一种去除糖苷生物碱的微生物菌剂及去除方法和脱毒高蛋白饲料与流程

1.本发明属于废弃物料资源化利用技术领域，具体涉及一种去除糖苷生物碱的微生物菌剂及去除方法和脱毒高蛋白饲料。


背景技术：

2.马铃薯淀粉加工是我国北方马铃薯主产区通过马铃薯产业扶贫和促进地方经济发展的支柱产业。马铃薯加工每年产生约550～1000万吨含水量在89％的薯渣，因其果胶含量高，持水力强，机械脱水性差，造成运输和贮藏十分困难，易腐败变臭。多年来，马铃薯淀粉企业随意丢弃或偷偷填埋或撒在农田里，造成环境污染。西北部分地区养殖户将薯渣煮熟或少量添加到其他饲料中喂牛羊，营养价值低，还因为薯渣中糖苷生物碱含量高，蒸煮并不能使其毒素去除，饲喂多时就会出现猪、牛、羊等动物拉稀和肠道中毒。
3.薯渣的糖苷生物碱是马铃薯在生长、收购和露天堆放过程中因光诱导产生大量的次生代谢产物，在马铃薯表皮和芽中含量最高。马铃薯糖苷生物碱主要包括α-茄碱、α-卡茄碱和少量的打碗花精生物碱。α-卡茄碱含量低于α-茄碱，但是毒性却高出2倍。打碗花精生物碱毒性最高，但是含量极少。因此，如果将马铃薯渣和回收的马铃薯蛋白作为饲料利用，首先必须去除糖苷生物碱。然而，糖苷生物碱耐高温、耐酸碱，普通蒸煮和ph3以上的酸也很难分解去除毒性。目前关于糖苷生物碱的去除，多数方案只能去除单一的糖苷生物碱，国内还没有同时去除两种或更多种糖苷生物碱的方法。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种去除糖苷生物碱的微生物菌剂及去除方法和脱毒高蛋白饲料，所述微生物菌剂具有较强的α-茄碱和α-卡茄碱分解能力，最终得到的适口性好的脱毒高蛋白饲料。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种去除糖苷生物碱的微生物菌剂，所述微生物菌剂的菌株包括黑曲霉cicc 2142和潮湿纤维单胞菌atcc 491。
7.优选的，所述微生物菌剂的剂型包括液态菌剂，所述黑曲霉cicc 2142的菌液和潮湿纤维单胞菌atcc 491的菌液的体积比为2～4:1～2。
8.优选的，所述黑曲霉cicc 2142的菌液的制备方法，包括：将斜面保存的黑曲霉cicc 2142菌株接种于察氏液体培养基中，振荡培养至od
600
为0.8～1.2时停止培养，得所述黑曲霉cicc 2142的菌液；
9.所述察氏液体培养基包括以下浓度的成分：蛋白胨10g/l、蔗糖30g/l、硝酸钠3g/l、磷酸氢二钾1g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l和硫酸亚铁0.01g/l。
10.优选的，所述潮湿纤维单胞菌atcc 491的菌液的制备方法，包括：将斜面保存的潮湿纤维单胞菌atcc 491接于lb液体培养基中，振荡培养至od
600
为0.8～1.2时停止培养，得
2142菌株接种于察氏液体培养基中，振荡培养至od
600
为0.8～1.2时停止培养，得所述黑曲霉cicc 2142的菌液；所述察氏液体培养基包括以下浓度的成分：蛋白胨10g/l、蔗糖30g/l、硝酸钠3g/l、磷酸氢二钾1g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钾0.5g/l和硫酸亚铁0.01g/l。本发明所述振荡培养的温度优选为28℃，且所述振荡的频率优选为220rpm。本发明所述振荡培养的时间优选约36h，至od
600
为1.0时即可停止培养，得到所述黑曲霉cicc 2142的菌液。本发明对所述察氏液体培养基的制备方法并没有特殊限定，优选按上述比例混合后，利用去离子水溶解并定容至1l，并于121℃高压蒸汽灭菌20min即可。
25.本发明所述潮湿纤维单胞菌atcc 491的菌液的制备方法，优选包括：将斜面保存的潮湿纤维单胞菌atcc 491接于lb液体培养基中，振荡培养至od
600
为0.8～1.2时停止培养，得到潮湿纤维单胞菌atcc 491的菌液。本发明所述振荡培养的温度优选为30℃下，且所述振荡的频率优选为150rpm。本发明所述振荡培养的时间优选为48h，至od
600
为1.0时即可停止培养，得到潮湿纤维单胞菌atcc 491的菌液。本发明对所述lb培养基的组成和培养方法并没有特殊限定，优选包括将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g充分溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l(按接种比例配制)，121℃高压蒸汽灭菌20min。
26.本发明对所述黑曲霉cicc 2142和潮湿纤维单胞菌atcc 491的来源并没有特殊限定，优选购自广东省微生物菌种保藏中心。
27.本发明还提供了一种利用上述微生物菌剂去除糖苷生物碱的方法，包括以下步骤：将所述微生物菌剂与薯渣秸秆混合料进行初始发酵后，再与增香和益生复合菌剂进行分袋包装固体发酵，得脱毒饲料；所述增香和益生复合菌剂的菌种包括两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和间型酒香酵母。
28.本发明所述糖苷生物碱优选包括α-茄碱和α-卡茄碱。
29.本发明所述薯渣秸秆混合料的含水量优选为55～70％，并且所述薯渣和秸秆的质量比优选为6.5～4:1～3。在本发明中，所述薯渣优选为马铃薯淀粉车间分离出来的含水量在89％左右的新鲜薯渣，经过带式压滤机脱水至80～85％。本发明所述薯渣秸秆混合料的制备方法优选包括将上述脱水至80～85％的薯渣与上年自然风干的粉碎至1～2cm颗粒大小玉米秸秆粉渣混合，使混合料含水量降至55～70％。本发明所述马铃薯渣必须是当天新鲜薯渣，没有滋生杂菌；玉米秸秆收获以后在阴凉处自然干燥有利于保持蛋白质、维生素等营养成分的保留，避免潮湿霉变；干燥秸秆含水量在5～15％，其功能是吸收薯渣水分，调节混合料总含水量。本发明所述薯渣秸秆混合料的配制，便于所述生物菌剂的快速生长，迅速分解薯渣和秸秆中的纤维、淀粉、蛋白和生物碱毒性。
30.本发明将所述微生物菌剂接种到所述薯渣秸秆混合料中进行初始发酵(或称初始糖化)，所述微生物菌剂的接种体积优选为所述薯渣秸秆混合料体积的0.2～1％，所述初始发酵优选包括堆放发酵，并且在堆放发酵时覆盖塑料，在25～35℃的环境中发酵2～3天即可。
31.本发明在所述初始发酵后，优选还包括向所述初始发酵后的物料中添加氮源，所述氮源包括尿素或马铃薯淀粉汁水回收的蛋白，且针对不同的氮源添加量不同，如尿素添加量1～3％(w/w)或回收马铃薯蛋白添加量(干基计)2～6％。本发明从马铃薯淀粉分离汁水回收的马铃薯蛋白营养效价高于大豆蛋白，是全营养蛋白，经淀粉企业热絮凝回收后，不用干燥可以直接添加利用，既节约了蛋白干燥费用，又提供了优质氮源，尤其是复合菌种可
以继续分解蛋白中残留的糖苷生物碱，去除毒性，提高价值。
32.本发明在添加所述氮源后，接种增香和益生复合菌剂和分装，进行下一阶段的固体发酵，所述增香和益生复合菌剂的剂型优选包括液态菌剂，所述两歧双歧杆菌的菌液、干酪乳杆菌干酪亚种的菌液和间型酒香酵母的菌液的体积比优选为1:2:2。本发明对所述的菌液的制备方法并没有特殊限定，实施例中，两歧双歧杆菌的菌液制备方法，优选包括：将4℃平板保存的两歧双歧杆菌接于tpy液体培养基中，于37℃下静置培养至od
600
＝1(约72h)，得到两歧双歧杆菌液。其中tpy液体培养基的制备方法，优选包括：蛋白胨15g、酵母浸膏2g、葡萄糖20g、可溶性淀粉0.5g、氯化钠5g和西红柿浸出液400ml(将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正ph7.0
±
0.1)，吐温801.0ml，肝粉0.3g，加去离子水溶解定容至1l(按接种比例配制)，121℃高压蒸汽灭菌20min。
33.本发明实施例中，所述干酪乳杆菌干酪亚种菌的菌液的制备方法，优选包括：将4℃斜面保存的干酪乳杆菌干酪亚种接于mrs液体培养基中，于37℃下以150rpm振荡培养至od
600
＝1(约24h)，得到干酪乳杆菌干酪亚种菌液。其中mrs液体培养基的制备方法，优选包括：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和碳酸钙20.0g加去离子水溶解定容至1l(按接种比例配制)，121℃高压蒸汽灭菌20min。
34.本发明实施例中，所述间型酒香酵母菌的菌液，制备方法优选包括：将4℃斜面保存的间型酒香酵母接于ypd液体培养基中，于30℃下以150rpm振荡培养至od600＝1(约24h)，得到间型酒香酵母菌液。其中所述ypd液体培养基的制备方法优选包括：ypd液体培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、酵母粉10.0g、蒸馏水1.0l充分溶解(按接种比例配制)，121℃高压蒸汽灭菌20min。
35.本发明将上述三种菌液复配后进行接种，所述接种的体积优选为经所述初始发酵后物料体积的0.2～1％，更优选为0.5～1％。本发明在所述接种后，优选立即按照0.2～2吨/袋分装塑料袋并捆扎密封，袋上留有一个单向出气孔，预防发酵胀气，同时检测发酵成熟度和质量变化情况。本发明所述固体发酵的时间优选为5～10天，糖苷生物碱含量可从高于200mg/kg安全标准降至100mg/kg以下，蛋白氮(有机氮)含量从1％左右升至3～6％，水分含量55～70％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3
×
108cfu/g左右。
36.本发明还提供了上述方法制备得到的脱毒高蛋白饲料。本发明所述脱毒高蛋白饲料开袋即可食用，也可不开袋于15℃保藏后再行食用，不影响品质，甚至还能继续减少糖苷生物碱的含量。
37.下面结合实施例对本发明提供的一种去除糖苷生物碱的微生物菌剂及去除方法和脱毒高蛋白饲料进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.本发明实施例中所涉及到的菌液的制备方法与上文相同，在此不再赘述；并根据图1所示流程设计实施例1～实施例4。
39.实施例1
40.1、薯渣秸秆混合料准备：500kg新鲜薯渣(含水量89％)，履带式压滤机脱水后重量440kg(含水量77％)，添加粉碎玉米秸秆140.8kg(含水量11％)，薯渣秸秆混合料总重量580.8kg(含水量61％)。
41.2、糖化菌接种发酵：黑曲霉cicc 2142菌液和潮湿纤维单胞菌atcc491菌液的混合比例为2:1，复合糖化菌接种量0.5％。堆放并覆盖塑料在温度32℃糖化发酵，期间不翻动，2天(48小时)后检查薯渣秸秆变深色、变湿，初级糖化完成。
42.3、添加氮源与益生菌接种分装：初级糖化后的薯渣秸秆复合料，添加尿素1.5％，接种两歧双歧杆菌液、干酪乳杆菌干酪亚种液和间型酒香酵母菌液组成的益生复合菌种，复配比例1:2:2，复合益生菌接种量0.5％。
43.按照300kg左右分装2个塑料袋捆扎密封发酵，分别编号1号和2号，袋上留有一个单向出气孔，放置在25℃室温下缓慢发酵，每天从塑料袋小孔闻气味，有较浓的酒香味后基本可以判断发酵成熟，7天开袋进行测试分析。
44.4、产品测试结果：1号袋：略带酒香味、颜色发黄、松散，糖生物碱含量从902mg/kg降至28.86mg/kg，蛋白氮升至3.1％，水分61.4％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.31
×
108cfu/g。2号袋在15℃度低温存放6个月(固原西吉11月至下一年5月没有暖气的库房存放)后开袋检测：2号袋饲料有香味、褐色、松散，没有杂菌污染，糖生物碱含量从902mg/kg降至8.1mg/kg，蛋白氮3.05％，水分量60.2％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.01
×
108cfu/g。
45.实施例2
46.1、薯渣秸秆混合料准备：500kg新鲜薯渣(含水量89％)，履带式压滤机脱水后重量452kg(含水量77％)，添加粉碎玉米秸秆144.64kg(含水量11％)，薯渣秸秆混合料总重量596.64kg(含水量61％)。
47.2、糖化菌接种发酵：黑曲霉cicc 2142菌液和潮湿纤维单胞菌atcc491菌液比例为2:1，复合糖化菌接种量0.5％。堆放并覆盖塑料在温度32℃糖化发酵，期间不翻动，2天(48小时)后检查薯渣秸秆变深色、变湿，初级糖化完成。
48.3、添加氮源与益生菌接种分装：初级糖化后的薯渣秸秆复合料，添加淀粉企业自己回收的马铃薯蛋白(含水量82％)3.0％(以干重计)，接种两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和间型酒香酵母3种益生复合菌种，复配比例1:2:2，复合益生菌接种量0.5％。
49.按照300kg左右分装2个塑料袋捆扎密封发酵，分别编号3号和4号，袋上留有一个单向出气孔，放置在25℃室温下缓慢发酵，每天从塑料袋小孔闻气味，有较浓的酒香味后基本可以判断发酵成熟，7天开袋进行测试分析。
50.4、产品测试结果：3号袋饲料略带酒香味、颜色发黄、松散，糖生物碱含量从962mg/kg降至35.8mg/kg，蛋白氮升至4.4％，水分63.2％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.35
×
108cfu/g。4号袋薯渣秸秆蛋白饲料在15℃度低温存放6个月(固原西吉11月至下一年5月没有暖气的库房存放)后开袋检测：4号袋有酒香味、褐色、松散，没有杂菌污染，糖生物碱含量从962mg/kg降至7.4mg/kg，蛋白氮含量4.4％，水分含量61％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.11
×
108cfu/g。
51.实施例3
52.1、薯渣秸秆混合料准备：500kg新鲜薯渣(含水量89％)，履带式压滤机脱水后重量465kg(含水量79％)，添加粉碎玉米秸秆89.74kg(含水量11％)，薯渣秸秆混合料总重量554.74kg(含水量68％)。
53.2、糖化菌接种发酵：黑曲霉cicc 2142菌和潮湿纤维单胞菌atcc 491复合菌种的
混合比例为2:1，糖化菌接种量0.5％。堆放并覆盖塑料在温度32℃糖化发酵，期间不翻动，2天(48小时)后检查薯渣秸秆变深色、变湿，初级糖化完成。
54.3、添加氮源与益生菌接种分装：初级糖化后的薯渣秸秆复合料，添加尿素1.5％，接种两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和间型酒香酵母3种益生复合菌种，复配比例1:2:2，复合益生菌接种量0.5％。
55.按照300kg左右分装2个塑料袋捆扎密封发酵，分别编号5号和6号，袋上留有一个单向出气孔，放置在25℃室温下缓慢发酵，每天从塑料袋小孔闻气味，有较浓的酒香味后基本可以判断发酵成熟，7天开袋进行测试分析。
56.4、产品测试结果：5号袋饲料有酒香味、颜色暗黄、松散，糖生物碱含量从1302mg/kg降至57.9mg/kg，蛋白氮升至2.9％，水分68.2％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.01
×
108cfu/g。6号袋在15℃度低温存放6个月(固原西吉11月至下一年5月没有暖气的库房存放)后开袋检测：6号袋饲料有酒香味、褐色、松散，没有杂菌污染，糖生物碱含量从1302mg/kg降至9.2mg/kg，蛋白氮2.9％，水分68％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达2.81
×
108cfu/g。
57.实施例4
58.1、薯渣秸秆混合料准备：500kg新鲜薯渣(含水量89％)，履带式压滤机脱水后重量400kg(含水量78％)，添加粉碎玉米秸秆200kg(含水量11％)，薯渣秸秆混合料总重量600kg(含水量55％)。
59.2、糖化菌接种发酵：黑曲霉cicc 2142菌和潮湿纤维单胞菌atcc 491复合菌种的混合比例为2:1，糖化菌接种量0.5％。堆放并覆盖塑料在温度32℃糖化发酵，期间不翻动，2天(48小时)后检查薯渣秸秆变深色、变湿，初级糖化完成。
60.3、添加氮源与益生菌接种分装：初级糖化后的薯渣秸秆复合料，添加淀粉企业自己回收的马铃薯蛋白(含水量82％)3.0％(以干重计)，接种两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种和间型酒香酵母3种益生复合菌种，复配比例1:2:2，复合益生菌接种量0.5％。
61.按照300kg左右分装2个塑料袋捆扎密封发酵，分别编号7号和8号，袋上留有一个单向出气孔，放置在25℃室温下缓慢发酵，每天从塑料袋小孔闻气味，有较浓的酒香味后基本可以判断发酵成熟，7天开袋进行测试分析。
62.4、产品测试结果：7号袋饲料有酒香味、色黄、松散，糖生物碱含量从1133mg/kg降至36.21mg/kg，蛋白氮升至4.5％，水分55.4％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.45
×
108cfu/g。8号袋不开袋薯渣秸秆蛋白饲料在15℃度低温存放6个月(固原西吉11月至下一年5月没有暖气的库房存放)后开袋检测：8号袋有酒香味、褐色、松散，没有杂菌污染，糖生物碱含量从1133mg/kg以上降至6.4mg/kg，蛋白氮4.5％，水分55％，两歧双歧杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种的活性菌数可达3.35
×
108cfu/g。
63.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。