一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱的多组分均相免疫分析方法与流程

1.本发明属于化学领域，涉及单颗粒电感耦合等离子体质谱(single particle inductively coupled plasma mass spectrometry，spicpms)的分析化学传感领域，特别涉及一种基于单颗粒电感耦合等离子质谱的多组分均相免疫分析用于胰腺癌相关的三种特异性抗原标志物的血清评估。


背景技术：

2.胰腺癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，由于缺乏简便、敏感的诊断方法和特异性的生物标志物，其预前诊断和术后复发预测一直是一个难题。联合生物标志物分析策略为克服这种困境提供了有希望的解决手段，但仍需要在方法学方面进行发展，以在无需清洗或分离的条件下获得准确可靠、干扰最小的结果。本文提出了一种能同时检测三种胰腺癌相关生物标志物的单颗粒均相免疫分析方法。单颗粒电感耦合等离子体质谱法（spicpms）由于具有良好的分辨率和多元素检测器而不存在质谱重叠的优势，由特异性抗体标记的贵金属纳米粒子（金纳米颗粒（aunps），银纳米颗粒（agnps）和铂纳米颗粒（ptnps））作为探针，同时为生物标志物（糖类抗原125（ca125）、癌胚抗原（cea）和糖类抗原（ca199））提供了三到四个数量级的线性范围和低水平检测限（lods）。通过同时对spicpms的强度信号和频率信号进行分析，该方法成功地应用于患者的血清评估，其得出的结果与临床常规方法测定结果吻合良好。结合多种生物标志物联合预前诊断策略，该方法有可能成为胰腺癌预前诊断和复发风险评估的有用工具。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种基于单颗粒电感耦合等离子体质谱（spicpms）的多组分癌症标志物分析方法，及其在对胰腺癌相关癌症标志物血清检测方面的应用。
4.本发明的原理是：本方法基于分析物诱导纳米颗粒聚集的原理。当修饰有特异性癌症标志物（含三种，即ca125、cea和ca199）抗体的贵金属纳米颗粒（含三种，即au、ag和pt）探针与含有的癌症标志物抗原的样品混合时，贵金属探针对抗原靶点的结合导致三种纳米颗粒形成聚合物。这种由抗原抗体特异性识别诱导的纳米颗粒聚集导致探针聚合物数量减少和聚合物尺寸增加，从而引起单个贵金属纳米颗粒聚合物的频率和强度变化。通过spicpms的频率和强度两种模式同时对三种贵金属纳米颗粒聚集变化进行测定，即实现对于三种抗原的同时测定。两种模式可提高样品检测的准确度。
附图说明
5.本发明采用的基于分析物诱导贵金属纳米颗粒聚集的原理，凭借无机质谱高分辨的质荷比信号区分的优势，实现均相体系中对三种贵金属同时检测以达到对三种胰腺癌相关抗原的同时分析
图1 为本发明分析方法的机理图；图2为本发明分析方法中三种贵金属纳米颗粒电子显微镜表征图和混合探针的信号区分图；图3 为本发明分析方法中spicpms在三组分均相免疫分析中的时间分辨数据图；图4 为本发明分析方法中spicpms两种模式对三种贵金属在三种抗原检测中的线性图；图5 为本发明分析方法中混合探针的干扰分析图；图6 为本发明分析方法在血清中检测的应用图。
具体实施方式
6.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用到的水均为超纯水，经milli-q超纯水净化系统处理而成。
7.本发明按以下具体步骤进行。
8.a. 29.5 nm aunps的制备a1取2 ml 1%氯金酸（w/v）加入到60 ml超纯水中，在三口瓶中放入磁子混匀，在加热套中回流加热至沸保持温度15 min；a2 加入1.3 ml的1%柠檬酸钠还原剂，搅拌下保持回流30 min；a3 关闭加热套温控系统，保持搅拌子搅拌，待溶液缓慢降温至室温，倒出溶液至100 ml储备瓶中，定容至100 ml。
9.b. 32.1 nm agnps的制备b1 取20 ml 1%柠檬酸钠还原剂加入到75 ml超纯水中，在三口瓶中放入磁子混匀，在加热套中回流加热至70 o
c并保持15 min；b2 接着，1.7 ml 1% agno3被加入到溶液中，随后迅速加入2 ml 0.1% (w/v)新制的nabh4溶液；b3 反应保持在70 o
c下1 h，随后慢慢降至室温。种子溶液被定容到100 ml并储存与4 o
c下以备用；b4 2 ml 1%柠檬酸钠还原剂与75 ml超纯水混合并用加热套加热至沸保持15 min；b5 10 ml种子溶液加入，紧接着加入1.7 ml 1% agno3，溶液加热搅拌回流1 h；b6 2 ml 1%柠檬酸钠还原剂与1.7 ml1% agno3被加入到反应液中，反应持续1 h；b7 2 ml 1%柠檬酸钠还原剂与1.7 ml1% agno3被加入到反应液中，反应持续1 h，制备出第二阶段种子溶液，取出定容后4 oc
下保存备用；b8 2 ml 1%柠檬酸钠还原剂与80 ml超纯水混合并用加热套加热至80 o
c保持15 min；b9 10 ml第二阶段种子溶液加入，紧接着再加入1.7 ml 1% agno3，溶液保持80 o
c搅拌回流2 h，缓慢冷却至室温，取出ag纳米颗粒，定容后4 o
c下保存备用。
10.c. 37.3 nm ptnps的制备c1 1%氯铂酸与超纯水混合在三颈烧瓶中，加热套加热至沸并保持15 min；c2 随后加入1.1 ml 1%柠檬酸钠还原剂与0.05% 柠檬酸的混合溶液，紧接着继续加入0.55 ml 1%柠檬酸钠还原剂，0.05%柠檬酸与0.08～0.11%的kbh4混合溶液；
c3 关闭加热套加热系统，让混合溶液缓慢降至室温，取出种子纳米颗粒溶液并定容；c4 将56 ml超纯水与2 ml种子溶液混合，加入1%氯铂酸溶液1.8 ml，随后加入1 ml 1%柠檬酸钠还原剂与1.25%抗坏血酸溶液的混合溶液；c5 缓慢升温至沸，保持15 min，将第二阶段的种子溶液取出并定容；c6 将56 ml超纯水与2 ml第二阶段种子溶液混合，加入1%氯铂酸溶液1.8 ml，随后加入1 ml 1%柠檬酸钠还原剂与1.25%抗坏血酸溶液的混合溶液；c7 缓慢升温至沸，保持15 min，将pt纳米颗粒溶液取出并定容备用。
11.d. 贵金属纳米颗粒标记d1 取1 ml aunps，先加入100 μl ph 9.0的硼酸缓冲溶液，调节ph大约至8.0-8.4左右，使得纳米颗粒ph在抗体等电点附近（自身不带电荷），用涡旋混匀；d2 加入40 μg ca125抗体，涡旋混匀，在室温（25℃）下反应30 min；d3 加入封闭剂10 %的bsa溶液130 ul，在室温（25℃）下封阻30 min；d4 反应后溶液在4oc下离心（10000 rpm）18 min，吸去上清之后，浓缩液溶解于含1% bsa的pbs缓冲溶液中；d5 agnps与ptnps的标记方法与aunps类似，包被探针和报告探针的标记方式类似；d6 将三种标记的贵金属探针浓缩3倍，随后将三种浓缩贵金属探针混合以制备混合贵金属探针溶液。
12.e. 免疫反应e1 于200 μl离心管中加入10 μl 贵金属混合包被探针，然后加入10 μl血清样本，最后加入10 μl贵金属混合报告探针；e2 溶液涡旋均匀后，在37oc下孵育2 h。
13.f. 样品稀释f1 吸取20 μl反应好的溶液，加入到2 ml离心管中，加入超纯水2 ml，用涡旋混匀；f2 另取上述稀释好的溶液20 μl，加入到4 ml离心管中，加入超纯水 4 ml，用涡旋混匀，将所得溶液进行spicpms测定。
14.g. spicpms频率模式测定g1 将icpms的吸液泵管插入到稀释好的溶液中；g2 设定频率模式对溶液进行信号采集，采集时间为10 s，速度为50 μs/次。
15.h. spicpms强度模式测定h1 将icpms的吸液泵管插入到稀释好的溶液中；h2 设定强度模式对溶液进行信号采集，采集时间为10 s，速度为50 μs/次。
16.下面结合说明书附图做进一步的说明，但本发明分析方法并不限于下述实施例。
17.如图1所示，本发明基于spicpms对胰腺癌三种相关抗原进行均相免疫分析。
18.实施例1、贵金属混合探针的表征和spicpms信号区分探究为揭示spicpms对实验中所用的贵金属混合探针中au，ag，pt的信号区分优势，分别用紫外可见分光光度法和spicpms法对贵金属混合探针进行了测定，由图2(a),(b)和(c)可以看出，所制备的三种贵金属纳米颗粒分散性良好，粒径均一，由图2(d)和(e)可以看出，相对于用光学的方法（图2(a)）来讲，电感耦合等离子体质谱法（图2(b)）在贵金属元素的信号区分方面展现出极大优势，可以利用这一优势结合spicpms可以对均相体系进行分析的特点，
对均相多组分免疫反应进行探究。
19.实施例2、贵金属混合探针应用于均相三组分免疫反应的信号响应探究贵金属混合探针与标液中对应胰腺癌相关抗原混合时，由于抗原与特异性抗体之间的抗原抗体特异性识别，可以使得相应抗原与其对应特异性抗体相结合，导致抗体标记的纳米颗粒形成不同程度的聚合物，这种聚合物的平均大小，尺寸受均相溶液中抗原的总体水平影响，结果如图3所示，随着标液中抗原浓度的增大，纳米颗粒形成的聚合物尺寸增大，所对应的纳米颗粒聚合物的数量由于聚合和减少，增大尺寸的纳米颗粒聚合物会使其在spicpms中的总体平均强度；同时在spicpms一定采集时间中，聚合物所产生的频率信号会减少。
20.实施例3、探究本发明分析方法对三种胰腺癌相关抗原的检测线性本实施例探究了基于spicpms对三种胰腺癌相关抗原的均相免疫分析，通过同时对频率模式和强度模式信号的采集，实现了对三种标志物的同时检测，结果如图4所示。
21.spicpms对ca125检测的线性根据ca125浓度与spicpms响应信号所呈的正比关系，得到了在频率模式下2-200 u/ml的线性关系（检出限为0.43 u/ml），在强度模式下2-500 u/ml的线性关系（检出限为1.57 u/ml）。
22.spicpms对cea检测的线性根据cea浓度与spicpms响应信号所呈的正比关系，得到了在频率模式下2-500 ng/ml的线性关系（检出限为0.90 ng/ml），在强度模式下0.8-500 ng/ml的线性关系（检出限为0.23 ng/ml）。
23.spicpms对ca199检测的线性根据ca199浓度与spicpms响应信号所呈的正比关系，得到了在频率模式下1-500 u/ml的线性关系（检出限为0.80 u/ml），在强度模式下1-1000 u/ml的线性关系（检出限为0.24 u/ml）。
24.实施例4、本发明分析方法中贵金属混合探针的稳定性和选择性探究本发明方法中贵金属混合探针的稳定性本方法采用500 u/ml ca125，167 ng/ml cea，1000 u/ml ca199作为干扰实验中样品的浓度，所采用的干扰抗原以及浓度分别为为甲胎蛋白（alpha fetoprotein，afp）5 μg/ml，人免疫球蛋白g（immunoglobulin g，igg）5 μg/ml，本方法还探究一定的盐度条件对反应体系的影响，用10 mg/ml nacl溶液作为盐度探究。按实验步骤，依次将实验样品与干扰物质相混合，与aunps探针反应完全之后，样品经稀释，在spicpms下用强度模式对样品进行分析。结果如图5所示，除三种抗原在各自存在时会引起对应贵金属信号的明显改变，抗原彼此对混合探针没有信号干扰，并且对于干扰抗原和盐的抗干扰能力和稳定性良好，证明所建立的多组分均相免疫方法中贵金属混合探针的稳定性和选择性是可观的。
25.实施例5、探究本发明分析方法对实际血样中三种胰腺癌标志物的检测探究1. 血清采集本发明分析方法的应用中所采用的血清均来自于成都市七医院，血清含量由成都市七医院检测提供（电化学发光法）2. 血样检测
每个血清样品取样量为10 ul，与10 ul包被探针和10 ul报告探针相混合，反应后用spicpms检测。结果如图6所示，在发明方法的三种标志物检测线性范围内，spicpms测出的ca125，cea，ca199含量与七医院电化学发光法所得出的结果有良好的吻合，方法的相关系数分别为ca125相关度0.989，cea相关度0.997，ca199相关度0.994。