一种保湿、抗氧化的红曲发酵物及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于化妆品原料技术领域，尤其涉及一种保湿、抗氧化的红曲发酵物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.皮肤的健康与角质层含水量有很大关系，当角质层含水量低于10％时，角质层变脆易裂，皮肤容易干裂起皮，出现缺水状况。通过外用保湿化妆品，能够降低皮肤角质层中的水分蒸发率，增加真皮、表皮水分渗透率，提供皮肤保护屏障，减少环境带来的损伤，促进自我修复，所以保湿一直是肤用化妆品必不可少的功效之一。自由基是一类外层轨道含有未配对电子的原子、原子团或分子，具有顺磁性和高度反应活性，很容易进行氧化还原反应。生物体内过剩的自由基会攻击脂肪、蛋白质、核酸、不饱和脂肪酸等生物大分子，引起这些分子交联或断裂，生成有害物质，影响生物膜功能或破坏蛋白质构象，细胞功能发生障碍，导致细胞损伤变性或死亡。自由基还可激活酪氨酸氧化酶产生黑色素，使黑色素累积沉淀于皮肤组织，出现老年斑，引起机体逐渐衰老或病变，产生老年病的生理病理变化。
3.红曲霉是药食两用真菌，红曲霉接种在大米上进行发酵的终产物叫做红曲，又称丹曲，可广泛应用于食品着色，食品发酵及中医药，在我国的应用已有千年的历史。红曲霉在生长过程中既能产生强大的酶系，又能够有丰富的初级代谢产物产生，如酶类(糊精化酶、麦芽糖酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、果胶酶和醋化酶等)，脂肪酸，有机酸。不同种类菌株产酶的类型及产量有所差异，其淀粉酶、糖化酶等能将淀粉水解形成糊精、低聚糖和葡萄糖等低分子物质，蛋白酶能将蛋白质分解成多肽、氨基酸等小分子化合物。红曲霉在生长过程中会有一些生理活性物质如洛伐他丁、莫纳可林、麦角固醇、红曲多糖、γ-氨基丁酸、天然植物激素、抗菌活性物等，具有极高的营养、保健、药用价值，是一种天然、安全、有效的保健食品、药品原料。
4.现今世界化妆品的发展趋势是倡导绿色、环保和安全，且追求功效。中草药作为天然传统药物，富含蛋白质、多糖、生物碱、皂苷、氨基酸、维生素、有机酸等多种活性物质。近十多年来，以作用温和又具有一定功效的中草药提取物作为天然物添加剂，应用于化妆品中已经成为新产品开发的热点。中草药大部分为植物源性药材，其有效成分较复杂且多存在于细胞胞浆中，受到植物细胞壁中纤维素、半纤维素和木质素等致密结构的阻碍，导致中草药活性成分难以提取、有效成分利用率低、药效不理想而造成资源浪费，在一定程度上制约了中草药发展。
5.红曲发酵在食品和药用领域有一定的研究基础，但在化妆品领域的相应研究仍较少，且现有红曲发酵工艺通常为固体发酵，存在发酵速率慢，再现性差，质量不稳定，难以大规模生产的缺陷，极大限制了其在化妆品领域中的应用。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一
种保湿、抗氧化的红曲发酵物及其制备方法与应用。本发明采用中草药与红曲霉进行液体双向发酵，并结合高压均质提取技术，破碎红曲菌丝体和中草药，使活性物质直接释放到发酵物中，得到具有优良保湿、抗氧化功效的液体状红曲发酵物，更加利于皮肤的吸收利用。
7.本发明提供了一种红曲发酵物的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将中草药粉碎后，与水混合制得匀浆液；所述中草药为黄芪和/或黄芩；
9.(2)在所述匀浆液加入红曲霉进行双向液体发酵，高压均质，制得红曲发酵物。
10.本发明以红曲霉和中草药(选自黄芪和/或黄芩)作为原料，采用液体双向发酵技术并结合高压均质提取技术进行处理，不仅取得良好的发酵效果，还能对红曲菌丝体和中草药实现有效破碎，使发酵后的活性物质直接释放到发酵物中，从而制得液体状红曲发酵物。该红曲发酵物具有良好的保湿、抗氧化功效，并有利于皮肤的吸收利用。
11.优选的，步骤(1)所述匀浆液的料液比为(1-2)：10。上述料液比中，中草药与水的计量单位分别为g和ml。
12.优选的，步骤(1)所述匀浆液还包括灭菌处理。
13.更优选的，所述灭菌处理的灭菌温度≥110℃，灭菌时间≥20min。
14.优选的，在步骤(2)所述双向液体发酵中，还可加入马铃薯、葡萄糖、大豆粕、玉米粉、大米、蛋白胨中的至少一种。上述营养物质可起到补充碳源和氮源的作用，从而保证红曲霉菌种前期接入的过程中能有一定的能源利用，能够快速适应和生长。
15.优选的，步骤(2)所述红曲霉为活化后的红曲霉曲种，其活化方法为：
16.(1)从红曲霉菌株斜面上用无菌生理盐水洗下孢子，过滤除去菌丝，制得红曲霉孢子悬液；
17.(2)取马铃薯葡萄糖培养基，接种所述红曲霉孢子悬液，振荡培养，得到活化后的红曲霉曲种。
18.优选的，步骤(2)所述红曲霉在所述匀浆液中的接种量为5-10％。
19.优选的，步骤(2)所述双向液体发酵的时间为5-15d。更优选的，步骤(2)所述双向液体发酵的时间为7d。
20.优选的，步骤(2)所述双向液体发酵的温度为26-30℃，转速为150-250r/min。
21.优选的，步骤(2)所述高压均质的均质压力为35-100mpa，均质时间为25-40min。
22.本发明还提供了一种红曲发酵物，由上述制备方法所制得。
23.本发明还提供了上述红曲发酵物在日化领域中的应用。
24.更优选的，所述日化领域为化妆品领域。
25.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
26.(1)本发明通过液体双向发酵与物理高压均质提取技术相结合，提高了有效活性成分含量，所产生的红曲多糖及一些小分子成分如蛋白质、氨基酸溶解到溶液中，可以起到滋养皮肤的功效，并且具有显著的皮肤抗氧化保湿功效；
27.(2)本发明所采用的红曲霉含有丰富且强大的酶系，黄芪、黄芩等中草药经酶作用后，细胞壁中的纤维素、木质素、果胶等物质被降解，其活性成分得以释放；中草药活性成分酶解为小分子物质，增强药效以利于机体消化吸收；
28.(3)本发明通过发酵的方式降低了黄芪、黄芩的毒副作用，并能产生新活性物质。同时，中草药中的某些成分可促进微生物的生长繁殖，以此实现中草药与微生物的协同作
用；
29.(4)本发明工艺条件简单，生产周期短，成本低，且所用的原料为纯天然组分，安全无污染，廉价易得。
具体实施方式
30.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
31.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
32.实施例1
33.本实施例提供一种红曲发酵物，其制备方法包括以下步骤：
34.(1)匀浆液制备：将黄芪与黄芩以1:1的质量比混合并粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；
35.(2)以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
36.在步骤(1)制得匀浆液中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；并在培养体系中加入20g/l大米和10g/l蛋白胨，起到补充碳源和氮源的作用；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲发酵物。
37.实施例2
38.本实施例提供一种红曲发酵物，其制备方法包括以下步骤：
39.(1)匀浆液制备：将黄芩粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；
40.(2)以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
41.在步骤(1)制得匀浆液中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲发酵物。
42.实施例3
43.本实施例提供一种红曲发酵物，其制备方法包括以下步骤：
44.(1)匀浆液制备：将黄芪粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混
合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；
45.(2)以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
46.在步骤(1)制得匀浆液中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲发酵物。
47.对比例1
48.本对比例提供一种红曲发酵物，其制备方法包括以下步骤：
49.(1)匀浆液制备：将黄芪与黄芩以1:1的质量比混合并粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；
50.(2)以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
51.在步骤(1)制得匀浆液中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；并在培养体系中加入20g/l大米和10g/l蛋白胨，起到补充碳源和氮源的作用；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲发酵物。
52.与实施例1相比，对比例1不包括高压均质的步骤。
53.对比例2
54.本对比例提供一种红曲发酵物，其制备方法包括以下步骤：
55.(1)匀浆液制备：将黄芩粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；
56.(2)以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
57.在步骤(1)制得匀浆液中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲发酵物。
58.与实施例2相比，对比例2不包括高压均质的步骤。
59.对比例3
60.本对比例提供一种红曲发酵物，其制备方法包括以下步骤：
61.(1)匀浆液制备：将黄芪粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混
合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；
62.(2)以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
63.在步骤(1)制得匀浆液中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲发酵物。
64.与实施例3相比，对比例3不包括高压均质的步骤。
65.对比例4
66.本对比例提供一种中草药提取物，其制备方法包括以下步骤：
67.将黄芪与黄芩以1:1的质量比混合并粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；静置7d，灭菌，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得中草药提取物。
68.对比例5
69.本对比例提供一种中草药提取物，其制备方法包括以下步骤：
70.将黄芩粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；静置7d，灭菌，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得中草药提取物。
71.对比例6
72.本对比例提供一种中草药提取物，其制备方法包括以下步骤：
73.将黄芪粉碎，过80目筛，将所得粉末与水按1:10的料液比进行混合后，于匀浆机中进行匀浆，得到匀浆液；匀浆液高温蒸汽灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min，冷却；静置7d，灭菌，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得中草药提取物。
74.对比例7
75.本对比例例提供一种红曲霉产物，其制备方法包括以下步骤：
76.以红曲霉菌株(购买于广东微生物菌种保藏中心，编号gdmcc3.438)斜面28℃培养7d后，用无菌生理盐水洗下孢子，振荡并充分打散孢子后过滤除去菌丝，制成终浓度约为106个/ml的红曲霉孢子悬液；取马铃薯葡萄糖培养基，接种上述红曲霉孢子悬液，接种量为5％，振荡培养4d得到红曲霉发酵曲种；
77.在含20g/l大米和10g/l蛋白胨的液体培养基中加入红曲霉发酵曲种进行双向液体发酵，接种量为10％；在28℃，160r/min转速条件下进行发酵培养7d；灭菌后，以50mpa的压力均质30min，过滤，10000rpm的管式离心机离心，用无菌容器收集上清液，即得红曲霉产物。
78.应用实施例
79.本应用实施例提供一种添加红曲发酵物的护肤组合物，按质量百分数计，其配方组成如下表所示：
[0080][0081]
应用对比例
[0082]
本应用对比例提供一种护肤精华液，按质量百分数计，其配方组成如下表所示：
[0083]
成分质量分数(％)甘油2.001,3-丁二醇5.00edta二钠0.02汉生胶0.20β-葡聚糖4.001,2-己二醇1.00ha0.1对羟基苯乙酮0.40去离子水余量
[0084]
产品效果测试
[0085]
对实施例1-3、对比例1-7所制得产物的多糖和黄酮含量，以及总抗氧化活性和透明质酸酶抑制能力进行检测。
[0086]
其中，多糖含量测定采用蒽酮-硫酸比色法进行测定、黄酮含量测定采用《中国药典》2015年版《sn/t 4592-2016出口食品中总黄酮的测定》进行测定。
[0087]
按frap法测定总抗氧化活性，步骤为：
[0088]
1)样品的测定：在反应管中加入100μl样品溶液(根据情况适当稀释)，再加入3ml frap工作液，混匀，37℃条件下反应15min，于593nm处测定吸光值，每个实验重复三次。
[0089]
2)feso4标准曲线的测定：根据步骤1)，以0.1-1.6mmol/l的feso4的标准溶液代替样品绘制标准曲线。
[0090]
3)计算结果：样品最终的总抗氧化活性以feso4的当量浓度表示，单位为mmol/l，以feso4为标准溶液，根据反应后的a值，在标准曲线上求得相应feso4的浓度(mmol/l)，定义为frap值。frap值越大，抗氧化活性越强。
[0091]
采用透明质酸酶体外抑制法测定透明质酸酶抑制能力，步骤为：
[0092]
取0.1ml cacl2溶液(0.25mmol/l)和0.5ml透明质酸酶液(100u/ml)于37℃下水浴恒温培养20min；加入受试样品液0.5ml，继续在保温20min；再加入0.5ml透明质酸钠液(0.5mg/ml)，37℃水浴恒温培养30min后取出，在常温下放置5min；加入0.1ml naoh溶液(0.4mol/l)和0.5ml乙酰丙酮溶液(3.5ml乙酰丙酮溶于50ml的1.0mol/l碳酸钠溶液中)，于沸水浴中加热15min后立即转移至冰水水浴冷却5min；滴加1.0ml埃尔利希试剂(0.8g对二甲基氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇中)，并用3.0ml无水乙醇稀释，室温放置20min显色，用分光光度计测定波长为540nm处吸光度值。样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式如下：
[0093]
透明质酸酶抑制率＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式(1)
[0094]
在上式中，a——对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)
[0095]
b——对照空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)
[0096]
c——试样溶液吸光度值
[0097]
d——试样空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)
[0098]
上述测试结果如表1所示
[0099]
表1多糖和黄酮含量、抗氧化活性及透明质酸酶半抑制量
[0100]
[0101]
由表1可知：由实施例1-3与对比例4-6比较可得，黄芪、黄芩等中草药经红曲霉发酵后，多糖和黄酮含量均比原汁均有所增加。红曲霉发酵后多糖含量增高，可能因为红曲霉中酶系比较丰富，在发酵过程中将淀粉等其他物质转换为可溶性糖。黄酮可能由于糖基转移酶系的作用，一些难溶于水的活性成分(如黄酮类化合物)与糖基结合成为糖苷，提高了这些成分的水溶性。而实施例1-3与对比例1-3的比较可得，通过采用发酵技术与高压均质提取技术结合，所得产物的总抗氧化能力得到了极大的提升，并且对透明质酸酶有很好的抑制作用(即具有良好的保湿功效)。同等条件下，与单个组分相比，黄芪和黄芩组合物中多糖和黄酮含量及抗氧化效果更好。而由实施例1-3与对比例7的比较可知，若不采用中草药组分，仅使用常规碳源和氮源与红曲霉配合进行发酵，所得产物并不具备良好的保湿和抗氧化功效。
[0102]
挑选由40名志愿者组成的测试组(年龄20-58岁)，男女各半，左侧使用应用实施例1所制备的护肤组合物，右侧使用应用对比例1所制备的护肤组合物，每天早晚各用一次，每次各涂抹2g产品于脸部，并按摩2分钟，测试周期为8周，分别于0周、4周、6周、8周对志愿者进行面部皮肤测试，本测试遵循随机和双盲测试原则。
[0103]
面部皮肤测试：通过visia全脸分析仪拍照分析面部皱纹变化情况，采用mpa580皮肤测试仪分析面部黑素、水合度变化情况，乳酸刺激实验测定皮肤敏感度变化情况。其中乳酸刺激实验操作流程为：试验前志愿者统一使用温和清洁剂清洗面部皮肤，然后用含有10％乳酸的滤纸片贴于鼻唇沟处，用4分法分别记录志愿者在2.5min和5min时的刺痛感觉，无剌痛为0分、轻度刺痛为1分、中度刺痛为2分、重度刺痛为3分。两次结果相加作为评价皮肤敏感度的结果。
[0104]
最终实验结果显示，相比于应用对比例，使用含有黄芪和黄芩组合的红曲发酵物的应用实施例后的面部皱纹数量和深度得到明显改善，皱纹数量下降达20％，说明将黄芪和黄芩组合后的红曲发酵物作为有效活性成份应用于化妆品中，能有效抚平皱纹和预防皱纹产生。使用应用实施例后的面部皮肤水合度上升10％-15％，说明将黄芪和黄芩组合后的红曲发酵物作为有效的活性成份应用于化妆品中，能预防和克服皮肤干燥问题。与应用对比例相比，使用应用实施例后的面部皮肤接敏感度下降了约26％-36％，说明将黄芪和黄芩组合后的红曲发酵物作为有效的活性成份应用于化妆品中，可以有效降低皮肤敏感度，增强皮肤屏障功能。
[0105]
上面对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。