一种高效柱层析系统的制作方法

1.本实用新型涉及一种高效柱层析系统，适用于中药及天然药物有效成分的分离与纯化，属于医药设备领域，


背景技术：

2.柱层析是目前生物、医药、食品等领域广泛应用的一种分离、纯化技术，是根据混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同将混合物分离的一种技术手段。根据柱层析机理的不同，又包含吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等多种形式。然而，现有柱层析应用过程中普遍存在层析柱利用效率低、稳定性差、产能低等问题，严重制约着层析技术在产业化中的大规模应用。
3.银杏叶提取物是极具代表性的药用植物提取物之一，《中国药典》2020版明确规定其总黄酮含量要大于24％，内酯含量不得低于6％，银杏酸低于5mg/kg。符合药典标准的银杏叶提取物具有优异的活血、化瘀、通络功效，其主要活性成分黄酮类化合物及萜类内酯具有改善脑血管循环、扩张冠状动脉、提高机体免疫力等功能，已广泛应用于药物、保健品、食品添加剂、功能性饮料、化妆品等领域，开发前景广阔，经济和社会价值较大。然而，现有纯化银杏叶提取物的柱层析设备仅靠洗脱液自身重力流动分离、纯化银杏叶提取物粗品，耗时长；层析过程需人员时刻观察、更换洗脱溶剂，层析效率低、人工成本高；需要手动不断调整洗脱液等的流速，费时费力且所得产物批间差异大；在后续脱酸工艺上，还需再手动更换层析柱，难以做到提取物纯化分离、脱酸工艺的动态连续作业。
4.针对现有层析设备的上述不足，迫切需要对柱层析设备进行优化与升级，创新设计一种高效柱层析系统，实现自动上样、洗脱、收集、检测等步骤，提高层析柱作业效率、缩短层析耗时，提高目标产物纯度以及提高目标产物批间稳定性。


技术实现要素：

5.针对现有柱层析设备无法实现自动化操作，且耗时长、收率低、稳定性差及所得产物纯度低等共性技术难题，本实用新型要解决的技术问题是提供一种自动上样、洗脱的高效柱层析系统。
6.发明人对现有柱层析系统的各个单元进行功能整合和管线优化，分别在储液单元10、暂存单元20及收集单元30各连通管路上设置电磁阀，在节点连通管上设置第一高压恒流泵1、第二高压恒流泵2及第一在线检测器5、第二在线检测器6，并结合数字化控制技术，实现上样、除杂、洗脱、收集等作业环节的自动化操作，大幅提高了层析效率，并提高了目标产物的批间稳定性。
7.本实用新型所解决的技术问题具体由如下技术方案来实现：
8.一种高效柱层析系统，主要由层析柱3、脱酸柱4、储液单元10、暂存单元20及收集单元30组成，其别之处在于：
9.所述储液单元10通过第一高压恒流泵进液管101与第一高压恒流泵1连通，第一高
压恒流泵1通过第一高压恒流泵出液管102与层析柱3连通，层析柱3通过第一在线检测器进液管201与第一在线检测器5连通，第一在线检测器5通过第一在线检测器出液管202与暂存单元20连通，暂存单元20通过第二高压恒流泵进液管203与第二高压恒流泵2连通，第二高压恒流泵2通过第二高压恒流泵出液管204与脱酸柱4连通，脱酸柱4通过第二在线检测器进液管301与第二在线检测器6连通；第二在线检测器6通过第二在线检测器出液管302与收集单元30连通。
10.本实用新型中，所述储液单元10由第一储液罐11、第二储液罐12、第三储液罐13、第四储液罐14和第五储液罐15分别通过第一储液罐连通管111、第二储液罐连通管121、第三储液罐连通管131、第四储液罐连通管141和第五储液罐连通管151以并联的方式与六通阀7连通，六通阀7通过第一高压恒流泵进液管101与第一高压恒流泵1连通。
11.所述第一储液罐连通管111、第二储液罐连通管121、第三储液罐连通管131、第四储液罐连通管141和第五储液罐连通管151上分别设置有第一储液罐磁控阀112、第二储液罐磁控阀122、第三储液罐磁控阀132、第四储液罐磁控阀142和第五储液罐磁控阀152。
12.本实用新型中，所述暂存单元20由第一暂存罐21、第二暂存罐22、第三暂存罐23和第四暂存罐24分别通过第一暂存罐连通管211、第二暂存罐连通管221、第三暂存罐连通管231和第四暂存罐连通管241以并联的方式与五通阀8连通，五通阀8通过第一在线检测器出液管202与第一在线检测器5连通。
13.所述第一暂存罐连通管211、第二暂存罐连通管221、第三暂存罐连通管231和第四暂存罐连通管241上分别设置有第一暂存罐磁控阀212、第二暂存罐磁控阀222、第三暂存罐磁控阀232和第四暂存罐磁控阀242。
14.本实用新型中，所述收集单元30由第一收集罐31、第二收集罐32和第三收集罐33分别通过第一收集罐连通管311、第二收集罐连通管321、第三收集罐连通管331以并联的方式连通四通阀9，四通阀9通过第二在线检测器进液管301与第二在线检测器6连通。
15.所述第一收集罐连通管311、第二收集罐连通管321和第三收集罐连通管331上分别设置有第一收集罐磁控阀312、第二收集罐磁控阀322和第三收集罐磁控阀332。
16.本实用新型一种高效柱层析系统在创新设计、改进过程中，发明人注意到，现有柱层析仅靠洗脱液自身重力实现分离纯化，层析耗时长；层析过程需人员时刻观察、手动更换洗脱溶剂、调整流速，作业效率低、人工成本高，纯化效果不稳定，产物批间差异大；涉及层析、脱酸工艺时，需手动更换层析柱，无法实现动态连续作业。
17.针对上述柱层析存在的共性技术难题，发明人对现有柱层析各单元进行优化好整合，通过系统化的管路连接，对电磁阀、高压恒流泵、在线检测器等部件的进行优化配制，并结合计算机程序控制，实现层析作业的连续化、动态化和一体化。
18.具体来说，本实用新型一种高效柱层析系统进行中药、天然药物药效成分层析作业时，分别将洗柱纯化水、上样药液、低浓度洗脱溶剂、中浓度洗脱溶剂和高浓度洗脱溶剂分别加入到储液单元10的第一储液罐11、第二储液罐12、第三储液罐13、第四储液罐14和第五储液罐15。然后，通过中控计算机设定的程序，分别控制储液单元10、暂存单元20和收集单元30中各磁控阀的开关条件和开关顺序，分别控制第一高压恒流泵1和第二高压恒流泵2开关条件和流量大小。同时，通过中控计算机连接第一在线检测器5和第二在线检测器6，实时调整和修正上述此磁控阀的开关条件及高压恒流泵的开关条件、流量大小。通过上述设
置，在中控计算机的控制下，启动层析程序，进行洗柱、上样、除杂、洗脱、收集及检测的自动化操作，最终从中药、天然药物中分离、纯化得到目标产物。
19.下面以银杏叶提取物的分离、纯化为例，进一步详述本实用新型的层析作业过程：
20.首先，将纯化水、银杏叶提取液、10％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液分别加入到储液单元10的第一储液罐11、第二储液罐12、第三储液罐13、第四储液罐14和第五储液罐15。根据银杏叶提取物纯化的标准工艺，计算纯化水、银杏叶提取液、10％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液的用量。通过中控计算机设定的程序，分别控制储液单元10中的第一储液罐磁控阀112、第二储液罐磁控阀122、第三储液罐磁控阀132、第四储液罐磁控阀142、第五储液罐磁控阀152的开关及第一高压恒流泵1开关和流量。
21.接着，启动中控计算机预定程序，按照纯水
→
银杏叶提取物液
→
纯水
→
10％乙醇
→
70％乙醇
→
95％乙醇的顺序依次开启或关闭第一储液罐磁控阀112、第二储液罐磁控阀122、第三储液罐磁控阀132、第四储液罐磁控阀142、第五储液罐磁控阀152及第一高压恒流泵1，从而依次完成纯水洗柱
→
银杏叶提取物上样
→
纯水除杂
→
10％乙醇除杂
→
纯水除杂
→
70％乙醇洗脱
→
95％乙醇洗柱等各工艺步骤。第一在线检测器5设置于层析柱3的下端，对层析柱3流出的液体进行实时检测，并将检测数据反馈给中控计算机，通过中控计算机程序实时调整和修正上述此磁控阀的开关条件及高压恒流泵的开关条件、流量大小，使层析参数条件保持平稳、准确，使银杏叶目标产物层析洗脱液得到完全收集。
22.与之同时，通过中控计算机程序的设定，使得从层析柱3流出的洗柱纯化水、70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗柱液分别流入暂存单元20的第一暂存罐21、第三暂存罐23和第四暂存罐24，其他液体，如银杏叶上柱流出液、银杏叶液上柱纯水洗柱液、10％乙醇除杂洗脱液等均流入第二暂存罐22，暂存，弃去。
23.继续运行中控计算机程序，按照纯水
→
70％乙醇洗脱液
→
95％乙醇洗柱液的顺序依次开启或关闭第一暂存罐磁控阀212、第二暂存罐磁控阀222、第三暂存罐磁控阀232、第四暂存罐磁控阀242及第二高压恒流泵2，从而依次完成纯水洗柱
→
70％乙醇洗脱液脱酸
→
95％乙醇清洗柱等各工艺步骤。第二在线检测器6设置于脱酸柱4的下端，脱酸注4流出的液体进行实时检测，并将检测数据反馈给中控计算机，通过中控计算机程序实时调整和修正上述此磁控阀的开关条件及第二高压恒流泵2的开关条件、流量大小，使层析参数条件保持平稳、准确。
24.通过中控计算机程序的设定，使得从脱酸柱4流出的洗柱纯化水、70％乙醇洗脱液脱酸液目标产物和95％乙醇洗柱液分别流入收集单元30的第一收集罐31、第二收集罐32和第三收集罐33。其中，洗柱纯化水弃去，95％乙醇洗柱液收集、回收，70％乙醇洗脱液脱酸液和为目标收集产物。
25.本实用新型通过对储液单元10、暂存单元20、收集单元30、层析柱3、脱酸柱4及恒流泵、磁控阀等各节点部件进行整合和优化布局，通过管线的连接和在线检测单元的设置，并结合数字化控制技术，实现洗柱、上样、除杂、洗脱、收集等作业的自动化，大幅节约人工成本，提高层析效率，提高了目标产物的纯度和批间稳定性。
26.本实用新型结构考究，设计科学、合理，操作方便，环境友好，产生的技术效果显著，与现有常规的柱层析设备相比，本实用新型具有下列实质性特点和进步：
27.1.本实用新型构思巧妙，将柱层析、脱酸柱、高压恒流泵、磁控阀以及在线检测器
有机结合，通过管线优化布局和连通，实现了自动上样、洗脱及动态连续作业，节省了人工成本和时间成本，大幅提高了层析效率，使层析作业的规模化大生产成为可能。
28.2.本实用新型通过高压恒流泵将待分离样品及各种洗脱溶液泵入柱层析及脱酸柱，摆脱了现有柱层析系统仅靠洗脱液自身重力流动洗脱、效率低下之弊端，保证了待分离样品能够匀速进入柱层析单元，进行充分的扩散、吸附和分离，大幅提高了纯化效率。
29.3.本实用新型实现层析和脱酸一体化操作，避免手动更换层析柱的不足，使得中药或天然药物有效成分的分离、纯化和脱酸工艺一次性完成，方便快捷，稳定高效，具有广阔的推广应用前景。
附图说明
30.为了便于理解和掌握本技术实用新型技术方案，下面将对附图作简要介绍。应当知晓的是，以下附图不应被看作是对技术方案所述范围的限定，对本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据下列附图获得其他相关附图。
31.附图1为一种高效柱层析系统结构示意图
32.附图中标记分述如下：
33.1－第一高压恒流泵；2－第二高压恒流泵；3－层析柱；4－脱酸柱；5－第一在线检测器；6－第二在线检测器；7－六通阀；8－五通阀；9－四通阀；
34.10－储液单元；
35.11－第一储液罐；12－第二储液罐；13－第三储液罐；14－第四储液罐；15－第五储液罐；
36.111－第一储液罐连通管；121－第二储液罐连通管；131－第三储液罐连通管；141－第四储液罐连通管；151－第五储液罐连通管；
37.112－第一储液罐磁控阀；122－第二储液罐磁控阀；132－第三储液罐磁控阀；142－第四储液罐磁控阀；152－第五储液罐磁控阀；
38.101－第一高压恒流泵进液管；102－第一高压恒流泵出液管；
39.20－暂存单元；
40.21－第一暂存罐；22－第二暂存罐；23－第三暂存罐；24－第四暂存罐；
41.211－第一暂存罐连通管；221－第二暂存罐连通管；231－第三暂存罐连通管；241－第四暂存罐连通管；
42.212－第一暂存罐磁控阀；222－第二暂存罐磁控阀；232－第三暂存罐磁控阀；242－第四暂存罐磁控阀；
43.201－第一在线检测器进液管；202－第一在线检测器出液管；
44.203－第二高压恒流泵进液管；204－第二高压恒流泵出液管；
45.30－收集单元；
46.31－第一收集罐；32－第二收集罐；33－第三收集罐；
47.311－第一收集罐连通管；321－第二收集罐连通管；331－第三收集罐连通管；
48.312－第一收集罐磁控阀；322－第二收集罐磁控阀；332－第三收集罐磁控阀；
49.301－第二在线检测器进液管；302－第二在线检测器出液管。
具体实施方式
50.下面结合附图对本实用新型的具体实施方式作进一步详细地描述。
51.为了使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚、明晰，以下将结合附图对实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显而易见，以下实施例是本技术实施例的一部分，而不是全部。通常来说，附图和本实施例中所描述和出示的部件及连接方式可以通过其他方式来设置和布置，由于篇幅有限，在此不一一例举。
52.因此，以下对实施例的详细描述并非限定本技术要求保护的范围，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所作出的等同替换或修改，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
53.实施例1高效柱层析系统结构及作业方式
54.如附图1所示，本实用新型一种高效柱层析系统，主要由层析柱3、脱酸柱4、储液单元10、暂存单元20及收集单元30组成，所述储液单元10通过第一高压恒流泵进液管101与第一高压恒流泵1连通，第一高压恒流泵1通过第一高压恒流泵出液管102与层析柱3连通，层析柱3通过第一在线检测器进液管201与第一在线检测器5连通，第一在线检测器5通过第一在线检测器出液管202与暂存单元20连通，暂存单元20通过第二高压恒流泵进液管203与第二高压恒流泵2连通，第二高压恒流泵2通过第二高压恒流泵出液管204与脱酸柱4连通，脱酸柱4通过第二在线检测器进液管301与第二在线检测器6连通；第二在线检测器6通过第二在线检测器出液管302与收集单元30连通。
55.本实用新型高效柱层析系统进行中药、天然药物药效成分分离与纯化作业时，将洗柱纯化水、上样药液、低浓度洗脱溶剂、中浓度洗脱溶剂和高浓度洗脱溶剂分别加入到储液单元10的第一储液罐11、第二储液罐12、第三储液罐13、第四储液罐14和第五储液罐15。然后，通过中控计算机设定程序，分别控制储液单元10、暂存单元20和收集单元30中各磁控阀的开关条件和开关顺序，并分别控制第一高压恒流泵1和第二高压恒流泵2开关条件和流量大小。同时，通过中控计算机连接第一在线检测器5和第二在线检测器6，实时调整和修正上述此磁控阀的开关条件及高压恒流泵的开关条件、流量大小。通过上述参数条件设置，在中控计算机控制下，启动程序，进行洗柱、上样、除杂、洗脱、收集及检测的自动化操作，最终从中药、天然药物中分离、纯化得到目标产物。
56.以银杏叶提取物的分离、纯化为例，进一步详述本实用新型的层析作业过程：
57.首先，将纯化水、银杏叶提取液、10％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液分别加入到储液单元10的第一储液罐11、第二储液罐12、第三储液罐13、第四储液罐14和第五储液罐15。根据银杏叶提取物纯化工艺，计算纯化水、银杏叶提取液、10％乙醇溶液、70％乙醇溶液和95％乙醇溶液的用量。通过中控计算机设定的程序，分别控制储液单元10中的第一储液罐磁控阀112、第二储液罐磁控阀122、第三储液罐磁控阀132、第四储液罐磁控阀142、第五储液罐磁控阀152的开关及第一高压恒流泵1开关和流量。
58.接着，启动中控计算机预定程序，按照纯水
→
银杏叶提取物液
→
纯水
→
10％乙醇
→
70％乙醇
→
95％乙醇的顺序依次开启或关闭第一储液罐磁控阀112、第二储液罐磁控阀122、第三储液罐磁控阀132、第四储液罐磁控阀142、第五储液罐磁控阀152及第一高压恒流泵1，从而依次完成纯水洗柱
→
银杏叶提取物上样
→
纯水除杂
→
10％乙醇除杂
→
纯水除杂
→
70％乙醇洗脱
→
95％乙醇洗柱等各工艺步骤。第一在线检测器5设置于层析柱3的下端，
对层析柱3流出的液体进行实时检测，并将检测数据反馈给中控计算机，通过中控计算机程序实时调整和修正上述磁控阀的开关条件及高压恒流泵的开关条件、流量大小，使层析参数条件保持平稳、准确，使银杏叶目标产物层析洗脱液得到完全收集。
59.与此同时，通过中控计算机程序设定，使得从层析柱3流出的洗柱纯化水、70％乙醇洗脱液和95％乙醇洗柱液分别流入暂存单元20的第一暂存罐21、第三暂存罐23和第四暂存罐24，其他液体，如银杏叶上柱流出液、银杏叶液上柱纯水洗柱液、10％乙醇除杂洗脱液等均流入第二暂存罐22，暂存，弃去。
60.继续运行中控计算机程序，按照纯水
→
70％乙醇洗脱液
→
95％乙醇洗柱液的顺序依次开启或关闭第一暂存罐磁控阀212、第二暂存罐磁控阀222、第三暂存罐磁控阀232、第四暂存罐磁控阀242及第二高压恒流泵2，从而依次完成纯水洗柱
→
70％乙醇洗脱液脱酸
→
95％乙醇清洗柱等各工艺步骤。第二在线检测器6设置于脱酸柱4的下端，脱酸注4流出的液体进行实时检测，并将检测数据反馈给中控计算机，通过中控计算机程序实时调整和修正上述此磁控阀的开关条件及第二高压恒流泵2的开关条件、流量大小，使层析参数条件保持平稳、准确。
61.通过中控计算机程序的设定，使得从脱酸柱4流出的洗柱纯化水、70％乙醇洗脱液脱酸液目标产物和95％乙醇洗柱液分别流入收集单元30的第一收集罐31、第二收集罐32和第三收集罐33。其中，洗柱纯化水弃去，95％乙醇洗柱液收集、回收，70％乙醇洗脱液脱酸液即为目标收集产物。
62.实施例2柱层析集成系统纯化银杏叶提取物的研究
63.1材料
64.银杏叶提取物，鲁南厚普制药有限公司药物研发中心提供(银杏叶购于山东郯城圣强银杏有限公司)；lx-158和lx-02大孔树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)；36
×
920mm蛋白压缩柱和200ml微流反应器泵(上海赛梵科分离技术有限公司)。
65.2方法
66.2.1常规柱层析设备纯化银杏叶提取物
67.装柱：取洁净的蛋白压缩柱，紧密均匀地装入lx-158大孔树脂(柱体积约540ml)，(再生层析柱可省略该步骤)。
68.冲柱：设置微流反应器泵流量为35ml/min，用纯水冲洗层析柱(新层析柱可省略该步骤)。
69.上样：设置微流反应器泵流量为25ml/min，取处理后的银杏叶提取物样品向步骤
①
层析柱上样。
70.洗脱：上样结束，以25ml/min流速，依次用1500ml纯水和1500ml10％乙醇(20℃)冲柱；再用70％乙醇(20℃)洗脱，并接收洗脱液(弃去前200ml)，至收集的洗脱液为1500ml后停止洗脱；最后，以35ml/min流速用95％乙醇(20℃)冲柱再生，待洗脱剂全部流出至吸附剂变干，将lx-158大孔树脂倒入指定容器，并把层析柱洗净烘干。
71.装柱：按照步骤
①
的方法，用lx-02大孔树脂重新装柱。
72.脱酸：取步骤的洗脱液，直接以25ml/min流速向步骤的层析柱上样、脱酸，接收层析液。
73.2.2高效柱层析系统纯化银杏叶提取物
74.①
设备准备：向储液单元10中的第一储液罐11、第二储液罐12、第三储液罐13、第四储液罐14和第五储液罐15中分别加入纯化水、银杏叶提取物样品、10％乙醇溶液、70％乙醇和95％溶液，并确保各设备组件之间连接正常。
75.程序设置：设置第一储液罐磁控阀112、第二储液罐磁控阀122、第三储液罐磁控阀132、第四储液罐磁控阀142和第五储液罐磁控阀152开启期间，第一高压恒流泵1依次以35ml/min流速泵出1500ml纯化水、以25ml/min流速泵出与2.1等量的处理后的银杏叶提取物、1500ml纯化水、1500ml 10％乙醇(20℃)和1700ml 70％乙醇(20℃)、35ml/min流速泵出95％乙醇(20℃)。同时，设置第一在线检测器5检测到纯水、除杂纯水、10％乙醇溶液和95％乙醇溶液时，分别开启第一暂存罐磁控阀212、第二暂存罐磁控阀222、第二暂存罐磁控阀222和第四暂存罐磁控阀242。检测到70％乙醇时，前8min先开启第二暂存罐磁控阀222，之后再开启第三暂存罐磁控阀232。并设置在第一暂存罐磁控阀212、第二暂存罐磁控阀222、第二暂存罐磁控阀222和第四暂存罐磁控阀242打开期间，第二高压恒流泵2以25ml/min流速保持运行；另设置第二在线检测器6检测到纯化水、70％乙醇和95％乙醇时，分别开启第一收集罐磁控阀312、第二收集罐磁控阀322和第三收集罐磁控阀332，分别收集纯化水、70％乙醇洗脱液脱酸液(目标产物)和95％乙醇溶液洗脱液。
76.2.3统计方法采用graphpad prism软件版本5(graphpad software，美国)进行数据分析，结果以平均值
±
标准差表示。p《0.05被认为有统计学差异，p《0.01被认为有显著统计学差异。
77.3结果
78.如表1所示，使用常规柱层析设备和本实用新型高效柱层析系统纯化的银杏叶提取物中总黄酮含量均大于24％，内酯含量均高于6％，银杏酸均低于5mg/kg，符合药典标准。与常规柱层析设备纯化的银杏叶提取物对比显示，本实用新型柱层析集成系统纯化的银杏叶提取物中黄酮含量(p＜0.05)、内酯含量(p＜0.05)显著更高，银杏酸含量(p＜0.05)显著更低，且纯化耗时(p＜0.01)明显更短，收量(p＜0.05)显著更高，表明使用本实用新型柱高效柱层析体统纯化银杏叶提取物，有利于提高纯化效率，提高目标产物的纯度，节约人工成本和材料成本。此外，实验结果中黄酮含量、内酯含量、耗时和收量的波动明显更小，表明使用本实用新型高效柱层析系统纯化银杏叶提取物能够提高目标产物的批间稳定性。
79.表1收量、黄酮含量、内酯含量、银杏酸含量以及耗时的对比
[0080][0081][0082]
注：与常规柱层析设备相比，“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01。