav后10d来自nc喂食的小鼠的(图38c)脂质质量和(图38d-38e)tlc曲线和量化(n＝9小鼠/组)。(图38f)aav后10d背部皮肤h&e组织学，皮脂腺大小(红色虚线)。(图38g)腺体大小量化(n＝101ctrl和100tslp皮脂腺，来自3小鼠/组)。(图38h)aav后10d背部皮肤的油红o(oro)染色。(图38i)oro积分密度(n＝95ctrl和131tslp皮脂腺，来自3小鼠/组)。(图38j-38k)aav后10d皮脂腺中ki67

和ki67-基底细胞的数量(n＝78ctrl和50tslp皮脂腺，来自3小鼠/组)。数据显示为来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验。统计数据：(图38a)t＝6.897,df＝16。(图38c)t＝2.252,df＝16。(图38e)ce：t＝0.6720,we：t＝3.829,ffa：t＝2.238,fc：t＝1.426,df＝18，对于所有比较。(图38g)t＝6.749,df＝199。(图38i)t＝0.0985,df＝232。(图38j)t＝2.863,df＝126。(图38k)t＝0.7165,df＝126。
48.图39a-39c说明t细胞中的tslpr信号传导是tlsp驱动的皮脂分泌所需要的。(图39a)aav后2w来自wt vs.rag ko小鼠的tlc曲线。(图39b-39c)aav后2w过继转移wt或tslpr ko t细胞的rag ko小鼠的tlc曲线和量化(n＝6wt t转移的ctrl、9wt t转移的tslp、9tslpr ko t转移的ctrl和11tslpr ko t转移的tslp小鼠)。数据显示为来自2个独立实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验。统计分析。(图39c)wt ce：t＝1.196,df＝13,tslpr ko ce：t＝
0.6370,df＝18,wt we：t＝\2.695,df＝13,tlspr ko we：t＝1.122,df＝18,wt ffa：t＝2.057,df＝13,tslpr koffa：t＝0.6613,df＝18,wt fc：t＝3.111,df＝13,tslpr ko fc：t＝0.6130,df＝18。
49.图40a-40i说明tslp增加皮肤中的t细胞。(图40a)aav后10d皮肤中cd4 和cd8 t细胞的代表性细胞计数流图。(图40b-40c)皮肤t细胞的％和数量。(图40d-40e)皮肤cd4

t细胞的。(图40f-40g)皮肤cd8

t细胞的％和数量。(n＝11ctrl和9tslp小鼠)。(图40h-40i)aav后10d皮肤中cd4和cd8染色。数据显示为来自2个实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验。统计数据。(图40b)t＝3.331,(图40c)t＝3.249,(图40d)t＝4.355,(图40e)t＝3.325,(图40f)t＝2.886,(图40g)t＝3.401,df＝18，对于所有比较。
50.图41a-41h说明tslpr ko、rag ko和e-βko小鼠皮脂分泌减少。(图41a)wt vs.tslpr ko小鼠的皮毛脂质的代表性tlc曲线。(图41b)来自wt vs.tslpr ko小鼠的背部皮肤h&e组织学。(图41c)皮脂腺大小的量化(n＝106wt和95tslpr ko皮脂腺，来自3小鼠/组)。(图41d)wt vs.tslpr ko小鼠背部皮肤的oro染色和(图41e)oro量化(n＝149wt和129tslpr ko皮脂腺，来自3小鼠/组)。(图41f-41g)wt vs.rag ko皮毛脂质的代表性tlc曲线和量化(n＝5小鼠/组)。(图41h)wt vs.e-βko皮毛脂质的代表性tlc曲线。数据显示为来自2个实验的平均值
±
s.e.m.。学生t-检验。统计数据：(图41c)t＝0.9520,df＝199。(图41e)t＝3.3460,df＝276。(图41g)ce：t＝1.520,we：t＝3.924,ffa：t＝1.748,fc：t＝1.052,df＝20，对于所有比较。
51.图42a-42r说明tslp表达与健康人皮肤中多个皮脂腺基因的表达正向相关。tslp表达vs.一组sg-相关基因表达的线性回归分析：(图42a)scd,(图42b)fads2,(图42c)pparg,(图42d)fa2h,(图42e)dgat1,(图42f)dgat2,(图42g)fabp4,(图42h)fabp5,(图42i)acaca,(图42j)fasn,(图42k)awat1,(图42l)elovl1,(图42m)elovl3,(图42n)elovl4,(图42o)elovl5,(图42p)mogat1,(图42q)mogat2,(图42r)mogat3(n＝36健康个体)。pearson’s r和线性回归斜率检验。统计数据：(图42a)f＝5.691,(图42b)f＝5.09,(图42c)f＝1.202,(图42d)f＝6.386,(图42e)f＝0.9058,(图42f)f＝8.930,(图42g)f＝0.0543,(图42h)f＝6.016,(图42i)f＝4.342,(图42j)f＝4.138,(图42k)f＝5.363,(图42l)f＝6.801,(图42m)f＝9.739,(图42n)f＝3.467,(图42o)f＝3.903,(图42p)f＝3.156,(图42q)f＝3.872,(图42r)f＝0.0108,dfn＝1和dfd＝34，对于所有比较。
具体实施方式
52.现在将详细参考所公开主题的某些实施方式，其实例部分地在附图中示出。虽然将结合所列举的权利要求描述所公开的主题，但应当理解，所例示的主题并非旨在将权利要求限制为所公开的主题。
53.在本文件中，以范围格式表示的值应以灵活的方式解释，不仅包括明确引用为范围限制的数值，还包括该范围内包含的所有单个数值或子范围，就如每个数值和子范围都被明确地叙述了一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应被解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且还包括个别值(例如，1％、2％、3％和4％)和指定范围内的子范围(例如，0.1％到0.5％、1.1％到2.2％、3.3％到4.4％)。除非另有说明，否则“约x至y”的陈述与“约x至约y”具有相同的含义。同样，除非另有说明，否则“约x、y或约z”的陈述与“约x、
约y或约z”具有相同的含义。
54.在本文件中，除非上下文另有明确规定，否则术语“一个”、“一种”或“该”用于包括一个或多个。除非另有说明，否则术语“或”用于指代非排他性的“或”。陈述“a和b中的至少一个”或“a或b中的至少一个”与“a、b或a和b”具有相同的含义。此外，应当理解，本文中所使用的措辞或术语(未另外定义)仅用于描述而非限制的目的。任何章节标题的使用旨在帮助阅读文档，不应被解释为限制性的；与章节标题相关的信息可能出现在该特定章节的内部或外部。本文件中提及的所有出版物、专利和专利文件均通过引用以其整体并入本文，就好像单独通过引用并入一样。
55.在本文所述的方法中，除了明确叙述时间或操作顺序时，动作可以以任何顺序执行。此外，指定的行为可以同时执行，除非明确的权利要求语言叙述它们是分开执行的。例如，要求保护的执行x的行为和要求保护的执行y的行为可以在单个操作中同时进行，由此产生的过程将落入要求保护的过程的字面范围内。
56.定义
57.如本文所用，术语“约”可允许值或范围内的一定程度的可变性，例如在规定值或规定范围的极限的10％、5％或1％以内，以及包括确切的规定值或范围。
58.如本文所用，术语“基本上”是指大部分或主要地，如至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.99％或至少约99.999％或更多，或100％。如本文所用，术语“基本上不含”可表示不具有或具有微不足道的量，使得存在的材料量不影响包括该材料的组合物的材料特性，使得组合物为约0wt％至约5wt％的材料，或约0wt％至约1wt％，或约5wt％或更少，或小于、等于或大于约4.5wt％、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01或约0.001wt％或更少。术语“基本上不含”可表示具有微量的，使得组合物为材料的约0wt％至约5wt％，或约0wt％至约1wt％，或约5wt％或更少，或小于、等于或大于约4.5wt％、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01或约0.001wt％或更少，或约0wt％。
59.如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，其包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(harlow et al.,1999,in：using antibodies：a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny；harlow et al.,1989,in：antibodies：a laboratory manual,cold spring harbor,new york；houston et al.,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；bird et al.,1988,science 242:423-426)。
60.术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2和fv片段、线性抗体、scfv抗体、单结构域抗体，诸如sdab(vl或vh)，例如骆驼抗体(riechmann,1999,j.immunol.meth.231:25-38)，骆驼vhh结构域，其由对靶标表现出足够亲和力的vl或vh结构域组成，以及由抗体片段形成的多特异性抗体，例如包含通过铰链区处的二硫键连接的两个fab片段的二价片段，以及分离的互补决定区(cdr)或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段也可以并入单结构域抗体、大抗体、微型抗体、纳米抗体、体内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-nar和双-scfv(参
见，如，hollinger&hudson,2005,nature biotech.23:1126-1136)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽如纤连蛋白iii型(fn3)的支架中(美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。抗体片段还包括人抗体或人源化抗体或人抗体或人源化抗体的一部分。
61.如本文所用，术语“抗原”或“ag”被定义为激发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生，或特定免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。本领域技术人员会理解任何大分子——包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组dna。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码本文所用术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，本发明包括但不限于使用一种以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫反应。此外，本领域技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以合成产生或可以从生物样品中衍生。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
62.如本文所用，术语“编码序列”是指可被转录和/或翻译以产生mrna和/或多肽或其片段的核酸或其互补物或其部分的序列。编码序列包括基因组dna中的外显子或未成熟的初级rna转录物，它们通过细胞的生化机器连接在一起以提供成熟的mrna。反义链是这种核酸的互补链，可以由此推导出编码序列。相反，本文所用的术语“非编码序列”是指在体内未翻译成氨基酸的核酸或其互补物或其部分的序列，或其中trna不相互作用放置或尝试放置氨基酸的序列。非编码序列包括基因组dna中的内含子序列或未成熟的初级rna转录物，以及基因相关序列，例如启动子、增强子、沉默子等。
63.如本文所用，术语“互补”或“互补性”用于指代通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“a-g-t”与序列“t-c-a”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总体”互补性。核酸链之间的互补性对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中尤其重要。
64.如本文所用，如本文所用的术语“保守变异”或“保守取代”是指氨基酸残基被另一个生物学相似的残基置换。保守变异或取代不太可能改变肽链的形状。保守变异或取代的例子包括用一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个，或用一个极性残基取代另一个，例如用精氨酸取代赖氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺。
[0065]“编码”是指多核苷酸(诸如，基因、cdna或mrna)中特定核苷酸序列的固有特性，以用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cdna转录的模板)都可以称为编码蛋白质或该基因或cdna的其他产物。
[0066]
如本文所用，应用于核酸的术语“片段”是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”长度可以是至少约15个核苷酸；例如，至少约50个核苷酸至约100个核苷酸；至少约100至约500个核苷酸，至少约500至约1000个核苷酸；至少约1000个核苷酸至约1500个核苷酸；约1500个核苷酸至约2500个核苷酸；或大约2500个核苷酸(以及介于两者之间的任何整数
值)。如本文所用，应用于蛋白质或肽的术语“片段”是指较大蛋白质或肽的子序列。蛋白质或肽的“片段”的长度可以是至少约20个氨基酸；例如，长度至少约50个氨基酸；长度至少约100个氨基酸；长度至少约200个氨基酸；长度至少约300个氨基酸；或至少约400个氨基酸的长度(以及其间的任何整数值)。
[0067]
如本文所用，术语“一个重链抗体”或“多个重链抗体”包括源自骆驼物种的免疫球蛋白分子，通过用抗原免疫并随后分离血清，或通过编码此类抗体的核酸序列的克隆和表达。术语“一个重链抗体”或“多个重链抗体”还包括从患有重链疾病的动物中分离的或通过从动物中克隆和表达vh(可变重链免疫球蛋白)基因而制备的免疫球蛋白分子。
[0068]
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“ig”被定义为一类蛋白质，其用作抗体。b细胞表达的抗体有时称为bcr(b细胞受体)或抗原受体。包含在此类蛋白质中的五个成员是iga、igg、igm、igd和ige。iga是存在于身体分泌物中的主要抗体，所述身体分泌物例如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。igg是最常见的循环抗体。igm是大多数受试者在初级免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒方面很重要。igd是一种免疫球蛋白，其没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体。ige是一种免疫球蛋白，其通过在暴露于过敏原时导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应。
[0069]“诱导型”启动子是一种核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地链接时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时才导致该基因产物在细胞中产生。
[0070]“分离的”是指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或多肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
[0071]
如本文关于抗体所用的术语“特异性地结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，与来自一种物种的抗原特异性结合的抗体也可以与来自一种或多种物种的抗原结合。但是，这种跨物种反应性本身不会改变抗体的分类为特异性的。在另一个例子中，与抗原特异性结合的抗体也可以与抗原的不同等位基因形式结合。然而，这种交叉反应本身不会改变抗体的分类为特异性的。在一些情况下，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用，以表示相互作用取决于化学种类上存在特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“a”具有特异性，则在含有标记的“a”和抗体的反应中，含有表位a (或游离的未标记a)的分子的存在将减少与抗体结合的标记a的数量。
[0072]
如本文所用，术语“合成抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为表示通过合成编码抗体的dna分子产生的抗体，并且该dna分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中dna或氨基酸序列已经使用本领域可用的和众所周知的合成dna或氨基酸序列技术获得。
[0073]
如本文所用，术语“野生型”是指从天然发生来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相
反，术语“修饰的”或“突变体”是指与野生型基因或基因产物相比时，显示序列和/或功能特性(即改变的特征)的修饰的基因或基因产物。应注意，可以分离天然发生的突变体；这些是通过与野生型基因或基因产物相比它们具有改变的特征(包括改变的核酸序列)这一事实来鉴定的。
[0074]
除非上下文另有明确指示，否则本文所用术语“独立地选自”是指相同、不同或其混合物的参考基团。因此，在此定义下，短语“x1、x2和x3独立地选自惰性气体”将包括以下情况，例如，其中x1、x2和x3都相同，其中x1、x2和x3都不同，其中x1和x2相同但x3不同，以及其他类似的排列。
[0075]
如本文所用，术语“组合物”或“药物组合物”是指至少一种本文所述的化合物与药学上可接受的载体的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于患者或受试者。本领域存在多种施用化合物的技术，其包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼部、肺和外用施用。
[0076]“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。
[0077]
相比之下，动物的“紊乱”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但动物的健康状态不如没有紊乱时的健康状态有利。如果不加以治疗，紊乱不一定会导致动物健康状况进一步下降。
[0078]
如本文所用，术语“有效量”、“药学有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需生物学结果的药剂的量。该结果可以是疾病的体征、症状或原因的减少和/或缓解，或生物系统的任何其他期望的改变。本领域普通技术人员可以使用常规实验确定任何个体情况下的适当治疗量。
[0079]
如本文所用，术语“功效”是指在测定中实现的最大效果(emax)。
[0080]
如本文所用，术语“hfd”是指高脂肪饮食。
[0081]
如本文所用，术语“nc”是指正常食物，即正常饮食。
[0082]
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物活性或特性并且相对无毒的材料，例如载体或稀释剂，即，该材料可施用个体，而不会引起不良生物效应或以有害方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。
[0083]
如本文所用，语言“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸或碱制备的施用化合物的盐，包括其无机酸或碱、有机酸或碱、溶剂化物、水合物或包合物。
[0084]
合适的药学上可接受的酸加成盐可由无机酸或由有机酸制备。无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸(包括硫酸盐和硫酸氢盐)和磷酸(包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐)。合适的有机酸可选自脂族、脂环族、芳香族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类有机酸，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、丙二酸、糖精、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸(帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、三氟甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖酸和半乳糖醛酸。
[0085]
本文所述化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括例如铵盐、金属盐，其包括碱金属盐、碱土金属盐和过渡金属盐，例如钙盐、镁盐、钾盐、钠盐和锌盐。药学上可接受
的碱加成盐还包括由碱性胺制成的有机盐，例如n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(n-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。所有这些盐都可以由相应的化合物通过例如合适的酸或碱与化合物反应来制备。
[0086]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料，涉及在患者体内或向患者携带或运输本文所述的化合物以使其可以执行其预期功能。通常，此类构建体从一个器官或身体的一部分被携带或运输到另一个器官或身体的一部分。在与制剂的其他成分(包括本文所述的一种或多种化合物)相容的意义上，每种载体必须是“可接受的”，并且对患者无害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和其他用于药物制剂的无毒相容物质。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与本文所述的一种或多种化合物的活性相容并且对患者在生理学上可接受的任何和所有包衣、抗菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。也可将补充活性化合物并入组合物中。“药学上可接受的载体”还可包括本文所述的一种或多种化合物的药学上可接受的盐。可包含在与本文所述的方法或化合物一起使用的药物组合物中的其他另外成分是本领域已知的并且描述于例如remington's pharmaceutical sciences(genaro,ed.,mack publishing co.,1985,easton,pa)，其通过引用并入本文。
[0087]
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文中可互换使用，并且指任何动物或其细胞，无论是体外的还是原位的，都适用于本文所述的方法。在一个非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。
[0088]
如本文所用，术语“效力”是指产生一半最大响应所需的剂量(ed
50
)。
[0089]“治疗性”处理是对表现出病理学体征的受试者施用的处理，目的是减少或消除这些体征。
[0090]
如本文所用，术语“治疗”或“处理”定义为将治疗剂，即如本文所述的一种或多种化合物(单独或与另一种药剂组合)涂抹或施用至患者，或将治疗剂涂抹或施用至来自患者的分离组织或细胞系(如，用于诊断或离体应用)，所述患者具有本文所考虑的病症或本文所考虑的病症的症状，目的在于治愈、愈合、减轻、解除、改变、补救、改善、提高或影响本文所考虑的病症，或本文所考虑的病症的症状。基于从药物基因组学领域获得的知识，可以专门定制或修改此类治疗。
[0091]
如本文所用，术语“tslp”是指胸腺基质淋巴细胞生成素。
[0092]
在本公开中，可以以范围格式呈现本发明的各个方面。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1到6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如
何，这都适用。
[0093]
化合物的制备
[0094]
本文所述的化合物可以通过本文所述的一般方案使用本领域技术人员已知的合成方法来制备。以下实例说明了本文所述的一种或多种化合物及其制备的非限制性实施方式。
[0095]
本文所述的化合物可以具有一个或多个立体中心，并且每个立体中心可以独立地以(r)或(s)构型存在。在某些实施方式中，本文所述的化合物以旋光或外消旋形式存在。应当理解，本文所述的化合物包括具有本文所述的治疗有用特性的外消旋、旋光、区域异构和立体异构形式或其组合。旋光形式的制备以任何合适的方式实现，包括作为非限制性实例，通过使用重结晶技术拆分外消旋形式、从旋光起始材料合成、手性合成或使用手性固定相的色谱分离。在某些实施方式中，一种或多种异构体的混合物用作本文所述的治疗化合物。在其他实施方式中，本文所述的化合物包含一个或多个手性中心。这些化合物通过任何方式制备，包括立体选择性合成、对映选择性合成、和/或对映异构体和/或非对映异构体的混合物的分离。化合物及其异构体的拆分可通过任何方式实现，包括但不限于化学过程、酶促过程、分步结晶、蒸馏和色谱法。
[0096]
本文所述的方法和制剂包括使用具有本文所述的任何化合物结构的化合物的n-氧化物(如果合适)、结晶形式(也称为多晶型物)、溶剂化物、无定形相和/或药学上可接受的盐，以及具有相同类型活性的这些化合物的代谢物和活性代谢物。溶剂化物包括水、醚(如，四氢呋喃、甲基叔丁基醚)或醇(例如乙醇)溶剂化物、乙酸盐等。在某些实施方式中，本文所述的化合物以与药学上可接受的溶剂例如水和乙醇的溶剂化形式存在。在其他实施方式中，本文所述的化合物以非溶剂化形式存在。
[0097]
在某些实施方式中，本文所述的一种或多种化合物可以作为互变异构体存在。所有互变异构体均包括在本文所提供化合物的范围内。
[0098]
在某些实施方式中，本文所述的一种或多种化合物制备为前药。“前药”是指在体内转化为母体药物的药剂。在某些实施方式中，在体内施用后，前药被化学转化为该化合物的生物、药学或治疗活性形式。在其他实施方式中，前药通过一个或多个步骤或过程被酶促代谢成化合物的生物、药学或治疗活性形式。
[0099]
在某些实施方式中，例如，本文所述的一种或多种化合物的芳香环部分上的位点易受各种代谢反应的影响。在芳香环结构上并入适当的取代基可以减少、最小化或消除这种代谢途径。在某些实施方式中，用于降低或消除芳香环对代谢反应的易感性的适当取代基是(仅作为示例)氘、卤素或烷基。
[0100]
本文所述的化合物还包括同位素标记的化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的该原子质量或质量数的原子置换。适合包含在本文所述的化合物中的同位素的实例包括但不限于2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
36
cl、
18
f、
123
i、
125
i、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
32
p和
35
s。在某些实施方式中，同位素标记的化合物可用于药物和/或底物组织分布研究。在其他实施方式中，用更重的同位素例如氘取代提供更大的代谢稳定性(例如，增加的体内半衰期或减少的剂量需求)。在仍其他实施方式中，用正电子发射同位素，例如
11
c、
18
f、
15
o和
13
n进行的取代，在正电子发射形貌(pet)研究中是有用的，以检查底物受体占有率。同位素标记的化合物通过任何合适的方法或通过使用适当的
同位素标记的试剂代替另外使用的未标记的试剂的过程来制备。
[0101]
在某些实施方式中，本文所述的化合物通过其他方式标记，其包括但不限于使用生色团或荧光部分、生物发光标记或化学发光标记。
[0102]
本文所述的化合物使用任何合适的程序从可从商业来源获得的化合物开始合成，或使用本文所述的程序制备。
[0103]
组合物
[0104]
在某些实施方式中，可用于本文所述方法的组合物包括至少一种维生素d3类似物。在某些实施方式中，维生素d3类似物是选自以下的至少一种类似物：
[0105]
26,27-环-22-烯-1α,24s-二羟基维生素d3(也称为mc903、卡泊三烯(calcipotriene)或卡泊三醇)；
[0106]
1α,18,25-(oh)3d3；
[0107]
23-(m-(二甲基羟甲基)-22-炔-24,25,26,27(四去甲(tetranor))-1α-oh)2d3；
[0108]
1α,25-二羟基-反式-异速甾醇(也称为1,25-反式-iso-t)；
[0109]
(1s,3r,6s)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；
[0110]
(1s,3r,6r)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；
[0111]
22-(p-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲(pentanor)-d3；
[0112]
22-(m-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；
[0113]
1(s),3(r)-二羟基-20(r)-(5
’‑
乙基-5
’‑
羟基-七-1’(e),3’(e)-二烯-1
’‑
基)-9,10-断孕甾(secopregna)-5(z),7(e),10(19)-三烯(也称为eb1089)；
[0114]
1α,25-(oh)-20-epi-22-氧杂-24,26,27-三高维生素(trishomovitamin)d(也称为kh1060)；
[0115]
22-氧杂-1α,25(oh)2d3(也称为oct或22-oxa)；
[0116]
1r,25-二羟基-21-(3-羟基-3-甲基丁基)维生素d3；
[0117]
和其任意组合。
[0118]
在某些实施方式中，维生素d3类似物为mc903。在某些实施方式中，维生素d3类似物是施用给受试者的唯一生物活性剂。在其他实施方式中，mc903是施用给受试者的唯一生物活性剂。在又其他实施方式中，类似物是以足以增加受试者全身tslp水平的量施用给受试者的唯一生物活性剂。在又其他实施方式中，mc903是以足以增加受试者全身tslp水平的量施用给受试者的唯一生物活性剂。
[0119]
可以通过外用施用mc903诱导tslp产生来提高受试者的tslp水平。与载体(etoh)相比，12周内外用施用mc903导致喂食高脂肪饮食(hfd)的小鼠的重量增加显著降低(图1a)。重量增加的减少与附睾白色脂肪组织(ewat)重量的显著减少和代谢参数的改善有关，如通过葡萄糖耐量试验(gtt)和胰岛素耐性的稳态模型评估(homa-ir)所判断的(图1b-1d)。在使用mc903处理的小鼠中，肝脏中的脂肪沉积也明显减少(图2)。由外用mc903施用导致的ewat的损失、gtt和homa-ir值的改善以及肝脏沉积减少取决于体内tslp的存在，因为mc903处理不会阻止重量增加或改善tslp-r缺乏小鼠的代谢参数(图3)。
[0120]
tslp的组合物
[0121]
在各种实施方式中，可用于本文所述方法的组合物包括tslp多肽同种型或包含tslp表达序列的病毒载体。
[0122]
tslp同种型
[0123]
在各种实施方式中，受试者为人且tslp同种型与seq id no:1(mfpfallyvl svsfrkifil qlvglvltyd ftncdfekik aaylstiskd litymsgtks tefnntvscs nrphclteiq sltfnptagc aslakemfam ktkaalaiwc pgysetqina tqamkkrrkr kvttnkcleq vsqlqglwrr fnrpllkqq)或seq id no:2(mfamktkaal aiwcpgyset qinatqamkk rrkrkvttnk cleqvsqlqg lwrrfnrpll kqq)中的至少一种多肽具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性。在其他实施方式中，受试者为人且tslp同种型为选自seq id no:1和seq id no:2的至少一种。
[0124]
tslp同种型可以稳定化用于肽的体外和/或体内施用，以提供适合特定施用途径的稳定化形式，所述特定施用途径例如通过静脉内、皮下或其他腹膜内施用途径。seq id no:1、seq id no:2的稳定化tslp同种型，以及与seq id no:1或seq id no:2具有至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的肽包括在一级肽序列中具有一个或多个残基取代的肽。取代可包括将一个或多个氨基酸改变为另一种同源天然存在的氨基酸、氨基酸的d-形式、氨基酸的合成衍生物或模拟氨基酸的物理化学性质的肽模拟物部分。稳定化的tslp同种型还可以包括添加半胱氨酸残基或用半胱氨酸置换非半胱氨酸残基，使得tslp同种型可以在体外和体内都在溶液中形成二硫键。稳定化的tslp同种型还可以包括在n-或c-末端残基或两者处添加化学部分，诸如通过添加一个或多个聚乙二醇(peg)部分。合适的peg部分可包含约至约100个乙二醇单元。peg部分可以通过任何合适的化学方式共价附接至肽，包括通过酰胺键、c
1-c
10
烷基接头、氨基甲酸酯、碳酸酯等。在各种实施方式中，seq id no:1或seq id no:2的稳定化tslp同种型，以及与seq id no:1或seq id no:2具有至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的肽保留未修饰/未稳定化的肽的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的活性。
[0125]
含有tslp的病毒载体
[0126]
在各种实施方式中，tslp表达可以在体外或体内用病毒载体增强，该病毒载体并入了tslp表达序列和至少一个启动子。病毒载体可以是任何合适的腺伴随病毒(aav)，诸如腺伴随病毒的aav1-aav8家族。在一些实施方式中，病毒载体是可以感染人类的病毒载体。tslp表达序列可以插入到aav的反向末端重复(itr)之间。tslp-表达序列可以是任何合适的哺乳动物tslp序列。合适的哺乳动物tslp-表达序列的非限制性实例包括小鼠、人、猪、狗、牛、马、猫或马tslp-表达序列。在某些实施方式中，tslp-表达序列是人类序列。在各种实施方式中，病毒载体是aav8。启动子可以是甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子。在各种实施方式中，启动子是能够在肝脏中实现tslp表达的人类启动子序列。aav可以是重组aav，其中衣壳来自一种aav血清型，而itr来自另一种aav血清型。在各种实施方式中，aav衣壳选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7和aav8衣壳。在各种实施方式中，aav中的itr为选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7和aav8 itr的至少一种itr。可从vector biolabs(malvern,pa)购买表达具有tbg启动子的人或鼠tslp的合适aav。在各种实施方式中，tslp表达可以在体外或体内用aav8-tslp载体增强。如本文所用，术语“aav8-tslp”是指含有tslp-表达序列和至少一种启动子序列的aav8病毒载体(重组体或非重组体)，其在施用于受试者时引起tslp的全身表达升高。在一些实施方式中，病毒载体是含有本文所述的任意tslp表达序列的重组或非重组aav2或aav5。
[0127]
在一些实施方式中，tslp-表达序列可以是长形式的哺乳动物tslp-表达序列或短形式的哺乳动物tslp-表达序列。在一些实施方式中，tslp-表达序列是seq id no:3的长形式人tslp-表达序列：
[0128][0129][0130]
在各种实施方式中，tslp-表达序列是seq id no:4的长形式人tslp-表达序列：mfpfallyvlsvsfrkifilqlvglvltydftncdfekikaaylstiskdlitymsgtkstefnntvscsnrphclteiqsltfnptagcaslakemfamktkaalaiwcpgysetqinatqamkkrrkrkvttnkcleqvsqlqglwrrfnrpllkqq。
[0131]
在各种实施方式中，tslp-表达序列是seq id no:5的短形式人tslp-表达序列：
[0132]
在各种实施方式中，tslp-表达序列是seq id no:6的短形式人tslp-表达序列：mfamktkaalaiwcpgysetqinatqamkkrrkrkvttnkcleqvsqlqglwrrfnrpllkqq。
[0133]
在各种实施方式中，tslp-表达序列是seq id no:7的长形式小鼠tslp-表达序列：
[0134]
在各种实施方式中，tslp-表达序列是seq id no:8的长形式小鼠tslp-表达序列：mvllrslfilqvlvrmgltynfsncnftsitkiycniifhdltgdlkgakfeqiedceskpacllkieyytlnpipgcpslpdktfarrtrealndhcpgypeterndgtqemaqevqniclnqtsqilrlwysfmqspe。
[0135]
为了测试单独的tslp是否足以预防hfd喂食的小鼠重量增加，将表达tslp的腺伴随病毒(aav8-tslp)注射到小鼠体内。aav8-tslp的注射使用甲状腺素结合球蛋白(tbg)启动子在6-8周内驱动tslp在肝脏中的表达。与aav8-对照相比，接受aav8-tslp的小鼠尽管基于hfd，但重量减轻了(图4)。此外，尽管继续基于hfd，但aav8-tslp注射导致已经超重的小鼠显著重量减轻(之前基于hfd持续10周)(图5)。在5周结束时，皮肤组织学揭示这些小鼠的皮下脂肪完全损失(图6)。还对ob/ob小鼠测试了tslp的效果。ob/ob小鼠缺乏瘦蛋白，这会导致进食过多(吃得太多)和随之而来的重量增加，尽管喂食正常食物。与hfd喂食的小鼠相
似，当用aav8-tslp处理ob/ob小鼠时也观察到重量减轻(图7)。aav8-tslp还诱导正常食物喂食的小鼠的脂肪组织损失。尽管在用aav8-tslp处理的正常食物喂食的小鼠中仅观察到轻微的重量减轻(图8a)，但是与aav8-对照相比，在注射aav8-tslp后第7天和第14天之间观察到ewat和腹股沟白色脂肪组织(iwat)重量几乎完全损失(图8b、8c)。这种效果对白色脂肪组织是特异性的，因为与aav8-对照注射的小鼠相比，在aav8-tslp中未观察到棕色脂肪组织(bat)或肌肉重量的差异(图8d、8e)。
[0136]
含有本文所述的一种或多种化合物、肽和/或病毒载体的组合物包括包含本文所述的至少一种化合物、肽和/或病毒载体和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方式中，组合物被配制用于施用途径，诸如口服或肠胃外，例如经皮、经粘膜(如，舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(如，经阴道-和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和外用施用。
[0137]
通过升高tslp水平治疗、改善和/或预防肥胖和/或皮肤紊乱的方法
[0138]
肥胖:
[0139]
mc903
[0140]
在各种实施方式中，提供了治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的方法。方法包括将本文所述的至少一种维生素d3类似物外用施用至遭受肥胖或肥胖相关的紊乱的受试者。可以用这些方法治疗的肥胖相关的紊乱的类型没有特别限制，并且可以用本文所述的组合物和方法治疗由受试者体内具有过多白色脂肪组织引起的任何紊乱。与肥胖相关的紊乱的非限制性实例包括非酒精性脂肪性肝炎(nash)、代谢疾病、糖尿病(i型和ii型)、高血压、血脂异常(高ldl胆固醇、低hdl胆固醇或高水平的甘油三酯)、冠心病、中风、胆囊疾病、肾脏疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停和呼吸问题以及癌症，其包括子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胆囊癌和肝癌。在各种实施方式中，与肥胖相关的疾病是nash。
[0141]
可以通过多种现有技术认可的方法来确定肥胖，其包括测量受试者的体重指数(bmi)、腰围、腰臀比、皮褶厚度、双能x射线吸收测定法(dexa)、血液甘油三酯水平、血液胆固醇水平等。确定人类受试者是否肥胖的标准包括美国疾病控制与预防中心(cdc)颁布的标准。在各种实施方式中，肥胖的人类受试者的bmi为至少约25.0、30.0、35.0或40.0。一般而言，bmi小于约25.0的人类受试者不被认为是肥胖的，但是非肥胖个体也可以使用本文所述的组合物来减少其体内白色脂肪组织的量，以用于美学、美容、运动或其他目的。
[0142]
在各种实施方式中，治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的方法导致受试者重量减轻。由应用本文所述的方法导致的重量减轻可导致在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周的时间段内至少、大于或小于约5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％或20％的重量减少。如图1a所示，与未施用mc903的对照小鼠相比，已经施用mc903的高脂肪饮食(hfd)小鼠在12周的时间段内经历了显著较少的体重增加。图2显示hfd对照小鼠(无mc903施用)产生了显著量的白色脂肪组织(左下图)，而施用mc903的hfd小鼠具有与用正常食物喂食的小鼠组织非常相似的白色脂肪组织分布。在各种实施方式中，mc903的施用导致受试者的肌肉质量基本上没有损失。在各种实施方式中，施用导致由受试者皮肤分泌脂质。在某些实施方式中，受试者身体的白色脂肪组织的损失导致由受试者皮肤分泌白色脂肪组织的脂质成分。
[0143]
tslp肽和含有tslp的病毒载体
[0144]
在各种实施方式中，提供了治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的方法。方法包括将本文所述的至少一种tslp多肽同种型或包括本文所述的tslp表达序列的至少一种病毒载体施用至遭受肥胖或肥胖相关的紊乱的受试者。
[0145]
可以用这些方法治疗的肥胖相关的紊乱的类型没有特别限制，并且可以用本文所述的组合物和方法治疗由受试者体内具有过多白色脂肪组织引起的任何紊乱。与肥胖相关的紊乱的非限制性实例包括非酒精性脂肪性肝炎(nash)、代谢疾病、糖尿病(i型和ii型)、高血压、血脂异常(高ldl胆固醇、低hdl胆固醇或高水平的甘油三酯)、冠心病、中风、胆囊疾病、肾脏疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停和呼吸问题以及癌症，其包括子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胆囊癌和肝癌。在各种实施方式中，与肥胖相关的疾病是nash。
[0146]
在各种实施方式中，治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的方法导致受试者重量减轻。使用本文所述的方法施用至少一种tslp多肽同种型或包括tslp表达序列的至少一种病毒载体可以导致在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周的时间段内至少、大于或小于约5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％或20％的重量减少。
[0147]
为了使受试者减肥，必须存在净负能量失衡，即能量摄入(食物摄入/吸收)减少，能量消耗增加(热量产生，运动活动增加)，和/或能量输出(体外的排泄或分泌)增加。基于食物消耗(图9a)、葡萄糖吸收(图9b)和脂质吸收(图9c)，aav8-对照vs.aav8-tslp的能量摄入相似。此外，来自aav8-对照vs.aav8-tslp处理的小鼠的1天粪便收集的炸弹量热法揭示了粪便中的能量显著减少，其转化为朝向能量摄入净增加的趋势(图10)。为了更准确地测量能量摄入和消耗，从aav8注射后第7天到第10天，将aav-对照和aav8-tslp处理的小鼠放置于代谢室中。根据这些准确的测量值，在代谢室中48小时时间段内，aav8-tslp处理的小鼠中食物摄入实际上增加了约20％(图11)。尽管小鼠放置于代谢室的72小时时间段内减少了30％的其脂肪质量，但在aav8-对照和aav8-tslp处理的小鼠之间，o2消耗和co2产生(两种能量消耗的量度)和运动活动都相似(图12-14)。总之，这些数据表明，不受理论束缚，tslp不会通过减少能量摄取或增加能量消耗来诱导白色脂肪损失。图19和图20进一步说明了小鼠中的重量减轻。
[0148]
虽然对小鼠进行正常食物直到大约第4周才出现，但用aav8-tslp处理的肥胖小鼠会出现非常油腻的皮毛，因为小鼠的重量和其脂肪量都减少了(图15)。这种皮脂分泌是脂肪组织损失的原因，因为具有缺陷皮脂腺的硬脂酰coa去饱和酶1(scd1)敲除小鼠在aav8-tslp处理后不会损失脂肪组织(图31j)。
[0149]
因此，不希望受理论束缚，tslp通过诱导脂质(如，通过皮脂)通过皮肤分泌而引起脂肪损失。在各种实施方式中，施用导致由受试者皮肤分泌脂质。在某些实施方式中，由受试者身体的白色脂肪组织的损失导致由受试者皮肤分泌白色脂肪组织的脂质成分。
[0150]
为了测试在造血或非造血区室中是否需要tslp响应性，进行了骨髓(bm)移植研究。bm移植允许用来自另一只小鼠的bm替换造血区室。因此，移植有tslp-r ko bm的b6.sjl小鼠(tslp-r ko
→
b6.sjl)在非造血区室中而不是造血区室中对tslp有响应。相反，移植有b6.sjl bm的tslp-r ko小鼠(b6.sjl
→
tslp-r ko)在造血区室中而不是非造血区室中对tslp有响应。当用aav8-tslp处理时，b6.sjl
→
b6和b6.sjl
→
tslp-r ko小鼠减轻重量，而tslp-r ko
→
b6.sjl小鼠没有减轻重量，这表明tslp信号传导必须发生在造血区室中(图16)。为了更准确地鉴定所涉及的细胞类型，用aav8-tslp处理了rag ko(没有t或b细胞的小
鼠)和tcr-βko小鼠(没有t细胞)。rag ko小鼠和tcr-βko小鼠两者在用aav8-tslp处理时均未能减轻重量，这表明tslp诱导的重量减轻需要t细胞(图17)。不受理论的束缚，tslp刺激的t细胞可产生诱导由皮肤脂质分泌的因子，这驱动这些小鼠的重量减轻，从而tslp导致小鼠的白色脂肪的选择性损失。
[0151]
本文所述的方法增加受试者的tslp水平。在各种实施方式中，受试者体内的tslp水平相对于对照增加至少、大于或小于约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％，或约5％至约10％。在各种实施方式中，受试者体内的tslp水平相对于对照增加至少、大于或小于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或约40％。在各种实施方式中，施用至少一种tslp多肽同种型或包含tslp表达序列的至少一种病毒载体基本上不导致导致受试者的肌肉质量损失。
[0152]
在小鼠中通过外用mc903治疗、重组tslp同种型、或通过病毒载体(基因疗法)可使tslp升高。tslp升高导致脂质的皮肤分泌，这从而消耗能量并降低循环脂质水平。脂解作用从脂肪存储发生，以便补充消耗的脂质，这最终导致白色脂肪组织的选择性耗尽和重量减轻(图18)。
[0153]
本文所述的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的至少一种化合物，其任选地以药物组合物配制。在各种实施方式中，存在于药物组合物中的治疗有效量的本文所述的至少一种化合物是药物组合物中唯一的治疗活性化合物。在某些实施方式中，该方法进一步包括向受试者施用治疗或预防肥胖或肥胖相关的紊乱的另外的治疗剂。
[0154]
在某些实施方式中，与在实现治疗或预防受试者的肥胖或肥胖相关的紊乱中类似结果所需的单独的另外治疗剂的剂量相比，向受试者施用本文所述的一种或多种化合物允许施用较低剂量的另外治疗剂。例如，在某些实施方式中，本文所述的一种或多种化合物增强了另外的治疗性化合物的活性，从而允许较低剂量的另外的治疗性化合物以提供相同的效果。
[0155]
在某些实施方式中，本文所述的一种或多种化合物和治疗剂被共同施用于受试者。在其他实施方式中，本文所述的一种或多种化合物和治疗剂被共同配制并共同施用于受试者。
[0156]
在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。在其他实施方式中，哺乳动物是人。
[0157]
皮肤紊乱
[0158]
在各种实施方式中，提供治疗皮肤紊乱或改善头皮健康的方法。该方法包括外用施用如本文所述的至少一种维生素d3类似物，或通过直接向遭受皮肤紊乱的受试者施用tslp同种型。可以用这些方法治疗的皮肤紊乱的类型没有特别限制，并且是受益于皮脂分泌升高和/或皮肤屏障功能增加的任何紊乱。在某些实施方式中，皮肤紊乱包括湿疹/特应性皮炎、干性皮肤相关性皮炎、干性皮肤(皮肤干燥症)、鱼鳞病(所有形式)、复发性皮肤感染、皱纹(皮肤老化)、和脱发和/或毛发生长不足(诸如但不限于秃发症，诸如但不限于雄激素秃发症)。
[0159]
不受理论的束缚，发生这种脂肪组织损失的机制可能与来自tslp过表达小鼠的皮脂产生增加有关。虽然直到大约第4周才开始出现，但用aav-tslp处理的小鼠会产生油性皮毛。为了更直接地测试这一点，与注射aav8-对照的小鼠相比，从aav8-tslp的剃光皮毛中提取脂质。与油性皮毛一致，小鼠表现出增加的脂质，特别是在其皮毛上的皮脂(蜡单酯和蜡
二酯)中发现，这表明当tslp过表达时，小鼠会产生更多的皮脂(图21)。此外，皮脂腺的免疫组织化学揭示ki67 基底层皮脂腺细胞的比例增加(图22)，这表明腺体更活跃。接下来，为了测试tslp是否在控制皮脂释放方面具有生理作用，将未经操纵的wt或tslp-r ko小鼠的皮毛剃掉，并量化皮脂脂质成分的量。与wt小鼠相比，tslp-rko小鼠展示了减少量的皮脂特异性脂质成分(蜡单酯和蜡二酯)(图23)。这些数据表明皮脂释放可以通过tslp升高剂(或tslp本身)药理学上增加，并且可以通过阻断tslp来抑制。tslp还通过增加皮肤中抗微生物肽的表达来促进屏障功能(图24)。
[0160]
外用mc903在人中具有期望效果。个体在手臂上外用mc903涂抹后，显示了前额上的皮脂量增加(图25)。在手臂上外用mc903涂抹后，手部湿疹性干性皮肤显示明显改善(图26)。考虑到健康头皮为毛发生长提供了更好的环境，而湿疹/特应性皮炎会产生有缺陷的毛发生长(在线图书馆dot wiley dot com/doi/full/10dot 1002/jemt dot 21101)，通过远距方式外用mc903治疗也将促进毛发生长。事实上，在手臂上进行为期2周的外用mc903涂抹2个周期后，观察到毛发生长的基本恢复(图27)。总之，这些数据表明，如本文所述的至少一种维生素d3类似物或直接施用tslp同种型通过促进皮质分泌远距地改善湿疹/特应性皮炎、干性皮肤相关性皮炎、干性皮肤(皮肤干燥症)、皱纹(皮肤老化)和鱼鳞病(所有形式)。在某些实施方式中，如本文所述的至少一种维生素d3类似物或直接施用tslp同种型远距地治疗、改善和/或预防秃发症(诸如但不限于，雄激素性秃发症)。这类治疗(维生素d3类似物和/或直接施用tslp同种型)将治疗或预防复发性皮肤感染。在某些实施方式中，这种治疗促进皮脂中含有的抗微生物肽。在某些实施方式中，这种治疗通过创造更健康的头皮环境来促进毛发生长或防止或最小化脱发。
[0161]
出乎意料的是，当将至少一种维生素d3类似物施用于健康的皮肤区域时，本文所述的方法可以治疗皮肤紊乱。也就是说，维生素d3类似物不是施用于皮肤病变或皮肤上紊乱的其他表现，而是施用于受试者皮肤上健康的部位。在一个实施方式中，维生素d3类似物为卡泊三醇。维生素d3类似物可以以外用组合物施用，例如霜剂、凝胶剂、洗剂或贴剂。在一些实施方式中，维生素d3类似物是外用组合物中唯一的活性剂。维生素d3类似物可以相对于外用组合物中非活性组分的量以约0.0001至约10％(w/w)的量存在。在各种实施方式中，维生素d3类似物可以约0.0001至约10％、约0.001至约10％、约0.01至约10％、约0.1至约10％、约0.0001至约5％、约0.0001至约2％、约0.0001至约1％、约0.001至约1％、或约0.01至约1％(w/w)的量存在。外用组合物可包括药学或化妆品学可接受的赋形剂，诸如但不限于香料、着色剂、乳化剂、皮肤渗透增强剂、粘度调节剂等。
[0162]
眼部紊乱
[0163]
在各种实施方式中，提供了治疗眼部紊乱的方法。方法包括向遭受眼部紊乱的受试者外用施用本文所述的至少一种维生素d3类似物，或通过直接施用tslp同种型。在外用施用的情况中，维生素d3类似物可以从眼部远侧施用，使得不进行维生素d3类似物和眼部之间的直接接触。可以用这些方法治疗的眼部紊乱的类型没有特别限制，并且是受益于睑脂分泌增加和/或眼部屏障功能增强的任何紊乱。在一个实施方式中，眼部紊乱包括干眼综合征、干燥性角膜结膜炎、干燥性角膜炎、功能失调性泪液综合征、年龄相关干眼综合征、药物相关干眼综合征、更年期干眼综合征、隐形眼镜相关的干眼症、环境引起的干眼症、功能障碍性眼睑引起的干眼症、自身免疫相关性干眼症(干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑
狼疮)和感染相关的结膜炎。
[0164]
鉴于增加眼部保湿的睑板腺功能以与皮脂腺相似的方式调节，干眼症状也可能通过外用mc903治疗以远距方式得到改善。事实上，在开始治疗前报告干眼症状的两个个体主观上干眼症状有所改善(图28)。
[0165]
通过降低tslp水平治疗、改善和/或预防皮肤紊乱的方法
[0166]
在各种实施方式中，一种治疗、改善和/或预防皮肤紊乱的方法包括向受试者施用tslp抑制剂。不受理论的束缚，tslp抑制剂可以抑制皮肤的皮脂分泌。皮脂是由毛囊分泌的油性物质。皮脂对于保持我们的皮肤水分和提供抵御病原体的屏障功能很重要。然而，皮脂分泌增加会导致不良疾病，诸如寻常痤疮、化脓性汗腺炎和脂溢性皮炎。由此，鉴定了控制皮脂产生的新因子。
[0167]
tslp在控制皮脂产生中的作用的第一个迹象来自如下研究，该研究表明在小鼠肝脏中通过表达tslp的腺伴随病毒8(aav8-tslp)强制表达tslp导致选择性脂肪组织损失。尽管在用aav8-tslp处理的正常食物喂食的小鼠中仅观察到轻微的重量减轻(图8a)，但是与aav8-对照相比，在注射aav8-tslp后第7天和第14天之间观察到以剂量依赖性方式的附睾白色脂肪组织(ewat)和腹股沟白色脂肪组织(iwat)几乎完全损失(图8b-8c)。这种效应对白色脂肪组织是特异性的，因为与aav8-对照注射的小鼠相比，在aav8-tslp中没有观察到棕色脂肪组织(bat)或肌肉重量的差异(图8d-8e)。aav8-tslp引起的白色脂肪组织损失以剂量依赖性方式出现(图20)。
[0168]
总之，这些数据表明tslp积极控制皮脂释放。因此，阻断tslp(如，通过中和抗体)可以减少皮脂释放，并有益于治疗由皮脂释放增加引起的紊乱。可以通过tslp抑制剂治疗的皮肤紊乱包括寻常痤疮、脂溢性皮炎和化脓性汗腺炎。tslp抑制剂的非限制性实例包括抗体、小分子、sirna、shrna和mirna。在人类中，tslp以两种形式存在，短形式(sftslp)和长形式(lftslp)。在一个实施方式中，tslp抑制剂可以结合并抑制sftslp、lftslp或两者。
[0169]
抗体抑制剂
[0170]
本公开还提供了包含对sftslp或lftslp特异性的抗体或抗体片段的sftslp或lftslp抑制剂。即，抗体可以抑制sftslp或lftslp以提供有益效果，诸如减少皮脂分泌。合适的抗体包括例如tezepelumab(也称为medi9929和amg 157；cas号1572943-04-4)。
[0171]
抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体、以及免疫活性片段(如，fab或(fab)2片段)、抗体重链、抗体轻链、人源化抗体、基因工程单链fv分子(ladner et al,u.s.pat.no.4,946,778)，或嵌合抗体，例如，含有鼠抗体的结合特异性但其中其余部分是人起源的抗体。可以使用本领域技术人员已知的方法制备包括单克隆和多克隆抗体在内的抗体、片段和嵌合体。
[0172]
可以使用含有目标免疫抗原的完整多肽或片段来制备抗体。用于免疫动物的多肽或寡肽可以从rna的翻译中获得或化学合成，如果需要，可以与载体蛋白缀合。可与肽化学偶联的合适载体包括牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白、钥孔血蓝蛋白。然后可以使用偶联的多肽来免疫动物(如，小鼠、大鼠或兔)。
[0173]
作为非限制性实例，在本发明中有用的抗体可以结合至循环sftslp或lftslp。如本领域技术人员将理解的，可识别并特异性结合至循环sftslp或lftslp的任何抗体可用于本发明。本发明不应被解释为限于任何一种类型的抗体——无论是已知的或迄今为止未知
的，只要该抗体可以特异性结合至循环sftslp或lftslp，并预防或最小化sftslp或lftslp的生物活性。
[0174]
制备和使用此类抗体的方法是本领域公知的。例如，多克隆抗体的产生可以通过用抗原接种所需动物并从中分离与抗原特异性结合的抗体来完成。针对蛋白质或肽的全长或肽片段的单克隆抗体可以使用任何众所周知的单克隆抗体制备程序来制备，例如在harlow et al.(1989,antibodies,a laboratory manual,cold spring harbor,new york)和在tuszynski et al.(1988,blood 72:109-115)中所描述的那些。也可以使用化学合成技术合成一定量的所需肽。可选地，可以在适合产生大量肽的细胞中从合适的启动子序列克隆和表达编码所需肽的dna。使用本文引用的标准程序从用肽免疫的小鼠产生针对肽的单克隆抗体。然而，本发明不应被解释为仅限于包括这些抗体的方法和组合物，而应被解释为包括其他抗体，如该术语在本文其他地方所定义的。
[0175]
在某些情况下，期望从各种哺乳动物宿主，诸如啮齿动物(如，小鼠)、灵长类动物(如，人)等制备单克隆抗体。制备此类单克隆抗体的技术的描述是众所周知的，并且描述于例如harlow et al.,antibodies：a l
aboratory m
anual
,c
old s
pring h
arbor laboratory,cold spring harbor,n.y.(1988)；harlow et al.,using antibodies：a l
aboratory m
anual
,(cold spring harbor press,new york,1998)；breitling et al.,r
ecombinant a
ntibodies
(wiley-spektrum,1999)；和kohler et al.,1997nature 256：495-497；以及美国专利号5,693,762；5,693,761；5,585,089；和6,180,370中。
[0176]
可以使用本领域可用的技术克隆和测序使用本文所述的程序获得的编码抗体的核酸，并且这些技术描述于例如wright et al.(critical rev.immunol.1992,12:125-168)和其中引用的参考文献中。此外，本发明中有用的抗体可以使用wright et al.(同上)以及其中引用的参考文献，和gu et al.(thrombosis and hematocyst 1997,77:755-759)中描述的技术进行“人源化”。
[0177]
可选地，可以使用噬菌体展示技术产生抗体。为了产生噬菌体抗体文库，首先从分离自细胞(如杂交瘤)的mrna获得cdna文库，该细胞表达待在噬菌体表面表达的期望蛋白质，如期望的抗体。使用逆转录酶产生mrna的cdna拷贝。通过pcr获得指定免疫球蛋白片段的cdna，并将所得dna克隆到合适的噬菌体载体中以产生包含指定免疫球蛋白基因的dna的噬菌体dna文库。制备包含异源dna的噬菌体文库的程序是本领域众所周知的，并且描述于例如sambrook et al.(1989,molecular cloning：a laboratory manual,cold spring harbor,new york)中。
[0178]
可以对编码期望抗体的噬菌体进行工程化改造，使得蛋白质以这样的方式展示在其表面上，使得其可用于结合其对应的结合蛋白，如抗体所针对的抗原。因此，当表达特异性抗体的噬菌体在表达对应抗原的细胞存在下温育时，噬菌体将与细胞结合。不表达抗体的噬菌体不会与细胞结合。此类淘选技术在本领域中是众所周知的并且例如在wright et al.(critical rev.immunol.1992,12:125-168)中进行了描述。
[0179]
已经开发了诸如本文所述的那些使用m13噬菌体展示产生人抗体的方法(burton et al.,1994,adv.immunol.57:191-280)。本质上，cdna文库是从抗体生产细胞群体中获得的mrna产生的。mrna编码重排的免疫球蛋白基因，因此cdna编码相同的基因。扩增的cdna被克隆到m13表达载体中，创建噬菌体文库，在其表面表达人fab片段。展示目标抗体的噬菌体
通过抗原结合进行选择，并在细菌中繁殖以生产可溶性人fab免疫球蛋白。因此，与传统的单克隆抗体合成相反，这种程序使编码人免疫球蛋白的dna永生化，而不是使表达人免疫球蛋白的细胞永生化。
[0180]
刚刚介绍的程序描述了编码抗体分子的fab部分的噬菌体的产生。然而，本发明不应被解释为仅限于产生编码fab抗体的噬菌体。相反，本发明还包括编码单链抗体的噬菌体(scfv/噬菌体抗体文库)。fab分子包含整个ig轻链，即它们包含轻链的可变区和恒定区二者，但仅包含重链的可变区和第一恒定区结构域(ch1)。单链抗体分子包括包含ig fv片段的蛋白质的单链。ig fv片段仅包括抗体重链和轻链的可变区，不具有其中含有的恒定区。包含scfv dna的噬菌体文库可以按照marks et al.(1991,j mol biol 222:581-597)中描述的程序产生。以类似于对包含fab dna的噬菌体文库所描述的方式进行如此产生的用于分离期望抗体的噬菌体的淘选。
[0181]
本发明还应被解释为包括合成噬菌体展示文库，其中可以合成重链和轻链可变区，使得它们包括几乎所有可能的特异性(barbas,1995,nature medicine 1:837-839；de kruif et al.,1995,j mol biol 248:97-105)。
[0182]
本发明包括多克隆、单克隆、合成抗体等。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员会理解，本发明中有用的抗体的重要特征是该抗体与循环蛋白特异性结合。
[0183]
小分子抑制剂
[0184]
在某些实施方式中，tslp抑制剂包含小分子。当抑制剂是小分子时，可以使用技术人员已知的标准方法获得小分子。此类方法包括化学有机合成或生物手段。生物手段包括使用本领域熟知的方法从生物来源纯化、重组合成和体外翻译系统。在某些实施方式中，本发明的小分子抑制剂包括有机分子、无机分子、生物分子、合成分子等。
[0185]
潜在可用于治疗多种疾病和病症的分子多样性化合物的组合文库是本领域众所周知的，制备该文库的方法也是本领域众所周知的。该方法可以使用技术人员熟知的多种技术，包括固相合成、溶液方法、单一化合物的平行合成、化学混合物的合成、刚性核心结构、柔性线性序列、解卷积策略、标记技术和生成用于先导发现的无偏分子景观与用于先导开发的有偏结构。
[0186]
在小型文库合成的一般方法中，激活的核心分子与许多构建块缩合，产生共价链接的核心构建块集合的组合文库。核心的形状和刚度决定了构建块在形状空间中的取向。这些库可以通过改变核心、链接或构建块而偏向以靶向表征的生物结构(“聚焦库(focused libraries)”)或者使用柔性核心以较少的结构偏向进行合成。
[0187]
核酸分子抑制剂
[0188]
在某些实施方式中，tslp抑制剂包含分离的核酸。在其他实施方式中，抑制剂是sirna或反义分子，其抑制sftslp或lftslp。在又其他实施方式中，核酸包含启动子/调节序列，使得核酸优选能够指导核酸的表达。因此，本发明提供了用于将外源dna引入细胞并伴随外源dna在细胞中表达的表达载体和方法，例如在sambrook et al.(2012,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)，和ausubel et al.(1997,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,new york)中所描述的那些以及如本文其他地方所描述的那些。
[0189]
在某些实施方式中，可以通过灭活和/或隔离sftslp或lftslp来抑制sftslp或
lftslp。因此，可以通过使用转显性阴性突变体来完成抑制sftslp或lftslp的活性。
[0190]
在某些实施方式中，sirna用于降低sftslp或lftslp蛋白的水平。rna干扰(rnai)是将双链rna(dsrna)引入多种生物体和细胞类型导致互补mrna降解的现象。在细胞中，长dsrna通过称为切酶的核糖核酸酶被切割成短的21-25个核苷酸的小干扰rna或sirna。随后，sirna与蛋白质成分组装成rna诱导的沉默复合物(risc)，并在此过程中展开。然后激活的risc通过sirna反义链和mrna之间的碱基配对相互作用与互补转录物结合。结合的mrna被切割，mrna的序列特异性降解导致基因沉默。参见，例如，美国专利号6,506,559；fire et al.,1998,nature 391(19):306-311；timmons et al.,1998,nature 395:854；montgomery et al.,1998,tig 14(7):255-258；engelke,ed.,rna interference(rnai)nuts&bolts of rnai technology,dna press,eagleville,pa(2003)；和hannon,ed.,rnai a guide to gene silencing,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny(2003)。soutschek et al.(2004,nature 432:173-178)描述了sirna的化学修饰，其有助于静脉内全身递送。优化sirna涉及总g/c含量、末端的c/t含量、tm和3’突出端的核苷酸含量的考虑。参见，比如schwartz et al.,2003,cell,115:199-208和khvorova et al.,2003,cell 115:209-216。因此，本发明还包括使用rnai技术降低sftslp或lftslp水平的方法。
[0191]
在某些实施方式中，本发明提供包含sirna或反义多核苷酸的载体。在其他实施方式中，sirna或反义多核苷酸抑制sftslp、lftslp或两者的表达。将期望多核苷酸并入载体和载体的选择是本领域公知的。
[0192]
在某些实施方式中，本文所述的表达载体编码短发夹rna(shrna)抑制剂。shrna抑制剂是本领域众所周知的并且针对靶标的mrna，从而降低靶标的表达。在某些实施方式中，编码的shrna由细胞表达，然后加工成sirna。例如，在某些情况下，细胞具有切割shrna以形成sirna的天然酶(例如，切酶)。
[0193]
可以将sirna、shrna或反义多核苷酸克隆到如本文其他地方所述的多种类型的载体中。对于sirna或反义多核苷酸的表达，每个启动子中至少有一种模块用于定位rna合成的起始位点。
[0194]
为了评估sirna、shrna或反义多核苷酸的表达，待引入细胞的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从试图使用病毒载体进行转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在某些实施方式中，可选择标记可以携带在单块dna上并用于共转染程序中。可选择标记和报告基因两者都可以侧接有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记是本领域已知的并且包括例如抗生素抗性基因，诸如新霉素抗性等。
[0195]
因此，在另一方面，本发明涉及包含本发明的核苷酸序列或本发明的构建体的载体。载体的选择将取决于随后其将被引入的宿主细胞。在某些实施方式中，本发明的载体为表达载体。合适的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。在某些实施方式中，表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体。基于原核生物和/或真核生物载体的系统可以与本发明一起使用以产生多核苷酸或其关联多肽。许多这样的系统在商业上广泛可用。
[0196]
进一步，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且在例如病毒学和分子生物学手册中有所描述。可用作载体的病毒包括但不
限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记(参见，如wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0197]
举例来说，其中引入核酸序列的载体可以是在将其引入宿主细胞时整合或不整合到宿主细胞基因组中的质粒。其中可以插入本发明的核苷酸序列或本发明的基因构建体的载体的说明性、非限制性实例包括用于在真核细胞中表达的tet-on诱导型载体。
[0198]
该载体可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得(sambrook et al.,2012)。在某些实施方式中，该载体是可用于转化动物细胞的载体。
[0199]
在某些实施方式中，重组表达载体还可含有编码本文其他地方描述的本发明的肽或肽模拟物抑制剂的核酸分子。
[0200]
启动子可以是与基因或多核苷酸序列天然相关的启动子，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这种启动子可以称为“内源的”。类似地，增强子可以是与多核苷酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。可选地，通过将编码多核苷酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与多核苷酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与多核苷酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括pcr
tm
结合本文公开的组合物产生序列(美国专利号4,683,202，美国专利号5,928,906)。此外，考虑也可以使用在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内指导序列转录和/或表达的控制序列。
[0201]
重要的是使用有效指导dna片段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道如何使用启动子、增强子和细胞类型组合进行蛋白质表达。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下指导引入的dna区段的高水平表达有用的，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
[0202]
重组表达载体还可以含有选择性标记基因，其促进转化或转染宿主细胞的选择。合适的选择标记基因是编码蛋白质如g418和潮霉素的基因，其赋予对某些药物、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或免疫球蛋白或其部分(如免疫球蛋白优选igg的fc部分)的抗性。可选择标记可以被引入到与目标核酸分开的载体上。
[0203]
产生sirna多核苷酸后，技术人员将理解sirna多核苷酸具有某些特征，可以对其进行修饰以改进sirna作为治疗化合物。因此，sirna多核苷酸可以进一步设计为通过修饰它以包括硫代磷酸酯或其他键、甲基膦酸酯、砜、硫酸盐、酮基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等来抵抗降解(参见，如，agrwal et al.,1987,tetrahedron lett.28:3539-3542；stec et al.,1985tetrahedron lett.26:2191-2194；moody et al.,1989nucleic acids res.12:4769-4782；eckstein,1989trends biol.sci.14:97-100；stein,in：oligodeoxynucleotides.antisense inhibitors of gene expression,cohen,ed.,macmillan press,london,pp.97-117(1989))。
[0204]
可以进一步修饰任何多核苷酸以增加其体内稳定性。可能的修饰包括但不限于在5’和/或3’末端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2’o-甲基而不是磷酸二酯键；和/或包含非传统碱基，诸如肌苷、奎苷(queosine)和怀丁苷等，以及乙酰-甲基-、硫代-和腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的其他修饰形式。
[0205]
在某些实施方式中，由质粒载体表达的反义核酸序列用于抑制sftslp或lftslp蛋白表达。反义表达载体用于转染哺乳动物细胞或哺乳动物本身，从而导致sftslp或lftslp的内源表达降低。
[0206]
反义分子及其抑制基因表达的用途是本领域众所周知的(参见，如cohen,1989,in：oligodeoxyribonucleotides,antisense inhibitors of gene expression,crc press)。反义核酸是与特定mrna分子的至少一部分互补的dna或rna分子，如该术语在本文其他地方定义的(weintraub,1990,scientific american 262:40)。在细胞中，反义核酸与相应的mrna杂交，形成双链分子，从而抑制基因的翻译。
[0207]
使用反义方法抑制基因翻译是本领域已知的，并且描述于例如marcus-sakura(1988,anal.biochem.172:289)中。如inoue，1993，美国专利号5,190,931所教导的，可以使用编码反义分子的dna通过遗传表达向细胞提供此类反义分子。
[0208]
可选地，本发明的反义分子可以合成制备，然后提供给细胞。优选约10至约30个，和更优选约15个核苷酸的反义寡聚体，因为它们易于合成并引入靶细胞。本发明考虑的合成反义分子包括本领域已知的寡核苷酸衍生物，其与未修饰的寡核苷酸相比具有提高的生物活性(参见，美国专利号5,023,243)。
[0209]
在某些实施方式中，核酶用于抑制sftslp或lftslp蛋白表达。用于抑制靶分子表达的核酶可以通过将靶序列并入基本核酶结构中进行设计，其与例如编码sftslp或lftslp的mrna序列互补。靶向sftslp或lftslp的核酶可以使用市售试剂(applied biosystems,inc.,foster city,ca)合成，或者它们也可以由编码它们的dna基因表达。
[0210]
在各种实施方式中，治疗皮肤紊乱的方法包括向受试者施用tslp刺激剂。
[0211]
组合疗法
[0212]
在本文所述的方法中有用的化合物可以与可用于治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的一种或多种另外治疗剂组合使用。这些另外的治疗剂可以包括本领域技术人员可商购或合成可得的化合物。这些另外的治疗剂已知用来治疗、预防或减轻肥胖或肥胖相关的紊乱的症状。
[0213]
在各种实施方式中，当如本文所述的化合物与一种或多种另外的治疗剂或化合物一起施用时，观察到协同作用。例如，可以使用合适的方法计算协同效应，例如sigmoid-e
max
方程(holford&scheiner,1981,clin.pharmacokinet.6:429-453)、loewe可加性方程(loewe&muischnek,1926,arch.exp.pathol pharmacol.114:313-326)和中值效应方程(chou&talalay,1984,adv.enzyme regul.22:27-55)。上面提到的每个方程都可以应用于实验数据以生成相应的图表，以帮助评估药物组合的效果。与上述方程相关的相应图表分别是浓度效果曲线、等效线图曲线和组合指数曲线。
[0214]
施用/剂量/制剂
[0215]
施用方案可能影响有效量的构成。治疗性制剂可以在肥胖或肥胖相关的紊乱的开始之前或之后施用于受试者。此外，可以每天或依次施用数个分开的剂量以及交错的剂量，
或者可以连续输注该剂量，或者可以是弹丸注射。进一步，治疗性制剂的剂量可以根据治疗或预防情况的急切需要所指示的按比例增加或减少。
[0216]
可以使用已知的程序，以有效治疗患者的肥胖或肥胖相关的紊乱的剂量和时间段将本文所述的组合物施用于患者，优选哺乳动物，更优选人类。达到治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据以下因素而改变：诸如患者的疾病或紊乱的状态；患者的年龄、性别和体重；以及治疗患者中肥胖或肥胖相关的紊乱的治疗性化合物的能力。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每天施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的急切需要所指示的按比例减少剂量。本文所述的治疗性化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约1至5,000mg/kg体重/每天。本领域普通技术人员能够研究相关因素并关于治疗化合物的有效量做出决定，而无需过度实验。
[0217]
可以改变本文所述药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式的期望治疗反应且对患者无毒性的活性成分的量。
[0218]
具体而言，所选剂量水平取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、施用时间、化合物的排泄速率、治疗持续时间、其他药物、化合物或与化合物组合使用的物质、被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
[0219]
具有本领域普通技术的医生，例如内科医生或兽医，可以容易地确定和处方所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现期望治疗效果所需的水平开始在药物组合物中使用的本文所述化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至实现期望效果。
[0220]
在特定的实施方式中，将化合物配制成剂量单位形式以易于施用和剂量均匀是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗患者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含预定量的治疗性化合物，其经计算以产生与所需药物载体相关的期望治疗效果。本文所述的一种或多种化合物的剂量单位形式由下述规定并直接取决于下述：(a)治疗化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)混合/配制这样的治疗化合物的领域中固有的局限性。
[0221]
在某些实施方式中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体配制本文所述的组合物。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物包含治疗有效量的本文所述的化合物和药学上可接受的载体。
[0222]
载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层、在分散的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇诸如甘露糖醇和山梨糖醇。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶来实现。
[0223]
在某些实施方式中，本文所述的组合物以每天一到五次或更多的剂量范围施用于患者。在其他实施方式中，本文所述的组合物以包括但不限于每天、每两天、几天、每三天一次至每周一次和每两周一次的剂量范围施用于患者。对于本领域技术人员来说显而易见的是，本文所述的各种组合组合物的施用频率因个体而改变，这取决于许多因素，包括但不限
于年龄、待治疗的疾病或紊乱、性别、总体健康等因素。因此，不应将本文所述的化合物和组合物的施用解释为限于任何特定的剂量方案，并且待施用给任何患者的精确剂量和组合物由主治医师考虑与患者有关的所有其他因素确定。
[0224]
本文所述的一种或多种化合物可以以如下范围进行施用：约1μg至约10,000mg、约20μg至约9,500mg、约40μg至约9,000mg、约75μg至约8,500mg、约150μg至约7,500mg、约200μg至约7,000mg、约350μg至约6,000mg、约500μg至约5,000mg、约750μg至约4,000mg、约1mg至约3,000mg、约10mg至约2,500mg、约20mg至约2,000mg、约25mg至约1,500mg、约30mg至约1,000mg、约40mg至约900mg、约50mg至约800mg、约60mg至约750mg、约70mg至约600mg、约80mg至约500mg，以及它们之间的任何和所有整体或部分增量。
[0225]
在一些实施方式中，本文所述的化合物的剂量为从约1mg和约2,500mg。在一些实施方式中，在本文所述的组合物中使用的本文所述的化合物的剂量小于约10,000mg、或小于约8,000mg、或小于约6,000mg、或小于约5,000mg、或小于约3,000mg、或小于约2,000mg、或小于约1,000mg、或小于约500mg、或小于约200mg、或小于约50mg。类似地，在一些实施方式中，本文所述的第二化合物的剂量小于约1,000mg、或小于约800mg、或小于约600mg、或小于约500mg、或小于约400mg、或小于约300mg、或小于约200mg、或小于约100mg、或小于约50mg、或小于约40mg、或小于约30mg、或小于约25mg、或小于约20mg、或小于约15mg、或小于约10mg、或小于约5mg、或小于约2mg、或小于约1mg、或小于约0.5mg，以及其任何和所有全部或部分增量.
[0226]
在某些实施方式中，本文所述的组合物是包装的药物组合物，其包含容器，该容器容纳单独或与第二药剂组合的治疗有效量的本文所述化合物；以及使用该化合物治疗、预防或减少患者的疾病或紊乱的一种或多种症状的说明书。
[0227]
制剂可以与常规赋形剂混合使用，即适用于口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮下、肠内或本领域已知的任何其他合适施用模式的药学上可接受的有机或无机载体物质。药物制品可以被灭菌并且如果需要可以与辅助剂混合，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。如果需要，它们也可以与其他活性剂，例如其他镇痛剂组合。
[0228]
本文所述的任何组合物的施用途径包括口服、鼻腔、直肠、阴道内、肠胃外、口腔、舌下或外用。用于本文所述组合物中的化合物可以配制为通过任何合适的途径施用，诸如口服或肠胃外，例如经皮、经粘膜(如，舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(如，经阴道和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和外用施用。
[0229]
在某些实施方式中，使用例如贴剂、粘合剂膜、自粘膜、洗剂、糊剂等将本文所述的组合物涂抹于受试者的皮肤。在一些实施方式中，本文所述的组合物通过注射施用，诸如通过皮下、肌肉内或静脉内注射。
[0230]
合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊剂、囊片、丸剂、软胶囊、锭剂、分散剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、珠剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、丸剂、胶浆剂、锭剂、乳膏剂、糊剂、硬膏剂、洗剂、盘剂、栓剂、用于鼻腔或口腔施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉剂或雾化制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。应当理解，本文所述的制剂和组合物不限于本文所述的特定制剂和组合物。
[0231]
口服施用
[0232]
对于口服应用，特别合适的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂或胶囊、囊片和软胶囊。用于口服使用的组合物可根据本领域已知的任何方法制备，并且此类组合物可包含选自适合制备片剂的惰性、无毒药物赋形剂的一种或多种试剂。这样的赋形剂包括例如惰性稀释剂如乳糖；造粒和崩解剂诸如玉米淀粉；粘合剂诸如淀粉；和润滑剂诸如硬脂酸镁。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知的技术包衣以便雅致(elegance)或延迟活性成分的释放。口服应用制剂也可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性稀释剂混合。
[0233]
对于口服给药，本文所述的一种或多种化合物可以是通过常规方法与药学上可接受的赋形剂诸如粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如玉米淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)一起制备的片剂或胶囊剂的形式。如果需要，可以使用合适的方法和包衣材料对片剂进行包衣，包衣材料诸如可从colorcon,west point,pa.获得的opadry
tm
薄膜包衣系统(如，opadry
tm
oy型、oyc型、有机肠溶性oy-p型、水性肠溶性oy-a型、oy-pm型和opadry
tm
white，32k18400)。用于口服施用的液体制品可以是溶液、糖浆或悬浮液的形式。液体制品可以通过常规方法与药学上可接受的添加剂诸如悬浮剂(如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油性酯或乙醇)；和防腐剂(如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)一起制备。
[0234]
肠胃外施用
[0235]
对于肠胃外施用，本文所述的化合物可以配制用于注射或输注，例如静脉内、肌肉内或皮下注射或输注，或以弹丸剂量和/或连续输注施用。可以使用在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，任选地含有其他配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0236]
本文所述组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射制品也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备注射剂，天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式，也可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液也可能含有长链醇稀释剂或分散剂，例如ph.helv或类似的醇。
[0237]
另外的施用形式
[0238]
适用于本文所述的一种或多种化合物和组合物的另外剂型包括美国专利号6,340,475；6,488,962；6,451,808；5,972,389；5,582,837；和5,007,790中所描述的剂型。适用于本文所述的一种或多种化合物和组合物的另外剂型还包括在美国专利申请号20030147952；20030104062；20030104053；20030044466；20030039688；和20020051820中所描述的剂型。适用于本文所述的一种或多种化合物和组合物的另外剂型还包括在pct申请号wo 03/35041；wo 03/35040；wo 03/35029；wo 03/35177；wo 03/35039；wo 02/96404；wo 02/32416；wo 01/97783；wo 01/56544；wo 01/32217；wo 98/55107；wo 98/11879；wo 97/47285；wo 93/18755；和wo 90/11757中描述的剂型。
[0239]
控释制剂和药物递送系统
[0240]
在某些实施方式中，本文所述的制剂可以是但不限于短期、快速抵消以及受控的，例如持续释放、延迟释放和脉冲释放制剂。
[0241]
术语“持续释放”以其常规意义使用，是指一种药物制剂，它可以在延长的时间段内逐渐释放药物，并且可能(尽管不一定)导致药物在延长的时间段内基本恒定的血液水平。该时间段可以长达一个月或更长时间并且应该是比以弹丸形式施用的相同量的药剂更长的释放。
[0242]
对于持续释放，化合物可以与合适的聚合物或疏水材料一起配制，其为化合物提供持续释放特性。因此，用于本文所述方法的一种或多种化合物可以以微粒的形式施用，例如通过注射或以片或盘剂的形式通过植入施用。
[0243]
在一些情况下，所使用的剂型可以作为其中一种或多种活性成分的缓释或控释提供，例如使用羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体或微球或其组合，以提供不同比例的期望释放曲线。可以容易地选择本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂，包括本文所述的那些，与本文所述的药物组合物一起使用。因此，本文所述的组合物和剂型包括适用于口服施用的单一单位剂型，诸如片剂、胶囊剂、软胶囊和囊片，其适合控释。
[0244]
大多数控释药物产品的共同目标是改善药物疗法，超过其非受控对应物所达到的目标。理想情况下，在医学治疗中使用优化设计的控释制品的特征在于使用最少的药物物质在最少量的时间内治愈或控制病症。控释制剂的优点包括延长的药物活性、降低的给药频率和增加的患者依从性。此外，控释制剂可用于影响起效时间或其他特性，例如药物的血药浓度，从而可影响副作用的发生。
[0245]
大多数控释制剂被设计以起始释放一定量的药物，迅速产生期望的治疗效果，然后逐渐并连续释放其他量的药物，以在延长的时间段内保持这种治疗效果水平。为了在体内维持这种恒定的药物水平，药物必须以一定的速率从剂型中释放出来，其将取代被代谢和从体内排出的药物量。
[0246]
活性成分的控释可由各种诱导因子刺激，例如ph、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。术语“控释组分”在本文中被定义为一种或多种化合物，其包括但不限于聚合物、聚合物基质、凝胶、渗透膜、脂质体或微球体或其组合，其促进活性成分的控释。在一个实施方式中，使用持续释放制剂将本文所述的一种或多种化合物单独或与另一种药剂组合施用于患者。在一个实施方式中，使用持续释放制剂将本文所述的一种或多种化合物单独或与另一种药剂组合施用于患者。
[0247]
术语延迟释放在本文中以其常规意义使用，是指药物制剂在药物施用后的一些延迟之后提供药物的初始释放，并且该术语(尽管不是必须的)包括从约10分钟至多至约12小时的延迟。
[0248]
术语脉冲式释放在本文中以其常规意义使用，是指以在药物施用后产生药物脉冲式血浆曲线的方式提供药物释放的药物制剂。
[0249]
术语即释以其常规意义使用，是指在药物施用后立即释放药物的药物制剂。
[0250]
如本文所用，短期是指药物施用后的任何时间段，至多和包括药物施用后的约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟
或约10分钟，和其任意和所有全部或部分增量。
[0251]
如本文所用，快速抵消是指药物施用后的任何时间段，至多和包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟，以及其任何和所有全部或部分增量。
[0252]
给药
[0253]
本文所述化合物的治疗有效量或剂量取决于患者的年龄、性别和体重、患者当前的医疗状况和正在治疗的患者的肥胖或肥胖相关的紊乱的进展。技术人员能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。
[0254]
本文所述化合物的合适剂量可在约0.01mg至约5,000mg/天，诸如约0.1mg至约1,000mg，例如约1mg至约500mg，诸如约5mg至约250mg/天。该剂量可以单剂量或多剂量施用，例如每天1至4次或更多次。当使用多个剂量时，每个剂量的量可以相同或不同。例如，每天1mg的剂量可以作为两个0.5mg的剂量施用，两次施用之间的间隔约为12小时。
[0255]
在各种实施方式中，维生素d3类似物的治疗量为每cm2的治疗皮肤约0.01nmol至约20nmol。维生素d3类似物的剂量可以是约0.05nmol/cm2至约10nmol/cm2、0.1nmol/cm2至约5nmol/cm2或0.1nmol/cm2至约2.5nmol/cm2，其中面积对应于治疗的皮肤的表面积。维生素d3类似物的剂量可以是约0.01nmol/cm2、0.05nmol/cm2、0.1nmol/cm2、0.2nmol/cm2、0.4nmol/cm2、0.6nmol/cm2、0.8nmol/cm2、1nmol/cm2、1.5nmol/cm2、2nmol/cm2、3nmol/cm2、4nmol/cm2、5nmol/cm2、6nmol/cm2、7nmol/cm2、8nmol/cm2、9nmol/cm2、10nmol/cm2、12nmol/cm2、14nmol/cm2、16nmol/cm2、18nmol/cm2或20nmol/cm2，其中面积对应于治疗的皮肤的表面积。
[0256]
维生素d3类似物可根据受试者的需要涂抹于任何具体的皮肤表面积。在各种实施方式中，维生素d3类似物可以涂抹于如下范围内的皮肤面积：5cm2至约2500cm2、约10cm2至约2000cm2、约20cm2至约1500cm2、约30cm2至约1000cm2、40cm2至约750cm2、50cm2至约700cm2、60cm2至约650cm2、约70cm2至约600cm2、80cm2至约550cm2、90cm2至约500cm2或100cm2至约450cm2。在各种实施方式中，维生素d3类似物可以涂抹于以下的皮肤面积：约5cm2、10cm2、15cm2、20cm2、25cm2、30cm2、35cm2、40cm2、45cm2、50cm2、55cm2、60cm2、65cm2、70cm2、75cm2、80cm2、85cm2、90cm2、95cm2、100cm2、110cm2、120cm2、130cm2、140cm2、150cm2、160cm2、170cm2、180cm2、190cm2、200cm2、225cm2、250cm2、275cm2、300cm2、350cm2、400cm2、450cm2、500cm2、550cm2、600cm2、650cm2、700cm2、750cm2、800cm2、850cm2、900cm2、950cm2、1000cm2、1250cm2、1500cm2、1750cm2、2000cm2、2250cm2或2500cm2。
[0257]
关于本文描述的d3类似物的任意药物组合物，涂抹于给定皮肤面积的维生素d3类似物的量可以是约0.005％至约10％w/w、约0.01％至约5％w/w、约0.05％至约5％w/w、约0.1％至约5％w/w或约0.5％至约5％w/w。因此，例如，维生素d3类似物的外用药物组合物可以包括0.005％至约10％w/w的维生素d3类似物，其余为药学上可接受的载体和/或赋形剂。在各种实施方式中，关于本文描述的d3类似物的任意药物组合物，涂抹于给定皮肤面积的维生素d3类似物的量可以是约0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
[0258]
施用于受试者并且有效实现本文所述的重量减轻的tslp多肽同种型或包含tslp
表达序列的病毒载体的量是约0.1mg/kg至约500mg/kg、约0.5mg/kg至约400mg/kg、约1mg/kg至约300mg/kg、约5mg/kg至约200mg/kg或约10mg/kg至约100mg/kg。在各种实施方式中，实现本文所述的重量减轻的tslp多肽同种型或包含tslp表达序列的病毒载体的有效量是至少、大于或小于约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、0.1mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg或约500mg/kg。在各种实施方式中，实现本文所述的重量减轻的tslp多肽同种型或包含tslp表达序列的病毒载体的量是导致受试者中循环tslp水平为约5至约40ng/ml的量。
[0259]
应当理解，在非限制性实例中，每天给药的化合物量可以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天施用。例如，用每隔一天施用，5mg/天的剂量可以在星期一开始，随后的第一个5mg/天剂量在星期三施用，第二个随后的5mg/天剂量在星期五施用，依此类推。
[0260]
在患者的状态确实改善的情况下，根据医生的判断，任选地连续给予本文所述的一种或多种化合物；可选地，所施用的药物的剂量暂时减少或暂时暂停一定时间长度(即，“药物假期”)。药物假期的长度可任选地在2天到1年之间变化，包括比如仅2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。药物假期期间的剂量减少包括10％-100％，包括比如仅10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
[0261]
在各种实施方式中，维生素d3类似物使用给药方案施用，该给药方案具有治疗周，随后是无治疗周。在无治疗周期间，不施用维生素d3类似物。在治疗周期间，可以每天(治疗7天)或每隔一天(治疗3或4天)施用维生素d3类似物。
[0262]
一旦患者的状况出现改善，必要时施用维持剂量。随后，将施用的剂量或频率或两者降低到使改善的疾病得以保持的水平。在某些实施方式中，患者在出现任何症状和/或感染复发时需要长期间歇性治疗。
[0263]
本文所述的化合物可以配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指适合作为接受治疗的患者的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有经计算以产生所需治疗效果的预定量的活性物质，任选地与合适的药物载体结合。单位剂型可为单日剂量或多日剂量之一(例如，每天约1至4次或更多次)。当使用多日剂量时，每剂的单位剂型可以相同或不同。
[0264]
此类治疗方案的毒性和治疗功效任选地在细胞培养物或实验动物中确定，包括但不限于确定ld
50
(对50％的群体致死的剂量)和ed
50
(对50％的群体治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用的剂量比为治疗指数，其表示为ld
50
与ed
50
之间的比值。从细胞培养试验和动物研究中获得的数据任选地用于制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括具有最小毒性的ed
50
的循环浓度范围内。剂量任选地在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所使用的施用途径。
[0265]
实施例
[0266]
通过参考以下实施例可以更好地理解本技术的各种实施方式，这些实施例以说明的方式提供。本技术的范围不限于本文给出的实施例。
[0267]
实施例1：mc903预防重量增加并改善hfd喂食的小鼠的代谢参数。
[0268]
用正常食物(nc)或40％高脂肪饮食(hfd)喂食野生型c57bl/6小鼠12周。在奇数周
的星期一、星期三和星期五用载体(etoh)或mc903(2nmol/耳朵)在双耳上都对小鼠进行外用处理。(a)每周对小鼠进行称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。(b)小鼠在第12周被安乐死，并称重附睾脂肪垫。(c、d)在第12周通过注射葡萄糖并随后测量血糖水平进行葡萄糖耐量试验(gtt)。在第12周禁食过夜后进行稳态模型评估-胰岛素耐性(homa-ir)分析。*、**和***表示通过学生t-检验或anova的分别p《0.05、p《0.01和p《0.001的统计显著性。
[0269]
实施例2.mc903预防hfd-诱导的肝脂肪变性。
[0270]
用正常食物(nc)或40％高脂肪饮食(hfd)喂食c57bl/6小鼠12周。在奇数周的星期一、星期三和星期五用载体(etoh)或mc903(2nmol/耳朵)在双耳上都对小鼠进行外用处理。显示了第12周肝脏的代表性组织学图像。
[0271]
实施例3.mc903不会预防hfd喂食tslp-r ko小鼠的重量增加或改善代谢参数。
[0272]
用正常食物(nc)或40％高脂肪饮食(hfd)喂食tslp-r敲除(ko)小鼠12周。在奇数周的星期一、星期三和星期五用载体(etoh)或mc903(2nmol/耳朵)在双耳上都对小鼠进行外用处理。在指示的时间点称重小鼠并绘制为平均值
±
sem。在第12周通过注射葡萄糖和随后测量血糖水平进行葡萄糖耐量试验(gtt)。对gtt曲线进行auc分析。*表示通过学生t-检验的p《0.05的统计显著性。
[0273]
实施例4.aav8-tslp诱导hfd喂食小鼠的重量减轻。
[0274]
用40％高脂肪饮食(hfd)喂食c57bl/6小鼠4周。在第0天给小鼠静脉注射aav8-对照(对照aav)或aav8-tslp(mtslp-aav)。每周对小鼠称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。**和***表示分别p《0.01和p《0.001的统计显著性。
[0275]
实施例5.aav8-tslp诱导先前肥胖的hfd喂食小鼠的重量减轻。
[0276]
用40％高脂肪饮食(hfd)喂食c57bl/6小鼠10周。然后在第10周给小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp。保持小鼠hfd并每周称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。*、**和***表示通过学生t-检验或anova的分别p《0.05、p《0.01和p《0.001的统计显著性。
[0277]
实施例6.aav8-tslp诱导皮下脂肪的损失。
[0278]
用40％高脂肪饮食(hfd)喂食c57bl/6小鼠10周。然后在第10周给小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp。保持小鼠hfd持续6周并进行安乐死用于组织学分析。显示的是小鼠皮肤的代表性组织学图像。
[0279]
实施例7.aav8-tslp诱导ob/ob小鼠的重量减轻。
[0280]
为ob/ob小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续6周。小鼠每周称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。*和***表示通过学生t-检验的分别p《0.05和p《0.001的统计显著性。
[0281]
实施例8.aav8-tslp在正常食物喂食的小鼠中诱导选择性脂肪组织损失。
[0282]
为c57bl/6小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续14天。(a)在指示的天数为小鼠称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。在指示的天数对小鼠实施安乐死，并测量(b)附睾白色脂肪组织(ewat)、(c)腹股沟白色脂肪组织(iwat)、(d)棕色脂肪组织(bat)和(e)股四头肌重量。**和***表示通过学生t-检验的分别p《0.01和p《0.001的统计显著性。
[0283]
实施例9.aav8-tslp不会改变肠道吸收的食物消耗。
[0284]
为c57bl/6小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物或hfd持续12周。(a)平均每周食物消耗绘制为平均值
±
sem。在aav8注射后第10天，小鼠口服固定量的(b)葡萄糖或(c)橄榄油。测量随后的葡萄糖水平和甘油三酯水平并随时间绘制。
[0285]
实施例10.与aav8-对照处理的小鼠相比，aav8-tslp处理的小鼠排泄较少的粪便能量。
[0286]
为c57bl/6小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食正常食物持续9天。在第9天和第11天之间收集粪便并测量单独笼养小鼠的食物消耗。对收集的粪便进行弹式量热法以测量粪便热量。(a)显示了aav8-对照或aav8-tslp处理的小鼠每天的粪便能量含量。(b)显示了每天的净能量摄入，通过食物热量摄入减去aav8-对照或aav8-tslp处理的小鼠的粪便热量所计算的。通过学生t-检验进行统计分析。
[0287]
实施例11.aav8-tslp在注射后第7-10天之间增加了食物消耗。
[0288]
为c57bl/6小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。在过去48小时内绘制每小时和累计食物消耗。
[0289]
实施例12.aav8-tslp在注射后第7-10天之间不会增加耗氧量。
[0290]
为c57bl/6小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。分别绘制了过去48小时和72小时内的每小时(左图)和每天/每半天(右图)耗氧量。
[0291]
实施例13.aav8-tslp在注射后第7-10天之间不会增加二氧化碳输出。
[0292]
为wt c57bl/6小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。分别绘制了过去48小时和72小时内的每小时(左图)和每天/每半天(右图)二氧化碳输出。
[0293]
实施例14.aav8-tslp在注射后第7-10天之间不会增加运动活动。
[0294]
为wt c57bl/6小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp，并在第7-10天放置在代谢室中。分别绘制了过去48小时和72小时内的每小时(左图)和每天/每半天(右图)运动活动。
[0295]
实施例15.aav8-tslp导致先前肥胖的hfd喂食小鼠出现油性皮毛。
[0296]
c57bl/6小鼠喂食40％高脂肪饮食(hfd)持续10周。然后在第10周给小鼠静脉注射aav8-tslp。保持小鼠hfd持续另外6周。显示了在aav8后第6周小鼠的代表性照片。
[0297]
实施例16.aav8-tslp诱导具有对tslp有反应的造血系统的hfd喂食小鼠的重量减轻。
[0298]
用1000cgy辐照c57bl6或tslp-r ko小鼠并静脉注射来自c57bl/6或tslp-r敲除(ko)小鼠的骨髓细胞。骨髓注射后4周，为小鼠静脉注射aav8-对照或aav8-tslp并喂食40％高脂肪饮食(hfd)持续3周。每周对小鼠称重，并将相对于基线的％变化绘制为平均值
±
sem。
[0299]
实施例17.aav8-tslp以t细胞依赖性方式诱导重量减轻。
[0300]
为(a)重组酶激活基因-1(rag1)ko小鼠和(b)t细胞受体(tcr)-βko小鼠注射aav8-对照或aav8-tslp。rag1 ko小鼠缺乏t和b细胞。tcr-βko小鼠仅缺乏t细胞。注射后第14天称重附睾白色脂肪组织(ewat)。数据绘制为平均值
±
sem。
[0301]
实施例18.tslp诱导的脂肪组织损失的非限制性模型。
[0302]
全身tslp的升高可以通过用mc903外用处理、注射重组tslp或使用病毒载体进行
ko或tslpr ko小鼠中。四周后，用aav注射过继转移的小鼠。
[0310]
hfd和mcdd模型.小鼠被喂食由45kcal％脂肪组成的hfd(研究饮食，d12451)或由60kcal％脂肪和0.1％甲硫氨酸组成的mcdd(没有添加胆碱)(研究饮食，a06071302)。对于hfd模型，小鼠在第0天或使用hfd 10周后注射aav，同时继续hfd持续另外的4周(hfd持续14周，第10周注射aav)。每周称重小鼠。对于mcdd模型，小鼠在饮食4周后注射aav，同时继续mcdd持续另外的4周(mcdd持续8周，第4周aav注射)。
[0311]
体内代谢分析.单独安置小鼠并在aav注射后第9-11天期间，由宾夕法尼亚大学的rodent metabolic phenotyping core使用oxymax综合实验动物监测系统(clams)进行监测。小鼠喂食nc并在24℃下保持标准的12:12明暗循环，随意获取食物和水。在aav注射后第9-11天从单独安置的小鼠中收集累积的粪便，并由密歇根大学mouse phenotyping core进行粪便的炸弹量热法。在aav注射后第0天和第14天，通过1h-nmr光谱测量脂肪质量和瘦体重。对于gtt，小鼠禁食过夜14-16小时，并以10μl/g体重的20％w/v葡萄糖溶液腹膜内注射。在葡萄糖攻击后0、15、30、60、90和120分钟从尾静脉收集的血液中测量血糖水平。0分钟时间点测量用于确定空腹血糖和胰岛素水平。使用手持式血糖仪(contour,7151g)进行血糖测量，并通过elisa(crystal chem,90080)测定血浆胰岛素水平。homa-ir指数值如前所述计算(matthews,et al.,1985,diabetologia 28:412-419)。ogtt以与gtt类似的方式进行，不同之处在于葡萄糖溶液通过口服管饲法施用。如前所述(wada,et al.,2013,gastroenterology 144:369-380)进行oftt，并通过infinity triglyceride试剂盒(thermofisher，tr22421)测量血液甘油三酯水平。血清alt检测由translational core laboratory of the children’s hospital of philadelphia(chop)research institute进行。对于尿分析，在aav注射后10天从小鼠收集尿液，并将100μl尿液置于尿液试纸(ketostix,2881；chemstrip 2gp,11895397)上进行比色分析。
[0312]
身体状况评分.对于bcs评分(cooke,et al.,1996,blood 88:3230-3239)，在aav注射后第0、3、7、10和14天对小鼠进行评分，在5个类别中以0-2的标度分级如下：1)体重减轻：如果》25％则2分，如果10-25％则1分，如果《10％则0分，2)弓背：如果严重弓背影响运动则2分，如果休息时弓背则1分，如果正常姿势则0分，3)可见嗜眠：如果静止不动——除非受到刺激，则2分，如果轻度到中度减少运动则1分，如果正常则0分，4)触摸嗜眠：如果受到刺激时静止则2分，如果刺激时轻度至中度减少运动则1份，如果正常则1分，5)褶皱毛皮：如果严重褶皱和梳理不良则2分，如果轻度至中度褶皱则1分，如果正常则0分。将每个类别的分数相加形成总分。
[0313]
肝脏tg.将20-100mg肝脏组织与10μl/mg肝脏的5％np-40(igepal ca630,sigma-aldrich,i8896)匀浆。所得匀浆物在80℃下煮沸10分钟，冷却至室温，再次在80℃下煮沸10分钟并离心。然后用dh2o以1:20稀释上清液。使用infinity triglyceride reagent对甘油三酯水平进行定量。
[0314]
皮毛脂质分离和tlc.从背部皮肤上剃下2.5厘米
×
5厘米面积的毛皮，并浸入4ml氯仿/甲醇(2:1v/v)随后4ml丙酮中。汇集脂质提取物，注射器过滤，在n2气流下干燥过夜，并重新悬浮在等体积的氯仿(sigma，288306)/甲醇(sigma，322415)(4:1，v/v)中，用于加载到tlc板(sigma，100390)上。使用以下物质将tlc板显色3次：1)己烷(sigma,296090):异丙基二醚(sigma,673803):乙酸(80:20:1)上至板高度的50％，2)己烷：苯(sigma,401765)(1:
1)上至板高度的80％，3)己烷上至板高度的90％。在每个显影溶液之间使板干燥。将10％硫酸铜(sigma,451657)/8％磷酸(sigma,p6560)溶液均匀喷洒在板上，然后在120℃下烘烤20分钟以可视化脂质种类。imagej(nih)用于量化带的强度和面积。tlc非极性脂质混合物a(matreya,1129)用作鉴定脂质类别的标准。
[0315]
流式细胞术分析.分离、切碎耳朵皮肤的真皮层，并在含有0.25mg/ml liberase tl(roche，5401020001)、0.1mg/ml dna酶i(roche，1010415900)和0.7mg/ml胶原酶d(roche,11088882001)的hank平衡盐溶液(thermofisher,24020117)中在37℃下培养2小时并伴随振荡。然后通过70μm过滤器将内容物过滤到含有10ml pbs的新管中、离心并重悬于pbs中。细胞在4℃下在pbs中用活/死染色剂和细胞表面染色剂染色15分钟。使用lsr ii或lsr fortessa(bd biosciences)进行流式细胞术。使用flowjo软件(treestar)分析数据。使用的染色抗体包括：cd4(biolegend,100406和100510)、cd8α(biolegend,100753)、cd90.2(biolegend,140322)、tcrb(biolegend,109241)、cd19(biolegend,115520),b220(biolegend,103222)、nk1.1(biolegend,108714)、cd3(biolegend,100218)、cd45.1(biolegend,110739)、cd45.2(ebioscience,56-0454-82)、cd11b(biolegend,101215)和cd11c(biolegend,117318)。活/死近红外染色(thermofisher,l10119)用于排除死细胞。
[0316]
组织学.在h&e或ihc染色之前，在4℃下将组织固定于10％福尔马林中过夜并包埋在石蜡中。肝脏切片由宾夕法尼亚大学cardiovascular institute’s histology and gene expression core处理和染色。如先前所述(jeong,et al.,2018,j clin invest 128:1010-1025)进行picrosiriusred染色。皮肤样本由宾夕法尼亚大学skin histology and characterization core处理和染色(cd3、cd4和cd8的h&e、ki67、oro、ihc)。对于皮肤样品的oro染色，在切片和染色之前将冷冻的皮肤样品包埋在冷冻切片培养基中。为了量化皮脂腺细胞大小、oro脂质含量和picrosiriusred纤维化，每只动物捕获8-10个放大倍数为20的切片。对于h&e皮肤切片，imagej用于在皮脂腺细胞周围绘制外接椭圆，以量化染色面积和强度。对于oro皮肤和picrosiriusred肝脏切片，imagej用于拆分rgb通道、阈值阳性染色并测量％面积和强度。积分密度计算为面积
×
强度。为了量化ki67皮脂腺细胞基底细胞染色，每只动物8-10个切片以40倍放大率成像，并对每个皮脂腺中的ki67

vs.ki67-基底细胞进行计数。
[0317]
人类基因表达分析.公开可用的人类皮肤基因表达数据得自www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc dot cgi？acc＝gse98774。皮脂产生相关基因(scd、fads2、pparg、fa2h、dgat1、dgat2、fabp4、fabp5、acaca、fasn、awat1、elovl1、elovl3、elovl4、elovl5、mogat1、mogat2、mogat3)的基因表达值针对每个样品的相应tslp表达值作图。对于标准化的sg基因表达，每个皮脂相关基因数据集的每个表达都被标准化为平均值为0和标准偏差为1，然后将来自每个样本的所有sg基因在一起平均并针对相应的tslp表达作图。使用prism(graphpad sofware,inc.)进行pearson's r和pearson线性回归分析。
[0318]
统计分析.数据报告为平均值
±
s.e.m.。所有测量均由不同的生物样品进行。对于正态分布的数据，统计显著性由学生t-检验(双侧)或双向anova和sidak事后检验以及多重比较校正确定。使用pearson线性回归进行相关性分析。使用prism 8进行统计分析。
[0319]
结果
[0320]
本文图示选择的结果
[0321]
tslp保护免于肥胖和肥胖相关的并发症
[0322]
通过注射表达tslp的腺伴随病毒血清型8(tslp-aav，靶向肝脏的表达)以诱导tslp在高脂肪饮食(hfd)喂食的小鼠中的全身表达，测试了tslp对肥胖的潜在影响。引人注目的是，与注射对照-aav的小鼠(其增加了重量)相比，注射tslp-aav的小鼠在4周内减轻重量(图29a、33a)。tslp-aav注射还导致正常食物(nc)喂食的摄食过量的ob/ob小鼠中的重量减轻(图33b-33c)。tslp不仅防止了而且还逆转了肥胖。tslp-aav注射的肥胖小鼠(小鼠首先喂食hfd 10周，然后在继续hfd的同时注射tslp-aav)展示出重量减轻、内脏脂肪量减少和代谢参数明显改善，其包括空腹血浆血糖和胰岛素水平、胰岛素耐性的稳态模型评估(homa-ir)、葡萄糖耐量、肝脂肪变性和肝甘油三酯(tg)水平(图29b-29d、33d-33j)。
[0323]
鉴于肝脂肪变性的减少，还在非酒精性脂肪肝疾病(nafld)和nash的小鼠模型中测试了tslp的作用。为此，小鼠被喂食甲硫氨酸-胆碱缺乏饮食(mcdd)4周，然后再注射对照-aav或tslp-aav另外4周。与对照相比，tslp-aav注射的mcdd喂食的小鼠具有较低的肝脏tg水平、较低的血清丙氨酸转氨酶水平(alt)和减少的肝纤维化(图29e、34a-33d)。
[0324]
在nc喂食的小鼠中还观察到tslp对脂肪损失的影响。tslp-aav注射后两周，nc喂食的小鼠展示出附睾白色脂肪组织(ewat，内脏脂肪)和腹股沟白色脂肪组织(iwat，皮下脂肪组织)质量的显著降低，而棕色脂肪组织(bat)或肌肉质量没有相应降低(图29f、34e-34h)。身体组成分析还表明，tslp-aav降低了全身脂肪质量百分比(图34i)。因此，tslp-aav注射的小鼠本身并不是恶病质，因为选择性减少了白色脂肪。此外，tslp-aav注射的小鼠并非临床生病的，因为tslp-aav注射小鼠的身体状况评分(bcs)保持正常，并且小鼠仅损失了其全身重量的5％，尽管损失了大量的白色脂肪(图34j-34k)。最后，tslp对白色脂肪损失的影响取决于通过tslpr受体(tslpr)的信号传导，因为tslpr ko小鼠在tslp-aav注射后并没有减少脂肪(图34l)。
[0325]
t细胞介导tslp-驱动脂肪损失
[0326]
为了确定哪种或哪些种细胞类型可能负责介导tslp驱动的白色脂肪损失，首先测试了tslp是否通过造血(辐射敏感)或非造血(辐射抗性)细胞中的tslpr信号传导导致脂肪损失。产生三种类型的骨髓(bm)辐照的嵌合小鼠(图3a)，然后在bm重构后对其注射对照-aav或tslp-aav。在移植了wt供体bm的tslpr ko受体小鼠中观察到了tslp诱导的脂肪损失，但在移植了tslpr ko供体bm的wt受体小鼠中没有观察到tslp诱导的脂肪损失(图35b)，这表明该作用是由造血细胞中的tslpr信号传导介导的。在hfd喂食的bm嵌合体中也看到了类似的结果(图35c-35e)。
[0327]
为了鉴定tslp诱导的脂肪损失所需的造血细胞，用对照-aav或tslp aav注射缺乏不同免疫细胞类型的各种小鼠品系中。tslp-aav的注射导致缺乏树突细胞(dc)、嗜酸性粒细胞或treg的小鼠中的显著脂肪损失(图36a-36c)。然而，在tslp-aav注射后，rag/普通γ链dko(其缺乏b细胞、t细胞和先天淋巴细胞)、rag ko(其缺乏b细胞和t细胞)和e-βko(其缺乏αβt细胞)小鼠并没有减少脂肪(图36d-36e和图30a)，这表明αβt细胞是tslp诱导的脂肪损失所必需的。为了测试这种作用是否需要cd4

或cd8

t细胞，cd4

和/或cd8

t细胞用抗体耗尽。令人惊讶的是，发现需要耗尽cd4

和cd8

t细胞两者来防止tslp诱导的白色脂肪损失(图30b)，这表明任一t细胞亚群都足以响应tslp诱导脂肪损失。因此，用cd4

或cd8

115t细胞重构rag ko小鼠恢复了rag ko小鼠响应tslp减少脂肪的能力(图30c)。重要的是，具有选
择性重构t细胞的rag/普通γ链dko小鼠变得容易遭受tslp诱导的脂肪损失(图36d)，这表明这种作用需要t细胞而不是b细胞、nk细胞或ilc。
[0328]
为了测试tslp是否直接作用于t细胞以诱导脂肪损失，将wt或tslpr ko t细胞过继转移到rag ko小鼠中。用wt而不是tslpr ko t细胞重构的tslp-aav注射的rag ko小鼠损失了白色脂肪质量(图30d)。此外，在tslp-aav注射后，过继转移wt t细胞而不是tslpr ko t细胞的tslpr ko小鼠也损失了白色脂肪质量(图30e)。总之，这些结果表明tslp直接通过t细胞上的tslpr起作用，并且t细胞中的tslpr信号传导足以介导tslp驱动的白色脂肪损失。有趣的是，tslp-aav注射后2周t细胞的耗尽允许白色脂肪质量部分但显著的恢复，这表明持续需要t细胞维持注射tslp-aav的小鼠中的脂肪损失(图30f)。
[0329]
tslp增加皮质分泌
[0330]
体重和白色脂肪组织的减少表明tslp导致小鼠中的净负能量平衡，使得热量输出大于热量摄入。然而，热量摄入减少不是tslp脂肪损失的原因，因为与注射aav的对照小鼠相比，tslp aav诱导的小鼠消耗更多食物(图31a、37a)，相等地吸收和清除口服的葡萄糖和橄榄油(图37b-37c)，以及每天在其粪便中排出更少的热量，如通过炸弹量热法测量的(图31b)。由于tslp是已知的ii型反应的激活剂，其可导致脂肪变浅(beiging)，因此假设tslp通过增加产热能量消耗来增加热量输出，从而导致净负能量平衡。然而，令人惊讶的是，没有证据表明tslp-aav注射小鼠的能量代谢增加。尽管在为期3天的代谢笼测量时期内减少了约30％的总脂肪，但对照组-aav和tslp-aav注射的小鼠之间，运动活动和耗氧率、二氧化碳产生、能量消耗和呼吸交换比率相似(图31c、37d-37h)。与这些结果一致，未偶联蛋白1(ucp1)ko小鼠的脂肪变浅能力降低，对tslp诱导的脂肪损失没有抵抗力(图37i)。总之，这些数据表明tslp不会增加产热能量消耗。
[0331]
接下来考虑，tslp-aav注射的小鼠可能会通过含热量代谢物的分泌或排泄而失去能量。对照组-aav和tslp-aav注射的小鼠的粪便热量含量和尿蛋白、葡萄糖、酮相似(图31b、37j-37l)。然而，有趣的是，tslp-aav注射的小鼠在注射后约4-5周开始出现明显的肉眼可见的油腻皮毛表型(图31d)。这发生在hfd和nc喂食的小鼠二者中，但在hfd喂食的小鼠中更为突出。为了确定tslp-aav注射的小鼠皮毛上油腻物质的身份，提取了它们的皮毛脂质，并通过薄层色谱法(tlc)进行了分析。与对照-aav注射的小鼠相比，tslp-aav注射的hfd喂食的小鼠表现出显著增加的皮毛脂质质量(图38a)，其由蜡酯、胆固醇酯、甘油三酯、游离脂肪酸和游离胆固醇的混合物组成(图31e、38b)。蜡酯(皮脂特异性脂质)的增加表明tslp-aav注射的小鼠皮脂分泌增强。与hfd喂食的小鼠相似，tslp-aav注射的nc喂食的小鼠在第10天的皮脂分泌也有所增加，这是tslp-aav注射的小鼠损失白色脂肪但还没有肉眼可见油腻的早期时间点(图34e-34f、38c-38e)。对tslp-aav注射小鼠的皮肤的组织学分析揭示，与对照小鼠相比，较少的皮脂腺和相似的总脂质含量(图38f-38i)。皮脂分泌通过皮脂腺细胞的程序性细胞死亡(全分泌)并将其细胞内的内容物释放到毛囊中而发生。因此，尽管在tslp-aav注射的小鼠中看到的较小的皮脂腺似乎是自相矛盾的，但这可能是增加的全分泌和成熟皮脂腺细胞更新的结果。事实上，皮脂腺内衬的基底细胞(增殖性皮脂腺细胞干细胞)的增加部分在每个腺体中展示出ki67阳性(图31f-31g、38j-38k)。
[0332]
增加的皮脂分泌依赖于t细胞中的tslpr信号传导，因为tslp-aav注射的rag ko小鼠没有展示出增加的毛皮蜡酯(图31h、39a)，而用wt t细胞而不是tslpr ko t细胞重构的
rag ko小鼠在tslp-aav注射后，展示出更多的毛皮脂蜡酯(图39b-39c)。皮肤的流式细胞术和组织学检查显示，tslp-aav注射后cd3

、cd4

和cd8

t细胞增加(图31i、40a-40i)，它们聚簇在皮脂腺内或皮脂腺周围。为了测试tslp介导的白色脂肪损失是否需要皮脂分泌，使用了缺乏硬脂酰-coa去饱和酶1(scd-1)并具有明显皮脂腺发育不全的asebia小鼠。asebia小鼠在tslp注射后损失了少量的白色脂肪(图31j)，这表明皮脂分泌是tslp驱动的脂肪损失所必需的。
[0333]
tslp在皮脂分泌中的稳态作用
[0334]
然后研究了tslp和t细胞是否在控制皮脂分泌方面发挥生理作用。为此，检查了未经操纵的wt和tslpr ko小鼠的毛皮脂质成分。与wt小鼠相比，tslpr ko小鼠展示出皮毛蜡酯减少和ki67 基底层细胞比例降低，而皮脂腺大小和脂质含量没有差异(图32a-32c、41a-41e)，这表明tslp在皮脂分泌中发挥稳态作用。类似地，与wt小鼠相比，未经操纵的rag ko和e-βko小鼠显示出皮毛蜡酯减少(图32d、41f-41h)，这表明t细胞在控制皮脂分泌中也发挥稳态作用。研究了这种tslp/皮脂轴是否也可能在人类中起作用。对tslp和公开获得的数据(gse98774)中一组皮脂腺相关基因的检查揭示，tslp的表达与人体皮肤中皮脂腺基因的表达是显著且正相关的(图32e、42a-42r)，这表明tslp也可以稳态地控制人类皮脂产生。
[0335]
本文呈现的结果支持一个模型，通过该模型tslp通过直接作用于t细胞来诱导皮脂分泌过多，从而诱导选择性白色脂肪损失。这些数据提供了治疗概念证明，即可以通过以富含能量的皮脂的形式从皮肤分泌热量来实现脂肪损失。在生理上，结果揭示了与免疫系统特别是tslp激活的t细胞如何在皮脂释放中发挥重要作用有关的出乎意料的生物学。除了热量之外，皮脂还含有抗微生物脂肪脂、导管素、bdefensins和抗微生物肽，它们为皮肤形成重要的机械和免疫保护屏障。由于皮肤中的tslp表达被炎性刺激上调，则在某些非限制性实施方式中，tslp诱导皮脂产生的生理作用不是调节能量平衡而是促进皮肤屏障功能。然而，如果在药理学上切换到高速档，则皮脂分泌过多可通过拉动机制诱导全身脂肪损失(图32f)。也就是说，可以通过“出脂肪汗(sweating fat)”来实现重量减少。
[0336]
本文使用的术语和表达用作描述而非限制，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，但应认识到在本技术的实施方式的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，虽然本技术描述了具体实施方式和可选特征，但本领域普通技术人员可以采用本文公开的组合物、方法和概念的修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本技术的实施方式的范围内。
[0337]
列举的实施方式
[0338]
提供了以下示例性实施方式，其编号不应被解释为指定重要性水平：
[0339]
实施方式1提供了一种治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的方法，所述方法包括：向受试者外用施用药学有效量的维生素d3类似物。
[0340]
实施方式2提供根据实施方式1所述的方法，其中tslp水平在所述受试者中全身性增加。
[0341]
实施方式3提供根据实施方式1-2中任一项所述的方法，其中所述tslp水平与对照受试者相比增加约5％至约40％。
[0342]
实施方式4提供根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述增加的tslp水平导致与对照受试者相比在所述受试者中白色脂肪组织约5％至约30％的减少。
[0343]
实施方式5提供根据实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述受试者在给定时间段后经历约5％至约30％的重量减轻。
[0344]
实施方式6提供根据实施方式1-5中任一项所述的方法，其中其中所述给定时间段是约1周至约12周。
[0345]
实施方式7提供根据实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关的紊乱是选自非酒精性脂肪性肝炎(nash)、代谢疾病、i型糖尿病、ii型糖尿病、高血压、血脂异常、冠心病、中风、胆囊疾病、肾脏疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停和呼吸问题、以及癌症中的至少一种紊乱。
[0346]
实施方式8提供根据实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关的紊乱是nash。
[0347]
实施方式9提供根据实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物选自1α,18,25-(oh)3d3；23-(m-(二甲基羟甲基)-22-炔-24,25,26,27(四去甲)-1α-oh)2d3；1α,25-二羟基-反式-异速甾醇(1,25-反式-iso-t)；(1s,3r,6s)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；(1s,3r,6r)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；22-(p-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；22-(m-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；26,27-环-22-烯-1α,24s-二羟基维生素d3(mc903或卡泊三醇)；1(s),3(r)-二羟基-20(r)-(5
’‑
乙基-5
’‑
羟基-七-1’(e),3’(e)-二烯-1
’‑
基)-9,10-断孕甾-5(z),7(e),10(19)-三烯(eb1089)；1α,25-(oh)-20-epi-22-氧杂-24,26,27-三高维生素d(kh1060)；22-氧杂-1α,25(oh)2d3(oct或22-oxa)；1r,25-二羟基-21-(3-羟基-3-甲基丁基)维生素d3和其组合。
[0348]
实施方式10提供根据实施方式1-9中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是mc903。
[0349]
实施方式11提供根据实施方式1-10中任一项所述的方法，其中所述类似物以给药方案外用施用于所述受试者，其中治疗周之后是无治疗周。
[0350]
实施方式12提供根据实施方式1-11中任一项所述的方法，其中，在所述治疗周中，受试者以选自以下的频率外用施用类似物：每天和每隔一天。
[0351]
实施方式13提供根据实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述类似物是施用至所述受试者的唯一生物活性剂。
[0352]
实施方式14提供根据实施方式1-13中任一项所述的方法，其中所述施用引起由所述受试者皮肤分泌脂质。
[0353]
实施方式15提供一种治疗肥胖或肥胖相关的紊乱的方法，所述方法包括：向所述受试者施用药学有效量的tslp同种型或表达tslp的病毒载体。
[0354]
实施方式16提供根据实施方式15所述的方法，由此tslp水平在所述受试者中全身性增加。
[0355]
实施方式17提供根据实施方式15-16中任一项所述的方法，其中所述tslp同种型具有seq id no:1、seq id no:2和/或seq id no:8。
[0356]
实施方式18提供根据实施方式15-17中任一项所述的方法，其中所述tslp同种型是稳定化的同种型。
[0357]
实施方式19提供根据实施方式15-18中任一项所述的方法，其中所述表达tslp的病毒载体包括包含tslp表达序列的aav8载体。
(e)-二烯-1
’‑
基)-9,10-断孕甾-5(z),7(e),10(19)-三烯(eb1089)；1α,25-(oh)-20-epi-22-氧杂-24,26,27-三高维生素d(kh1060)；22-氧杂-1α,25(oh)2d3(oct或22-oxa)；1r,25-二羟基-21-(3-羟基-3-甲基丁基)维生素d3和其组合。
[0373]
实施方式35提供根据实施方式30-34中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是mc903。
[0374]
实施方式36提供根据实施方式30-35中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是施用至所述受试者的唯一生物活性剂。
[0375]
实施方式37提供根据实施方式30-36中任一项所述的方法，其中所述外用组合物是贴剂。
[0376]
实施方式38提供根据实施方式30-37中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0377]
实施方式39提供一种治疗眼部紊乱的方法，所述方法包括向受试者皮肤外用施用药学有效量的维生素d3类似物，其中所述受试者遭受眼部紊乱。
[0378]
实施方式40提供根据实施方式39所述的方法，其中所述眼部紊乱选自：干眼综合征、干燥性角膜结膜炎、干燥性角膜炎、功能失调性泪液综合征、年龄相关干眼综合征、药物相关干眼综合征、更年期干眼综合征、隐形眼镜相关的干眼症、环境引起的干眼症、功能障碍性眼睑引起的干眼症、自身免疫相关性干眼症(干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮)和感染相关的结膜炎。
[0379]
实施方式41提供根据实施方式39-40中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物以外用组合物施用。
[0380]
实施方式42提供根据实施方式39-41中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物以约0.0001至约10％(w/w)的量存在。
[0381]
实施方式43提供根据实施方式39-42中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物选自：1α,18,25-(oh)3d3；23-(m-(二甲基羟甲基)-22-炔-24,25,26,27(四去甲)-1α-oh)2d3；1α,25-二羟基-反式-异速甾醇(1,25-反式-iso-t)；(1s,3r,6s)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；(1s,3r,6r)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；22-(p-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；22-(m-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；26,27-环-22-烯-1α,24s-二羟基维生素d3(mc903或卡泊三醇)；1(s),3(r)-二羟基-20(r)-(5
’‑
乙基-5
’‑
羟基-七-1’(e),3’(e)-二烯-1
’‑
基)-9,10-断孕甾-5(z),7(e),10(19)-三烯(eb1089)；1α,25-(oh)-20-epi-22-氧杂-24,26,27-三高维生素d(kh1060)；22-氧杂-1α,25(oh)2d3(oct或22-oxa)；1r,25-二羟基-21-(3-羟基-3-甲基丁基)维生素d3和其组合。
[0382]
实施方式44提供根据实施方式39-43中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是mc903。
[0383]
实施方式45提供根据实施方式39-44中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是施用至所述受试者的唯一生物活性剂。
[0384]
实施方式46提供根据实施方式39-45中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物施用至所述受试者皮肤的一部分，而不接触眼部。
[0385]
实施方式47提供一种通过减少或抑制受试者皮肤中的皮脂释放来治疗、改善或预防皮肤紊乱的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用药学有效量的tslp抑制剂。
[0386]
实施方式48提供根据实施方式47所述的方法，其中所述tslp抑制剂抑制sftslp、
lftslp、或sftslp和lftslp两者。
[0387]
实施方式49提供根据实施方式47-48中任一项所述的方法，其中所述tslp是人tslp。
[0388]
实施方式50提供根据实施方式47-49中任一项所述的方法，其中所述tslp抑制剂选自：抗体、小分子、sirna、shrna和mirna。
[0389]
实施方式51提供根据实施方式47-50中任一项所述的方法，其中所述抗体是tezepelumab。
[0390]
实施方式52提供根据实施方式47-51中任一项所述的方法，其中所述皮肤紊乱是寻常痤疮、化脓性汗腺炎或脂溢性皮炎。
[0391]
实施方式53提供一种治疗、改善和/或预防受试者秃发症的方法，所述方法包括向受试者皮肤外用施用药学有效量的维生素d3类似物，其中所述受试者遭受秃发症或需要改善秃发症。
[0392]
实施方式54提供根据实施方式53所述的方法，其中所述秃发症包括雄激素性秃发症。
[0393]
实施方式55提供根据实施方式53-54中任一项所述的方法，其中所述施用是至受秃发症影响的皮肤区域。
[0394]
实施方式56提供根据实施方式47-54中任一项所述的方法，其中所述施用是至不受秃发症影响的皮肤区域。
[0395]
实施方式57提供根据实施方式53-56中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物以外用组合物施用。
[0396]
实施方式58提供根据实施方式53-57中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物以约0.0001至约10％(w/w)的量存在。
[0397]
实施方式59提供根据实施方式53-58中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物选自：1α,18,25-(oh)3d3；23-(m-(二甲基羟甲基)-22-炔-24,25,26,27(四去甲)-1α-oh)2d3；1α,25-二羟基-反式-异速甾醇(1,25-反式-iso-t)；(1s,3r,6s)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；(1s,3r,6r)-7,19-逆-1,25-(oh)2d3；22-(p-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；22-(m-(羟基苯基)-23,24,25,26,27-五去甲-d3；26,27-环-22-烯-1α,24s-二羟基维生素d3(mc903或卡泊三醇)；1(s),3(r)-二羟基-20(r)-(5
’‑
乙基-5
’‑
羟基-七-1’(e),3’(e)-二烯-1
’‑
基)-9,10-断孕甾-5(z),7(e),10(19)-三烯(eb1089)；1α,25-(oh)-20-epi-22-氧杂-24,26,27-三高维生素d(kh1060)；22-氧杂-1α,25(oh)2d3(oct或22-oxa)；1r,25-二羟基-21-(3-羟基-3-甲基丁基)维生素d3和其组合。
[0398]
实施方式60提供根据实施方式53-59中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是mc903。
[0399]
实施方式61提供根据实施方式53-60中任一项所述的方法，其中所述维生素d3类似物是施用至所述受试者的唯一生物活性剂。
[0400]
实施方式62提供根据实施方式53-61中任一项所述的方法，其中所述外用组合物是贴剂。
[0401]
实施方式63提供根据实施方式53-62中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。