一种基于数字免疫分析技术的细胞因子快速检测方法与流程

1.本发明涉及临床检测技术领域，尤其涉及一种基于数字免疫分析技术的细胞因子快速检测方法。


背景技术：

2.目前，在癌症治疗中免疫疗法的出现给患者带来了新的希望，但目前免疫疗法过程中也伴随着不可避免的不良反应，例如以发烧、低血压、毛细血管渗漏综合征为特点的细胞因子释放风暴(crs)，以及以意识混乱、听力障碍、癫痫发作和昏迷为特点的神经毒性(ne)等。研究发现，不良反应与高细胞因子峰值水平相关。这些不良反应一旦处理不及时，将危及患者的生命。因此，免疫疗法实施之后需要对细胞因子进行严密监测，及时干预。然而，现有的用于细胞因子水平检测的技术存在着需要专业且昂贵的设备、检测周期通常大于24小时、所需患者血液样本体积大、检测灵敏度不够等问题。由于这些限制的存在，有关免疫治疗不良反应的管理决策要等到接受治疗的患者出现诸如发烧、低血压、或显著的神经功能恶化等临床症状后才能进一步进行，这对于及时发现免疫疗法带来的可能危及生命的不良反应显然是非常不切实际的。另外，目前还不清楚为什么一些患者对干预措施有反应，而另一些患者对同样的干预措施没有反应。因此，对细胞因子水平进行动态评估对于理解免疫疗法的有效性和安全性背后的机制是至关重要的。综上，迫切需要开发能够对细胞因子进行准确检测的有效的实时监测的新方法。
3.现有的对细胞因子的检测技术，主要是基于传统的酶联免疫吸附测定法，该方法为终点读数法，无法对测定的过程进行实时监测，而且传统的酶联免疫吸附法无法兼顾灵敏度和快速两个重要的因素，在体内存在低浓度的细胞因子的情况下往往存在假阴性的现象。现有的数字免疫分析技术，包括通过流式细胞法对单个抗原抗体复合物进行荧光检测的技术，以及利用微孔法进行重点读数的技术，均存在检测时间和检测灵敏度无法兼得的问题，而本发明所采用的细胞因子检测方法为实时数字免疫分析技术，能够利用时间分辨率换取空间分辨率，并通过时间分辨率得到抗原抗体反应的动力学信息，从而使细胞因子的检测更加灵敏快速。因此，这为细胞因子的灵敏快速检测提供了改进的空间。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于数字免疫分析技术的细胞因子快速检测方法。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
6.提供一种基于数字免疫分析技术的细胞因子快速检测方法，包括：
7.s1、以表面修饰液对反应模块中样品通道的表面进行修饰，并将所述细胞因子的捕获抗体以一定的浓度固定于所述样品通道的表面后，以封闭液对所述样品通道的表面进行封闭，并以洗涤液对所述样品通道的表面进行清洗；
8.s2、将含有所述细胞因子的待测样本与表面修饰有检测抗体的纳米颗粒混合，以
形成所述细胞因子-检测抗体-纳米颗粒的待测样品复合物；将所述待测样品复合物的溶液加至所述样品通道内，并采集所述待测样品复合物被所述样品通道表面捕获的图像信息；
9.s3、对所述图像信息进行降噪处理，并将所述图像信息根据采集时间的顺序划分为若干图像序列，所述图像序列包括若干时间上连续的所述图像信息，且相邻两所述图像序列间相差一帧的所述图像信息；对各所述图像序列进行平均处理以去除随机噪声，并对相邻两所述图像序列中排序位置相对应的图像信息进行差减处理，即可计算获得每一帧中所述样品通道表面上所述纳米颗粒的变化，进而计算获得所述样品通道表面上所述纳米颗粒的总数。
10.优选地，所述表面修饰液为能够对所述样品通道的表面进行化学或物理处理，并使所述样品通道的表面容易与所述捕获抗体结合的试剂。
11.优选地，所述样品通道为能够使所述待测样品复合物的溶液流动的通道，包括但不限于微流控通道、毛细管通道等。
12.优选地，所述样品通道的表面选自：二氧化硅材质、pdms材质、镀铬材质或镀金材质中的至少一种。
13.优选地，所述细胞因子为具有临床诊断意义的细胞因子，包括但不限于il-4、il-5、il-6等。
14.优选地，所述捕获抗体为能够与待测细胞因子形成抗原-抗体复合物的抗体，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
15.优选地，所述纳米颗粒为能够修饰蛋白的纳米材料，包括但不限于纳米金、纳米银等。
16.优选地，所述纳米颗粒的直径不小于20nm，且不大于150nm。
17.进一步地，所述纳米颗粒为纳米金颗粒，溶液体积为10μl，数量为3
×
108个。
18.优选地，每个所述细胞因子-检测抗体-纳米颗粒的待测样品复合物中，所述细胞因子、所述检测抗体以及所述纳米颗粒均为单一的形式，不形成多聚复合物。
19.优选地，用于采集所述图像信息的装置包括：ccd相机或cmos相机中的至少一种。
20.进一步地，用于采集所述图像信息的装置为cmos相机。
21.优选地，采集所述图像信息时的成像方法为明场成像方法。
22.进一步地，成像所采用的高数值孔径物镜为放大倍数为40倍，na0.95的物镜。
23.优选地，采集帧数包括但不限于1000帧，采集速度包括但不限于50-106pfs，曝光时间包括但不限于3-5ms。
24.进一步地，采集帧数为1000帧，采集速度为106fps，采集时间为60s，采集视野为332μm
×
332μm。
25.优选地，所述图像信息的格式包括：png格式或tiff格式中的至少一种。
26.优选地，所述降噪处理的方法包括：利用matlab编程对所述图像信息的背景噪音进行去除或利用imagej软件对所述图像信息的背景噪音进行去除中的至少一种。
27.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
28.本发明的细胞因子快速检测方法利用显微成像系统，可以对细胞因子实现灵敏快速分析，通过对反应表面纳米颗粒的计数，可以得到细胞因子的浓度信息。相比传统的酶联免疫吸附测定等免疫学检测方法，本发明具有快速、灵敏度高的优势。因为本发明利用的是
对单个抗原抗体反应进行实时计数的方法，故具有常规免疫学检测不具备的实时快速的优势，并且该发明由于是在微反应管道中进行，还具有所需样本体积小的优势。
附图说明
29.图1为通过cmos相机实时采集所述待测样品复合物被所述样品通道表面捕获的图像信息；
30.图2为本发明中实施例2的结果图，图2a为所述样品通道表面上所述纳米金颗粒的数量随时间的变化，图2b为单个所述纳米金颗粒被所述样品通道表面捕获所发生的时间；
31.图3为本发明中实施例3的结果图，图3a为所述样品通道表面上所述纳米金颗粒的数量随时间的变化，图3b为细胞因子il-5得到标准曲线以及检测灵敏度。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
34.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
35.实施例1
36.本实施例提供一种基于数字免疫分析技术的细胞因子快速检测方法，包括：
37.s1、以表面修饰液对反应模块中样品通道的表面进行修饰，并将所述细胞因子的捕获抗体以一定的浓度固定于所述样品通道的表面后，以封闭液对所述样品通道的表面进行封闭，并以洗涤液对所述样品通道的表面进行清洗；
38.s2、将含有所述细胞因子的待测样本与表面修饰有检测抗体的纳米颗粒混合，以形成所述细胞因子-检测抗体-纳米颗粒的待测样品复合物；
39.一个所述纳米颗粒同时捕获两个或两个以上的所述细胞因子的概率符合泊松分布，设该事件的预计发生数量为a，实际发生数量为b，则：
[0040][0041]
当达到细胞因子检测范围上限时，确保细胞因子数量和纳米颗粒的数量之比小于20:100，即a＝0.2；同时，捕获抗体间的间距控制在大于120nm，确保一个纳米颗粒同时结合两个以上的细胞因子的可能性可以忽略不计，即单个纳米颗粒即代表单个细胞因子的捕获事件；
[0042]
将所述待测样品复合物的溶液加至所述样品通道内，并采集所述待测样品复合物被所述样品通道表面捕获的图像信息；
[0043]
s3、对所述图像信息进行降噪处理，并将所述图像信息根据采集时间的顺序划分为若干图像序列，所述图像序列包括若干时间上连续的所述图像信息，且相邻两所述图像序列间相差一帧的所述图像信息；对各所述图像序列中排序位置相对应的图像信息进行平
均处理以去除随机噪声，并对相邻两所述图像序列进行差减处理，即可计算获得每一帧中所述样品通道表面上所述纳米颗粒的变化，进而计算获得所述样品通道表面上所述纳米颗粒的总数。
[0044]
实施例2
[0045]
本实施例提供一种基于数字免疫分析技术的细胞因子il-4快速检测方法，包括：
[0046]
s1、依次以20μl的乙醇和20μl的去离子水对反应模块中样品通道的表面进行冲洗，所述样品通道的宽度为200μl，长度为1000μm，高度为40μm，底部为0.17mm的bk-7玻片(覆盖有pdms材质，通过氧等离子体处理粘合)，侧壁以及顶部为pdms材质；以氮气对所述样品通道的表面进行吹干30s，并以10μl的多聚赖氨酸溶液对所述样品通道的表面进行处理10min；再以20μl的去离子水对所述样品通道的表面进行冲洗，并以氮气对所述样品通道的表面进行吹干30s，即完成所述样品通道表面的修饰处理；将50μl的所述细胞因子il-4的捕获抗体(20mg/l)以10μl/min的流速通入所述样品通道后，以10μl的bsa溶液(5％)对所述样品通道的表面进行封闭，并以20μl的pbst溶液对所述样品通道的表面进行清洗；
[0047]
s2、将所述细胞因子il-4的标准品加至标准血清中，制得终浓度为10000ng/l的初始标准溶液，并以标准血清对所述初始标准溶液进行梯度稀释，依次制得终浓度分别为2000ng/l、400ng/l、80ng/l、16ng/l、3.2ng/l、0.64ng/l以及0.128ng/l的标准稀释液；将1μl的所述标准稀释液与表面修饰有il-4检测抗体的纳米金颗粒溶液混合，并将10μl的待测样本与的表面修饰有il-4检测抗体的纳米金颗粒溶液混合，所述纳米金颗粒的直径为150nm，10μl所述纳米金颗粒溶液中含有3
×
108个所述纳米金颗粒；
[0048]
将所形成的所述细胞因子-检测抗体-纳米颗粒的待测样品复合物的溶液加至所述样品通道内，通过明场光源以及高数值孔径物镜(放大倍数为40倍，na0.95的物镜)对所述样品通道的底部表面进行光学成像，如图1所示，通过cmos相机以106fps的帧速采集所述待测样品复合物被所述样品通道表面捕获的图像信息，采集帧数为1000帧，采集时的视场为2048像素
×
2048像素，每个像素对应6.5μm，即实际成像面积约为300μm
×
300μm；
[0049]
s3、利用matlab代码对所述图像信息进行降噪处理，并将所述图像信息根据采集时间的顺序划分为若干图像序列，所述图像序列包括100帧时间上连续的所述图像信息，且相邻两所述图像序列间相差一帧的所述图像信息；对各所述图像序列进行平均处理以去除随机噪声，并对相邻两所述图像序列中排序位置相对应的图像信息进行差减处理，即可计算获得每一帧中所述样品通道表面上所述纳米金颗粒的变化，进而计算获得10min时所述样品通道表面上所述纳米金颗粒的总数；
[0050]
s4、利用已知浓度的标准稀释液与所计算获得的纳米金颗粒数量，绘制10min时所述细胞因子il-4的标准曲线，结果如图2所示。
[0051]
实施例3
[0052]
本实施例提供一种基于数字免疫分析技术的细胞因子il-5快速检测方法，包括：
[0053]
s1、依次以20μl的乙醇和20μl的去离子水对反应模块中样品通道的表面进行冲洗，所述样品通道的宽度为200μl，长度为1000μm，高度为40μm，底部为0.17mm的bk-7玻片(表面镀铬2nm，并镀金47nm)，侧壁以及顶部为pdms材质；以氢火焰对所述样品通道的镀金表面进行处理，并以1mm的peg-oh/peg-cooh的巯基乙醇溶液(100:1)于暗处对所述样品通道的表面进行修饰；再依次以去离子水和无水乙醇对所述样品通道的表面进行冲洗，并以
氮气对所述样品通道的表面进行吹干，以nhs/edc溶液对所述样品通道的表面进行活化，即完成所述样品通道表面的修饰处理；将50μl的所述细胞因子il-5的捕获抗体(20mg/l)以10μl/min的流速通入所述样品通道后，以10μl的bsa溶液(5％)对所述样品通道的表面进行封闭，并以20μl的pbst溶液对所述样品通道的表面进行清洗；
[0054]
s2、将所述细胞因子il-5的标准品加至标准血清中，制得终浓度为10000ng/l的初始标准溶液，并以标准血清对所述初始标准溶液进行梯度稀释，依次制得终浓度分别为2000ng/l、400ng/l、80ng/l、16ng/l、3.2ng/l、0.64ng/l以及0.128ng/l的标准稀释液；将1μl的所述标准稀释液与表面修饰有il-5检测抗体的纳米金颗粒溶液混合，并将10μl的待测样本与的表面修饰有il-5检测抗体的纳米金颗粒溶液混合，所述纳米金颗粒的直径为60nm，10μl所述纳米金颗粒溶液中含有3
×
108个所述纳米金颗粒；
[0055]
将所形成的所述细胞因子-检测抗体-纳米颗粒的待测样品复合物的溶液加至所述样品通道内，通过明场光源以及高数值孔径物镜(放大倍数为40倍，物镜为na0.95的物镜)对所述样品通道的底部表面进行光学成像，通过cmos相机以106fps的帧速采集所述待测样品复合物被所述样品通道表面捕获的图像信息，采集帧数为1000帧，采集时的视场为2048像素
×
2048像素，每个像素对应6.5μm，即实际成像面积约为300μm
×
300μm；
[0056]
s3、利用matlab代码对所述图像信息进行降噪处理，并将所述图像信息根据采集时间的顺序划分为若干图像序列，所述图像序列包括100帧时间上连续的所述图像信息，且相邻两所述图像序列间相差一帧的所述图像信息；对各所述图像序列进行平均处理以去除随机噪声，并对相邻两所述图像序列中排序位置相对应的图像信息进行差减处理，即可计算获得每一帧中所述样品通道表面上所述纳米金颗粒的变化，进而计算获得10min时所述样品通道表面上所述纳米金颗粒的总数；
[0057]
s4、利用已知浓度的标准稀释液与所计算获得的纳米金颗粒数量，绘制10min时所述细胞因子il-5的标准曲线，结果如图3所示。
[0058]
综上所述，本发明利用数字免疫分析技术，实现了对单个抗原抗体复合物的结合事件的追踪，相比传统的elisa方法对细胞因子的检测，本方法具有灵敏度更高，检测时间更短，所需样本的体积更小的优势。因为本方法能够对单个抗原抗体复合物的结合事件进行实时检测，因此能够通过结合事件发生的前后实现两个小于光学显微镜分辨率距离的纳米粒子的区分；由于抗原抗体结合速率除了受本身性质的影响外，还受反应物浓度的影响，因此能够结合反应速率做出判断，实现更快速区分。传统的elisa方法采用终点法，样本体积较大，操作繁琐、耗时耗力，本方法则操作较为简便，更适合自动化设备对进样、反应的操控需求。
[0059]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。