基于磁增强检测外泌体的微悬臂梁传感器及方法与流程

1.本发明涉及生物传感器领域，特别涉及基于磁增强检测外泌体的微悬臂梁传感器及方法。


背景技术：

2.每年都有数百万人死于癌症，早期发现和有效治疗是对抗癌症的两大挑战。然而，传统的癌症诊断方法主要是基于内窥镜、计算机断层扫描、x射线、正电子发射断层扫描、磁共振成像和侵袭性组织活检，这些方法往往是到癌症发展中后期形成特定的病灶才能检查出来，不适合大规模人群中筛查早期癌症。体液中的癌症标记物正发展成为一种有前途的癌症诊断和治疗效果的评估策略。不同类型癌症识别的蛋白质类生物标志物的数量正在迅速增加，但由于存在许多挑战，比如在人体血液中这些蛋白质在癌症早期阶段浓度极低且仅凭单一的一项蛋白质生物标志物的研究与临床应用之间仍存在较大差距。
3.外泌体是癌细胞分泌的一种尺寸在30-150nm左右的纳米级囊泡，具有双层磷脂膜结构，细胞能够将这些囊泡分泌到体液中。而癌源性外泌体本身就携带了与母体细胞和相应肿瘤微环境相关的许多信息，比如核酸、脂质、蛋白质，在肿瘤的发生和癌症迁移过程中发挥重要作用，被认为是非入侵性癌症早期诊断和治疗效果评估的很有潜力的生物标志物。
4.外泌体的高效分离和定量检测受到了广泛关注。目前，差速离心法被认为是分离外泌体的金标准，但它需要昂贵的高速离心机和繁琐的步骤，而且回收率低，费用高。为了定量分离的外泌体，常规的定量检测技术有纳米颗粒跟踪分析(nta)、动态光散射(dls)、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(elisa)。其中，nta是通过跟踪外泌体在悬浮液中的布朗运动并计算其浓度和大小信息来表征外泌体最流行的技术，需要经过专业培训的技术人员操纵仪器，所需检测样本浓度在10
6-109个/ml,检测灵敏度不够高；dls使用简便，需要的样本量也少，但它同样有检测灵敏度不高的问题，并且需要对外泌体上特定分子进行定量检测时，它无法做到分子标记；流式细胞术虽然可以同时做到检测同一个外泌体上的不同分子信息，但在低浓度条件下，灵敏度也面临挑战，而且仪器需要进口，价格昂贵；elisa需要大量样本，操作复杂，检测灵敏度低。在癌症早期，癌细胞没有形成特定的肿瘤组织，分泌到体液中的癌源性外泌体含量很少，因此，传统的定量检测技术都面临着灵敏度不够或检测步骤繁琐等众多缺陷。
5.尽管目前已有一些基于比色法、荧光法、表面增强拉曼散射、电化学、微悬臂梁等检测外泌体的方法能够与传统方法相媲美，但多数生物传感器的灵敏度仍然有待提高。因此，开发一种用于低丰度目标物质的富集和检测方法仍然是亟待解决的问题。
6.传统微梁检测是基于探针分子与到目标物质结合后产生的分子间作用力使微梁表面应力发生变化，产生偏转。这种作用力在目标物质浓度极低时是引起的分子间作用力是微乎其微的，甚至没有偏转信号。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供基于磁富集和磁增强相结合的微梁传感装置和方法，从原理上改变微梁偏转方式，从而摆脱需要其他试剂洗去磁颗粒的困难，达到既能高效浓缩富集又能高灵敏检测外泌体的目的。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供了生物传感组合物，包括磁颗粒、外泌体和阵列梁；所述磁颗粒与所述外泌体结合。
10.在本发明的一些具体实施方案中，所述生物传感组合物还包括探针；所述探针修饰到所述阵列梁上，且所述外泌体的表面蛋白与所述探针结合。
11.第二方面，本发明还提供了所述生物传感组合物在制备检测大分子物质、小分子物质、细胞、标记物或微生物中的一种或多种的生物传感器或检测装置中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述大分子物质包括蛋白质，所述细胞包括癌细胞或细胞外囊泡中的一种或多种，所述微生物包括细菌或病毒中的一种或多种；所述病毒包括新冠病毒。
12.第三方面，本发明还提供了生物传感器，包括所述生物传感组合物，以及可接受的部件或试剂。
13.第四方面，本发明还提供了所述生物传感器在制备检测大分子物质、小分子物质、细胞、标记物或微生物中的一种或多种的检测装置中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述大分子物质包括蛋白质，所述细胞包括癌细胞或细胞外囊泡中的一种或多种，所述微生物包括细菌或病毒中的一种或多种；所述病毒包括新冠病毒。
14.第五方面，本发明还提供了检测装置，包括所述生物传感组合物，或所述生物传感器，以及可接受的部件。
15.第六方面，本发明还提供了检测方法，基于所述生物传感组合物，所述生物传感器，或所述检测装置对待测样本进行检测。
16.第七方面，本发明还提供了非疾病诊断目的的检测方法，基于所述生物传感组合物，所述生物传感器，或所述检测装置对待测样本进行检测。
17.本发明涉及一种基于光杠杆法的微悬臂梁阵列检测外泌体的装置，具体涉及磁颗粒浓缩富集外泌体，并利用磁颗粒在外加磁场装置作用下进一步放大微梁响应信号的检测方法，可应用到外泌体等癌症标记物、细菌、新冠病毒等的超高灵敏度检测。
18.本发明提供的检测方法，外加磁场的微悬臂阵列梁传感平台，可以克服传统检测上的一些限制，外加磁场后由于每个外泌体上结合的磁纳米颗粒在磁场中受到的较大的磁场作用力，可以将种微小的分子间作用力等效转换为磁场力。这种方案操作简便，可大大降低样本消耗量，检测灵敏度为小于10个外泌体/ml，使检测时间缩短为10～30min(如图6a所示，横坐标表示时间，可以看出在平稳后30分钟内即可有效分辨不同浓度外泌体偏转量的差别)，在基于免疫测定的现场及时诊断工具的开发中显示巨大潜力。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
20.图1示基于光杠杆原理的微悬臂梁阵列检测光路示意图；
80℃的冰箱备用。
34.2、表征提取的外泌体
35.mda-mb231细胞上清液提取出的标准外泌体样本稀释一定倍数(一般nta检测稀释倍数根据具体检测情况定，此次检测稀释为100倍)，使用纳米颗粒跟踪分析仪获得浓度和尺寸分布信息(图3b)。tem观察外泌体的形态和尺寸大小(图3a)。
36.3、制备表面修饰cd63适配体的磁颗粒(cd63@mb)
37.实验中用于捕获外泌体的适配体cd63(序列为：n-nh
2-c
6-caccccacctcgctcccgtgacactaatgcta-c，如seq id no.1所示)。粒径为10nm的fe3o4磁颗粒(图2a)表面修饰有羧基基团，在碳化二亚胺类化合物的作用下，使羧基与氨基反应形成酰胺键，将核酸适配体cd63偶联至磁性纳米材料表面。通过紫外光谱吸收(uv检测)验证表面cd63探针偶联率为71.5％(图2c,图2d，表1)。表面zeta电位结果显示10nmfe3o4偶联核酸适配体cd63前后，zeta电位分别为-50.93和-43mv，偶联核酸适配体后，磁性纳米材料表面电荷绝对值降低，进一步说明核酸适配体已成功偶联至磁颗粒表面。动态光散射(dls)表明偶联适配体前后对磁颗粒粒径没有太大改变(图2b)。
38.表1.适配体标准曲线计算偶联效率
[0039][0040]
4、cd63@mb富集浓缩外泌体
[0041]
配置一系列不同浓度(图6所列举的所有浓度)的外泌体标准样本于5ml的离心管中，取12.5ug/ml的上述磁颗粒加入其中混合均匀，4℃放置90min，溶液中的外泌体与磁颗粒结合完成，将溶液放置到磁力架上，磁颗粒会被吸附聚集到一起。去除上清液，保留聚集的磁颗粒，加入200ul的pbs，重悬磁颗粒，得到浓缩富集后的磁颗粒结合的外泌体。
[0042]
5、阵列梁区别修饰探针分子及检测外泌体
[0043]
(1)阵列梁放置于酶孔板中，加入v(h2so4):v(h2o2)＝3:1的食人鱼溶液清洗悬臂梁表面10min，去离子水清洗三次，氮气吹干。阵列梁放置在区别修饰的装置中，四根毛细管分别插入1,3,5,7号梁表面修饰上探针分子egfr(n-sh-c
6-gccttaguaacgtgctttgatgtcgattcgacaggaggc-c，如seq id no.2所示)2h，取出放入酶孔板，pbst溶液清洗3次，氮气吹干。不修饰探针分子的梁2,4,6,8与修饰梁形成原位对照。由于探针分子一端已经修饰了巯基，与梁的金表面发生反应化学反应形成au-s键结合到梁表面。
[0044]
(2)加入封闭试剂6-巯基-1-己醇(6-mercapto-1-hexanol，mch)室温放置30min，pbst清洗3次，氮气吹干。目的是将金表面未结合探针分子的空白位点占据，防止非特异性吸附对偏转检测结果带来影响。
[0045]
(3)磁颗粒浓缩富集后的外泌体溶液加入到上一步修饰好的阵列梁中，让外泌体表面蛋白egrg与修饰到梁上的探针分子结合90min，pbs清洗一次。
[0046]
将梁放置到反应池中，调节八个激光，使其刚好照射到八根阵列梁的尖端，反射光斑使用位置敏感探测器(psd)接收，获得稳定的基准线后，将磁场装置放置在反应池后，在磁场作用下，结合在梁表面的磁颗粒被拉动，带动微梁发生的偏转信号被实时记录。
[0047]
本发明的有益效果包括但不限于：
[0048]
(1)悬臂梁直接检测外泌体，是利用外泌体与梁上的探针分子结合后的分子间作用力引起微梁表面应力产生应力差而导致梁偏转，而有了磁颗粒结合的外泌体是由于磁场力引起的微梁偏转，这样可以将微小的分子间作用力等效替换成一个较大的磁场力，以便在极低浓度下仍能检测到目标物质。
[0049]
(2)磁颗粒对外泌体浓缩富集，相较于其他生物传感器，不仅不用洗脱磁颗粒，反而可以二次利用，达到在磁场作用下进一步放大检测信号的作用。
[0050]
(3)本发明提供的基于磁增强的微梁免疫传感快速检测外泌体的方法，与现有的生物免疫传感器相比，检测灵敏度最高，操作简便，易发展成为一种适用于现场检测的仪器。
[0051]
本发明提供的基于磁增强检测外泌体的微悬臂梁传感器及方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
[0052]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0053]
实施例1磁颗粒富集浓缩外泌体
[0054]
1、适配体cd63偶联磁颗粒
[0055]
主要试剂：15mmmes，ph5.5；10mmtris-hcl；纯化水：ph7-8；edc：采用mes配制成10mg/ml，现配现用；适配体cd63母液：20od/支，12000离心1min，开盖后向离心管中加入500μl tris-hcl，充分溶解。
[0056]
实验步骤：
[0057]
1)取5mg 10nmfe3o4(1mg/ml，5ml)至100kd超滤管，4000g离心，弃下清，加入15mm mes洗涤两次，并用mes重悬定容至4.7ml；
[0058]
2)分别涡旋加入5od适配体(200μl适配体母液)、2mg edc(100μl)，迅速颠倒混匀后于37℃震荡反应过夜(转速约150rpm/min，反应时间约20h)；
[0059]
3)反应结束后，将反应液取出，采用100kd超滤，收集下清(用于检测偶联率)；
[0060]
4)使用纯化水超滤洗涤样品3次，并定容至5ml，即为偶联适配体的10nmfe3o4。
[0061]
2、将偶联适配体的磁颗粒稀释到12.5μg/ml与一定浓度的外泌体混合，室温放置2h，让偶联适配体的磁颗粒充分结合外泌体。
[0062]
实施例2基于磁增强的外泌体检测与直接检测外泌体效果对比
[0063]
1)直接检测外泌体：按照技术内容中阵列梁分别修饰适配体egfr的方法修饰好阵列梁，将修饰好的梁放入反应池，加入1xpbs缓冲液，设置蠕动泵流速为30
□
μl/min，待微悬臂梁偏转信号稳定以后，加入4ml浓度为2.76*108个/ml外泌体溶液，实时记录偏转信号，得到如图5a所示的检测结果，四根修饰适配体的梁显示了较大的偏转信号，四根未修饰适配体的梁作为对照实验，显示了非特异性吸附带来的偏转影响。图5b是将四根未修饰适配体的梁偏转曲线求平均，再将四根修饰适配体的梁偏转曲线求平均，然后将后者平均值减去前者平均值得到特异性捕获外泌体带来的差分偏转信号曲线图。如果将梁上修饰的适配体依次换成muc-1、epcam、her-2和egfr，图5c的实验结果表明egfr适配体捕获外泌体产生的偏转量最大，所以后续实验都选取egfr这个靶标取捕获外泌体。图5d表明直接检测的检测限是106个/ml外泌体。
[0064]
2)磁增强方式检测外泌体(示意图如图4所示)：按照技术内容中阵列梁分别修饰
适配体egfr的方法修饰好阵列梁，将修饰好的梁放入酶孔板中，将磁颗粒浓缩富集后的外泌体加入酶孔板，与微悬臂梁共同孵育90min，将结合上磁颗粒和外泌体的梁装进反应池，待微悬臂梁偏转信号稳定后，加入磁场装置，检测偏转信号(图6a)。图6b的结果展示优化磁颗粒浓度后基于磁增强的方法检测外泌体可达到7个/ml的检测灵敏度，与不使用磁颗粒直接检测对比，检测极限提升5个数量级。
[0065]
实施例3加入磁颗粒的浓度对微梁检测灵敏度的影响
[0066]
分别配置浓度为25、12.5、6.25、3.125
□
g/ml的cd63@mb磁颗粒溶液，采用上述磁增强检测外泌体的方法，对2.76*106个/ml的mda-mb231外泌体进行检测，结果发现磁颗粒浓度为12.5
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g/ml的磁颗粒浓度为最佳检测结果(图6c)。此结果也说明了磁颗粒浓度对检测外泌体的灵敏度有很大影响，推测可能是由于高浓度的磁颗粒附着在外泌体表面，占满了后续egfr探针分子可以结合的位点，从而导致检测信号大幅度降低。
[0067]
实施例4进一步探索超低浓度外泌体时磁颗粒浓度对检测信号的影响
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将磁颗粒浓度进一步降低到1.25
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g/ml，分别配置浓度为276、138、69、27、14、7个/ml的外泌体，依次通过磁增强的方式检测偏转信号，可以发现检测灵敏度有了更大的提高，在外泌体浓度为7个/ml时，仍然有偏转信号(图6b)。
[0069]
实施例5磁增强检测细菌
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修饰到磁颗粒和微悬臂梁表面的的适配体换成可以特异性捕获大肠杆菌的序列
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5'-atccgtcacacctgctctactggccggctcagcatgactaagaaggaagttatgtggtgttggc tcccgtatttttttttt-3'，如seq id no.3所示。对细菌的磁颗粒浓缩富集和基于磁场放大的微悬臂梁检测操作步骤与外泌体的基本一致。图7是磁增强的方法对大肠杆菌的检测结果，细菌浓度为104、103、102cfu/ml时仍有响应，说明这种磁颗粒浓缩富集并外加磁场的方法对检测低浓度细菌同样具有很大的优势。
[0072]
实施例6
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图8是新冠病毒结构的示意图，针对表面s蛋白位点，在磁颗粒表面修饰针对新冠病毒s蛋白的特异性探针分子，在悬臂梁表面修饰上探针分子，也可以达到高灵敏检测病毒含量的目的。
[0074]
以上实施例中所用探针分子不限于适配体，也可以是相应的特异性抗体。
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以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。