一种产气荚膜梭菌抑制剂及其应用的制作方法

ledeb.)为蔷薇科龙芽草属植物，又名龙芽草、脱力草、狼牙草；仙鹤草全草含有内酯、鞣质、酚类和皂苷等活性成分，主要用于治疗用于咯血，吐血，崩漏下血，疟疾，血痢，痈肿疮毒，阴痒带下，脱力劳伤。
9.根据本发明的具体实施方案，本发明中，鹤草芽包括鹤草芽全药的提取物。
10.根据本发明的具体实施方案，本发明中，鹤草芽包括从鹤草芽全药中分离提取得到的化合物。
11.根据本发明的具体实施方案，本发明中，从鹤草芽全药中分离提取得到的化合物包括鹤草酚，所述鹤草酚的结构如下式(i)所示：
[0012][0013]
根据本发明的具体实施方案，本发明中，鹤草芽全药的提取物按照以下方法制备：
[0014]
取鹤草芽适量，加入5-8倍质量的乙酸乙酯-氯仿混合溶剂，先常温条件下浸泡1-2h，后在回流状态下蒸煮3-5h，蒸煮完成后，冷却至室温，用质量分数为10％-30％的乙醇水溶液萃取2-3次，萃取完成后向母液中加入干燥剂进行干燥，干燥完成后去除有机溶剂，得到鹤草芽的提取物。
[0015]
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述乙酸乙酯-氯仿混合溶剂中，乙酸乙酯与氯仿的体积比为1:1-4；优选为1:2。本发明中，采用体积比为1:1-4的乙酸乙酯-氯仿混合溶剂，能够提高提取物中有效成分鹤草酚的含量，从而能够间接地提高提取物对于产气荚膜梭菌的抑制效果。
[0016]
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述干燥剂包括但不限于无水硫酸钠、无水硫酸镁等常用的干燥剂。干燥剂的目的在于去除萃取液中的水分，提高提取物的储存稳定性。
[0017]
此外，本发明还提供了一种鹤草芽提取物，其是按照本发明中所述的提取方法制备得到的，其中，所述提取物中鹤草酚的含量为0.15％-0.5％(质量分数)。
[0018]
本发明还提供了一种用于抑制产气荚膜梭菌的组合物，其含有本发明所述的提取物和/或鹤草酚。
[0019]
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述组合物还包括其他用于抑制产气荚膜梭菌的试剂。本发明中，所述的其他用于抑制产气荚膜梭菌的试剂指的是能够与本发明中提供的鹤草芽提取物进行复配而不互相产生干扰，并且能够对产气荚膜梭菌产生抑制和/或消灭作用的物质，例如产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶、抗生素。
[0020]
综上所述，本发明提供了鹤草芽在制备抑制产气荚膜梭菌的试剂中的新应用。所述鹤草芽中的活性成分鹤草酚能够抑制同时并消灭产气荚膜梭菌。本发明还提供了一种鹤草芽提取物以及用于抑制产气荚膜梭菌的组合物。本发明为产气荚膜梭菌的防治提供了一种新的思路，相比现有技术，本发明具有包括如下的有益效果：
[0021]
(1)鹤草芽是一味中药，使用鹤草芽或其提取物作为抑制产气荚膜梭菌的试剂具
有安全、毒副作用小的优点；
[0022]
(2)鹤草芽相对现有技术中的抑制产气荚膜梭菌的试剂而言具有廉价易得的优势，其获取更为便利，价格更为低廉，因此更适用于大面积的推广使用；
[0023]
(3)本发明提供的提取方法及按照所述方法制备得到的提取物中，鹤草酚的含量高；
[0024]
(4)鹤草芽提取物及鹤草酚对于产气荚膜梭菌的抑制效果好、有效浓度低，可单独用于抑制产气荚膜梭菌，也可以与其他试剂一起联用，为产气荚膜梭菌的防治提供了新的策略。
附图说明
[0025]
图1为鹤草芽提取物作用下产气荚膜梭菌的时间-杀菌曲线图。
[0026]
图2为鹤草酚作用下产气荚膜梭菌的时间-杀菌曲线图。
具体实施方式
[0027]
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0028]
具体实施方式中，除有特别说明以外，所有试剂的来源均可通过商购获得；除有特别说明之外，所有的操作方法均为本领域技术人员熟知的常规操作。
[0029]
实施例1鹤草芽提取物的制备
[0030]
取鹤草芽50g(购自北京同仁堂)于圆底烧瓶中，适当粉碎后加入400g乙酸乙酯-氯仿有机混合溶剂，室温条件下浸泡1h左右，其中，有机混合溶剂中乙酸乙酯与氯仿的体积比为1:2。浸泡过后，在回流条件下蒸煮4-5h，蒸煮完成后，冷却至室温，用质量分数为10％的乙醇水溶液(自行配制)100ml萃取2次，萃取后的母液用无水硫酸钠进行干燥，干燥完成后进行过滤，滤去其中的无水硫酸钠后通过旋转蒸发仪和油泵去除有机溶剂乙酸乙酯和氯仿，得到鹤草芽的提取物。经检测，制备得到的鹤草芽提取物中，鹤草酚的含量为0.456％。
[0031]
实施例2鹤草芽提取物对于产气荚膜梭菌的抑制实验
[0032]
2.1实验材料
[0033]
a型产气荚膜梭菌cvcc2027，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；鹤草芽提取物按照实施例1中的制备方法制备得到；二甲基亚砜购自安耐吉化学公司；脑心浸液肉汤培养基(brain heart infusion broth，bhi)、布鲁氏菌培养基(brucella agar)、琼脂、血红素、维生素ki等均购买自青岛海博生物技术有限公司，其他实验中所用的仪器或者试剂、试剂盒均购买自美国sigma公司；鹤草酚购自安耐吉化学。
[0034]
2.2主要试剂的配制方法
[0035]
(1)精密称取实施例1中的鹤草芽提取物和鹤草酚，溶解于dmso中，分别配制成浓度为1.25、2.5和5μm的溶液，备用。
[0036]
(2)bhi液体培养基的制备：精密称取bhi固体粉末19.25g，溶解于400ml蒸馏水中搅拌溶解，定容至500ml，121℃高压灭菌15min，4℃保存，备用。
[0037]
(3)布氏血琼脂平板的制备：取布鲁氏琼脂固体粉末38.00g(含琼脂1.5％)，溶解于600ml蒸馏水中搅拌溶解，定容至800ml，按5μg/ml的比例添加血红素、按1μg/ml的比例添
加维生素k1，充分混匀后121℃高压灭菌15min，待培养基冷却至50℃，添加5％的细胞裂解羊血，凝固后4℃保存，备用。
[0038]
2.3实验方法
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2.3.1细菌复苏及培养
[0040]
将产气荚膜梭菌cvcc2027甘油菌按1:1000的比例接种至高压灭菌的bhi液体培养基中，置于2.5l圆底立式厌氧培养袋中，加入2.5l厌氧产气包及氧气指示剂，37℃静置过夜培养，备用。之后用接菌环蘸取试管内的细菌培养物，划线于布氏血琼脂平板，继续置于2.5l圆底立式厌氧培养袋中，加入2.5l厌氧产气包及氧气指示剂，37℃静置过夜培养，备用。于超净工作台内将平板上生长良好的单菌落挑取接种于高压灭菌的bhi液体培养基中，按上述培养条件连续于bhi液体培养基及布氏血琼脂平板上传代，以确保细菌的活力。将最后传代的布氏血琼脂平板封口，备用，用以后续实验细菌的接种。
[0041]
2.3.2抑制实验
[0042]
(1)于超净工作台内将平板上生长良好的单菌落挑取接种于高压灭菌的bhi液体培养基中，置于2.5l圆底立式厌氧培养袋中，加入2.5l厌氧产气包及氧气指示剂，37℃静置过夜培养，备用。
[0043]
(2)取过夜培养的产气荚膜梭菌cvcc2027，将细菌培养物的600nm处的od值调整至0.3左右，分装至试管中，将试管分成两组，一组加入“步骤2.2中”鹤草芽提取物，另一组加入“步骤2.2中”制备的鹤草酚。另取试管加入dmso，作为阴性对照，充分混匀。之后，将全部试管于37℃静置厌氧培养，分别于2h、4h、6h、8h及10h取每管内的菌液，倍比稀释，涂布于bhi固体平板，于37℃静置厌氧培养24h，对平板上产气荚膜梭菌的菌落计数，记录鹤草芽提取物及鹤草酚对产气荚膜梭菌生长状况的影响，以时间(h)为横坐标，以菌落数的对数值(lg)为纵坐标绘制不同浓度的鹤草芽提取物及鹤草酚对产气荚膜梭菌的时间-杀菌曲线。
[0044]
2.4实验结果分析
[0045]
实验结果如下表1、表2和图1、图2所示：
[0046]
表1：鹤草芽水提物对于产气荚膜梭菌的抑制结果。
[0047][0048][0049]
表2：鹤草酚对于产气荚膜梭菌的抑制结果
[0050][0051]
从表1和图1中的实验结果可以看出，鹤草酚提取物能够抑制产气荚膜梭菌的生长，特别是在浓度为2.5μm以上时，2h后即低于最低可检测到的菌落数量。从表2和图2中的结果可以看出，鹤草酚是抑制产气荚膜梭菌的有效成分，鹤草酚在相同浓度下的抑制效果要优于提取物。
[0052]
实施例3鹤草芽提取物对于污泥中产气荚膜梭菌的抑制实验
[0053]
本实施例中采用的实验方法和试剂基本与实施例2相同，唯一不同之处在于本实施例中是将活化后的产气荚膜梭菌接种至污泥中(污泥取自下水道，经过高压蒸汽灭菌后才接种的产气荚膜梭菌)。实施例3中仅采用了鹤草酚进行实验，采用相同体积的dmso作为阴性对照，实验结果如下表3所示：
[0054]
表3鹤草酚对于污泥中产气荚膜梭菌的抑制实验结果
[0055][0056]
从上述实验结果中可以看出，本发明提供的鹤草酚对于污泥中的产气夹膜梭菌也具有良好的抑制效果，在浓度1.25μm可以看到菌落数相比于阴性对照出现明显的下降，当浓度达到2.5μm时，已经能够看到有明显的抑制效果，而当浓度达到5μm时，产气夹膜梭杆菌基本全部被抑制。
[0057]
对比例1
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本对比例提供了一种鹤草酚的提取实验，本对比例与实施例1的区别仅在于浸泡和蒸煮时所用的溶剂与实施例不同，本对比例使用的是乙醚。经检测，本对比例得到的提取物中，鹤草酚的含量为0.025％。对比发现，本发明提供的提取方法及按照所述方法制备得到的提取物中，鹤草酚的含量高于一般有机溶剂提取得到的提取物。
[0059]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。