基于纳米间隙阵列的荧光增强基底及其制备方法及其应用与流程

1.本发明属于光学检测技术领域，尤其涉及一种基于纳米间隙阵列的荧光增强基底及其制备方法及其应用。


背景技术：

2.在生物化学、分析化学、临床医学检测等广泛领域中，光学检测具备其他检测原理(如电学、磁学、力学)难以比拟的优势，如抗电磁干扰、可远距离传感、兼容大视场、多路检测、抗溶液腐蚀从而具备长工作寿命等等。基于荧光标记的光学检测技术现已发展为生命科学基础研究和临床测试中必不可少的重要工具。绝大部分荧光检测技术简单快速，可靠性高，无放射性污染。它的工作原理是对一系列生物标志物，如核酸、抗原抗体、酶，使用荧光分子以选择性共价结合的方式进行特定标记，进而进行成像观测和光谱分析。然而，在标志物浓度较低的情况下，荧光信号常常十分微弱，限制了检测的灵敏度。因此，为了实现更优秀的、乃至达到单分子水准的检测极限，放大荧光信号强度，实现超灵敏、高可靠度检测成为该领域的关键。该问题的突破将补充如反转录酶聚合酶链反应(rt-pcr)等依赖样本扩增过程的荧光检测技术的不足，给如新型冠状病毒肺炎，埃博拉病毒等众多重大疾病的抗原/抗体型快速、早期精准检测带来重大突破。
3.20世纪70年代，科学家发现金、银等贵金属纳米结构可以被用于增强荧光信号。在特定波长范围的激发光照射下，纳米结构中的表面自由电子集体震荡，形成表面等离激元(surface plasmons)的共振模式，使局域电磁场强度及光学态密度增大。其荧光增强效果取决于荧光分子与等离激元共振场的电场分布的重叠程度。如何使极少量的荧光标记的待测物和模式体积仅在0.001-0.01个波长立方大小，但具有数十倍、上百倍电场强度增强的局域“热点”(hot spot)在空间上相互匹配，是提高检测效率和精度的关键。该问题的解决将赋予荧光检测所期望的精确、便捷、稳定、高灵敏度、低成本的优异属性，实现极为广阔的应用前景。
4.面向极低浓度分子探测以及荧光属性调控，应对待测荧光分子和电磁场增强区域间匹配的难题，研发大尺寸、密集排布的表面等离激元纳米结构基底是一个可行的思路。常规、传统的纳米金属结构荧光增强基底通常可分为以下两种：1)热退火等效应形成的无序、岛状纳米结构；2)表面吸附一定数目的随机分布、或有化学自组装形成的金属纳米球的基底。这两种体系由于缺乏大尺寸下结构均匀度，不同区域吸附的荧光分子数目也往往有巨大的差别；更重要的是，这两种体系产生的等离激元共振现象的随机性较大，难以用于定量的分析，不同样品间检测结果的重复性也较差。
5.为了保证测试的可靠性和精确度，需要精确控制电场增强条件、共振波长区间、和热点密度及分布；相邻金属纳米结构的“间隙”被证实能够精细调控局域电磁场增强，最高可提供高达单分子级别的灵敏度。现有公开的技术方案中，如cn109781705b、cn112362622a公开了以模板法制备密集排版的颗粒阵列的方案，但均缺乏构造间隙热点，并对颗粒间隙的有效调节机制，从而难以实现对增强波长、偏振等维度的高自由度调控。目前该问题的探
索和解决目前仅存于基础科学研究，而且往往依赖于高端精密纳米加工。而且大部分涉及间隙精确调控的加工流程过于昂贵、复杂、耗时，制约了可实现的单位面积上的颗粒数目，难以实现有效增强结构的密集排布。由于大面积的“无效”区域，通常单位面积下得到的增强倍数一般仅为数倍，难以满足应用需求。


技术实现要素：

6.针对以上技术问题，本发明公开了一种基于纳米间隙阵列的荧光增强基底及其制备方法及其应用，采用该荧光增强基底，使得检测精确、高效、稳定，而且具有高灵敏度。
7.对此，本发明采用的技术方案为：
8.其包括基底，所述基底上设有凸起的金属纳米颗粒阵列，所述金属纳米颗粒阵列由若干个单元阵列构成，每个单元包括一个或多个金属纳米颗粒；所述单元阵列成密堆积六方晶格结构，晶格常数a为60-200nm；
9.所述金属纳米颗粒为半椭球形截面，所述金属纳米颗粒之间为可调控的间隙阵列，最小间隙不大于20nm；所述金属纳米颗粒的表面设有分隔层，所述分隔层为通过沉积包被氧化物或采用化学法进行表面修饰得到。
10.其中，金属纳米颗粒之间的最小间隙位于每个单元内的金属纳米颗粒之间，或位于相邻的单元之间的金属纳米颗粒之间。该金属纳米颗粒之间的最小间隙可以为横向间隙中的较小者，也可以为纵向间隙中的较小者。
11.现有的大尺寸、实用型基于等离激元共振模式的荧光增强基底常常基于二维的无序纳米岛结构，或片上随机分布的单金属颗粒。其结构均匀度、可控度较差，电磁场增强条件较为随机，在面向同一类型的样本测试中往往存在均匀度和可重复性问题。而本发明的技术方案中，基底的一面集成有半椭球形截面的金属纳米颗粒阵列，可以有效的将电磁场增强区域(即相邻颗粒间隙的热点)与荧光分子在空间上高度重叠，同时可以通过设计单元阵列，利用其中的结构对称度，可以在制备中灵活调控密集排布的颗粒间的耦合间隙，以及光场耦合中的横向、纵向两套共振模式，实现对增强波长、增强因子、偏振各向异性等性质的操控。该技术方案可以实现间隙热点的密集排布，最大化的减少“盲区”，在面向微量荧光分子检测的场景中将分子与热点的匹配概率最大化，可实现极低浓度的检测，提高检测的灵敏度。另外，由于阵列结构的高均匀度和光场的周期性，可以实现大尺寸均匀增强效果，有利于以成像或扫描的方式对多样品条件，多实验轮次进行定量分析对比。
12.作为本发明的进一步改进，所述分隔层的厚度为1-3nm。
13.作为本发明的进一步改进，相邻金属纳米颗粒之间的最小间隙为横向或纵向中的较小者，间隙宽度为5-15nm。
14.作为本发明的进一步改进，所述分隔层包括单层分子组装层和受体层，所述金属纳米颗粒通过受体层与单层分子组装层连接。
15.作为本发明的进一步改进，所述金属纳米颗粒的长轴长度为40-60nm，短轴为20-40nm，所述金属纳米颗粒的高度为20-50nm。
16.作为本发明的进一步改进，所述晶格常数a为80-120nm。
17.作为本发明的进一步改进，每个单元包括两个金属纳米颗粒，每个单元的金属纳米颗粒通过两次沉积分别得到。
18.作为本发明的进一步改进，所述金属纳米颗粒的材料为金、银、铝、铂或铜。
19.作为本发明的进一步改进，所述基底的材质为玻璃、石英、ito导电玻璃、聚对苯二甲酸乙二醇酯、甲基丙烯酸甲酯(pmma)或聚二甲基硅氧烷(pdms)。
20.作为本发明的进一步改进，所述基底上设有若干不同关键参量(g，dy)分别调控的区域。
21.本发明还公开了如上所述的基于纳米间隙阵列的荧光增强基底的制备方法，其包括如下步骤：
22.步骤s1，选择与颗粒阵列结构对应的掩膜或模板，所述掩膜或模板的孔径大小为50-150nm；所述掩膜或模板采用电子束曝光的工艺方法或具有孔状结构的阵列模板制备得到；
23.步骤s2，通过掩膜或模板在基底上进行第一次真空热蒸发沉积金属纳米颗粒，沉积方向与基底的夹角α为5
°
至10
°
，得到每个单元的金属纳米颗粒单体；改变相对沉积方位、角度，使沉积方位与第一次沉积的方位不同，调节掩膜或模板中单个孔道中与相邻孔道中的相对位置，进行第二次沉积金属纳米颗粒，沉积方向与基底的夹角β为5
°
至10
°
；
24.步骤s3，去除掩膜或模板。
25.作为本发明的进一步改进，步骤s1中，所述掩膜或模板的孔径大小为70-90nm。
26.作为本发明的进一步改进，所述模板为孔状阵列的胶体纳米球阵列模板、阳极氧化铝模板或者光刻制备的孔状阵列。
27.作为本发明的进一步改进，采用具有高度良好方向性的热蒸发，进行至少两次金属纳米颗粒的沉积。
28.本发明还公开了如上所述的基于纳米间隙阵列的荧光增强基底的应用，其用于荧光增强信号检测中，可适用于固相、液相、以及微流控集成等多种应用环境中。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
30.第一，采用本发明技术方案的荧光增强基底，具有高效、多维度可控、多场景适用的特点，增强结构基于密集排布的阵列式颗粒结构，提供了可调的结构间隙和热点分布。通过对于横向、纵向颗粒间隔参数的有效调节，可以实现相邻颗粒间的沿长轴或短轴震荡的模式相互耦合，与常规单颗粒阵列相比，在两个正交方向上均提供了间隙“热点”和极高的增强因子，尤其适合于存在荧光发射各项异性的分子的增强匹配与信号探测研究。
31.第二，采用本发明的技术方案，通过有效调节电场增强的波长、偏振和增强因子，使得整个过程高度可控、可重复，有利于定量的判定荧光分子浓度。面对极低浓度的荧光分子探测，测量区域中最大化的聚集了阵列结构和可调控热点区域，使得荧光分子发光增强及被探测到的几率大大增加，提高了检测的灵敏度。通过优化颗粒尺寸参数可以使得增强效果最大化，有利于对极端条件下荧光分子信号测量，测量效率、精度得到保证。除了光谱检测手段，本发明的技术方案荧光增强基底还可以通过成像，提供空间分布信息，以及于实时追踪单分子动态变化信息，帮助观察、理解生物过程中的分子机理。
32.第三，本发明的荧光增强基底具有广阔的实用性，该荧光增强基底结构可适用于多种传统基底以及新型柔性基底，用于固相、液相、以及微流控集成下的原位实时测量。在基于荧光检测的疾病标志物免疫学快速筛查、痕量分析等应用中，有望提供比现有技术更优秀的检测性能。此外，该技术还可用于食品中农药、过敏原检测、水源中污染物监测等。
附图说明
33.图1是本发明实施例的一种基于纳米间隙阵列的荧光增强基底的结构示意图；其中，(a)是立体结构示意图，(b)为一种表面处理方案的单元增强结构的侧视图；(c)为另一种表面处理方案的单元增强结构的侧视图。
34.图2是本发明实施例的三种不同实现方式的荧光增强基底的俯视图；其中，(a)为侧重短轴间横向耦合产生热点的对称结构，(b)为侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构，(c)为第三种实现方式的荧光增强基底的分区设计示意图。
35.图3是本发明实施例中两种不同实现方式的荧光增强基底的制备流程示意图；其中，(a)是步骤一第一轮沉积，(b)是侧重短轴间横向耦合产生热点的对称结构的步骤二的第二轮沉积的示意图，(c)是侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构的步骤二的第二轮沉积的示意图，(d)是去除模板的示意图。
36.图4是本发明实施例的两种不同实现方式的荧光增强基底的扫描电子显微镜(sem)图像；其中，(a)为侧重短轴间横向耦合产生热点的对称结构的sem图像，(b)为侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构的sem图像。
37.图5是本发明实施例的两种不同实现方式的荧光增强基底三维光学仿真得到的在决定对称度的参数dy微调下的消光光谱；其中，(a)为侧重短轴间横向耦合产生热点的对称结构的短轴方向上的偏振激发，(b)为侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构的长轴方向上的偏振激发。
38.图6是本发明实施例的两种不同间隙构造方式、以及尚未构造间隙的荧光增强基底三维光学仿真得到的在x-y平面的电场强度分布图；其中，(a)和(b)是侧重短轴间间隙横向耦合产生热点的对称结构的分别采用横向和纵向偏振激发结果，(c)和(d)是侧重长轴间间隙纵向耦合产生热点的非对称结构的分别采用横向和纵向偏振激发结果，(e)和(f)是单元结构为单体、不存在间隙情况下分别采用横向和纵向偏振激发结果。
39.图7是本发明实施例的具备偏振分辨功能的荧光增强信号检测装置的结构示意图。
40.图8是本发明实施例中选用的花青类荧光分子结构式以及高浓度水溶液中测量得到的荧光发射光谱。
41.图9是本发明实施例采用非对称结构的金属颗粒阵列的荧光增强基底在横向、纵向偏振下的发射光谱及无增强结构下的发射光谱对比图。
42.图10是本发明实施例的荧光增强基底的四种应用方案的应用示意图；其中(a)为用于固相的表面吸附分子的荧光增强方案，(b)为基于柔性衬底的用于非均匀表面的荧光增强方案，(c)为基于柔性衬底的用于液相表面的分子吸附下的荧光增强方案，(d)为集成微流控通道的用于实时液相的分子吸附下的荧光增强方案。
43.附图标记包括：101-金属纳米颗粒；102-基底；103-最小相邻颗粒间隙；104-荧光分子；105-氧化物隔绝层；106-单层分子组装层；107-受体层；108-横向间隙热点；109-纵向间隙热点；110-检测区块；
44.201-具有孔装阵列的模板；202-沉积方向；203-金属纳米颗粒单体；
45.301-荧光分子液滴；302-柔性透明基底；303-存在褶皱或曲面的待测物；304-待测荧光分子溶液；305-微流控通道；306-流体输入输出孔。
具体实施方式
46.下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
47.本发明具体实施方式一个方面为提供一种高效、多维度可控、多场景适用的荧光增强基底，增强结构基于密集排布的阵列式颗粒结构，提出一种结构间隙和热点分布可调的实现途径。示意图参见图1，大尺寸、半椭球形截面的金属纳米颗粒阵列101集成于数厘米到数十厘米尺度的平面基底102上，金属纳米颗粒间具备热点效应的间隙结构，可以有效的将相邻颗粒间隙103，即电磁场增强热点区域(即相邻颗粒间隙的热点)与检测过程中的荧光分子104在空间上高度重叠。同时通过设计阵列单元的结构对称度，可以在制备中灵活调控密集排布的颗粒间的耦合间隙，以及光场耦合中的横向、纵向两套共振模式，实现对增强波长、增强因子、偏振各向异性等性质的操控。该发明实现间隙热点的密集排布，最大化的减少“盲区”，在面向微量荧光分子检测的场景中将分子与热点的匹配概率最大化，可实现极低浓度的检测。最后，由于结构的高均匀度和光场的周期性，实现大尺寸均匀增强效果，有利于以成像或扫描的方式对多样品条件，多实验轮次进行定量分析对比。
48.下面结合具体的实施例进行进一步的说明。
49.如图1所示，一种荧光增强基底，其包括基底102，所述基底102上设有凸起的颗粒阵列，所述颗粒阵列由若干个单元阵列构成，每个单元包括一个或多个金属纳米颗粒101；所述金属纳米颗粒101为半椭球形截面，所述金属纳米颗粒101的表面设有分隔层，所述金属纳米颗粒101之间的最小间隙不大于20nm；所述分隔层为通过沉积包被氧化物或采用化学法进行表面修饰得到。所述单元以密堆积六方晶格结构阵列，晶格常数a为60-200nm，优选为80-120nm。其中，金属纳米颗粒之间的最小间隙位于每个单元内的金属纳米颗粒之间，或位于相邻的单元之间的金属纳米颗粒之间。
50.所述基底102优选为在荧光激发、发射波段透明的基底，如玻璃、石英基底、ito导电玻璃，也可以为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚二甲基硅氧烷(pdms)等聚合物基底。其中的金属纳米颗粒101之间的最小间隙即最小相邻颗粒间隙103不大于20nm，可生成强烈电磁场增强热点的结构。最小相邻颗粒间隙103与荧光分子104的作用示意图如图1b)所示，具备荧光发光特性的荧光分子104可为有机荧光染料、金属有机配合物、量子点、上转换材料、二维材料等其中的一种或几种的混合。
51.本实施例中，金属纳米颗粒101采用半椭球型颗粒，这样间隙就处于整体结构底部，更适合和表面吸附的分子充分接触并相互作用。通常，检测中荧光分子与金属表面的距离不应过于接近(如小于2-3nm)，避免因非辐射能量转移产生荧光猝灭，使荧光效率大幅度降低。本实施例中设置分隔层是避免荧光猝灭的有效方法，可以采用沉积包被常见氧化物得到预防荧光猝灭的氧化物隔绝层105；另外，在特异性吸附荧光分子检测中，也可以以化学法进行表面功能化修饰，设置单层分子组装层106和受体层107，其中单层分子组装层106通过受体层107与金属纳米颗粒101的表面作用连接，隔绝荧光分子104和金属纳米颗粒101的直接接触。氧化物隔绝层105的厚度可为1-3nm，针对整个纳米结构阵列，可统一调控荧光分子104和金属纳米颗粒101的间距。
52.进一步的，所述颗粒阵列的自身根据纳米模板定义，可为密排六方晶格，晶格常数a为60-200nm，优选为80-120nm。颗粒阵列中沉积所得到的单元结构可为一个或多个半椭球型的金属纳米颗粒，优选为两个，两个金属纳米颗粒通过两次沉积分别完成。金属纳米颗粒
的长轴长度l
x
优选为40-60nm，短轴ly优选为20-40nm，与此相对应的颗粒高度可为20-50nm。在该尺度内，金属纳米颗粒选用金、银、铂系金属等贵金属，局域等离激元共振的基模波长基本覆盖可见光波段，可用于增强绝大多数荧光分子的辐射效率。
53.金属纳米颗粒间的最小相邻颗粒间隙103优选为5-15nm，在此范围内可以有效产生数十倍乃至上百倍的电磁场强度增强，即“热点”。设计根据最小间隔存在的位置可以采用两种实施方式实现：
54.1)单元内，相邻的金属纳米颗粒101的短轴和短轴间存在耦合间隙，见图2a，可以产生横向间隙热点108。
55.2)相邻的单元之间，相邻的金属纳米颗粒101的长轴和长轴间存在耦合间隙，见图2b，可以产生纵向间隙热点109，这种结构可通过引入两个单体之间的相对错位dy。
56.除此之外，在约数平方厘米大小的芯片尺寸上，可以通过设计加工得到关键参量(g，dy)独立调制的区块序列，如图2c)所示，其包括若干个检测区块110，这些检测区块110为特定间隙设计、形成在特定波长有强烈增强效应的检测区块。每一个区域具备特定的共振波长，用于匹配相对应偏振下原荧光发射、激发波长，实现增强效应最大化。根据purcell效应，总体荧光强度的增强因子z与在共振激发、发射波长下的荧光分子所处位置近场电场强度增强倍数的平方相关，即：
[0057][0058]
其中λ
em
是激发波长，λ
exc
是荧光发射波长，e
array
为分子与等离激元共振模式作用区域的电场强度，e
bare
为分子在仅为常规基底状况下电场强度。通过调节关键参量(g，dy)，可得到共振谱、电场强度调制与λ
exc
、λ
em
的选择性匹配效果。
[0059]
上述荧光增强基底可以采用如下方法制备得到：
[0060]
如图3所示，其展示了一种基于模板辅助下、实现密集排布金属颗粒阵列中两类间隙加工、调控方案。优选的模板为具备周期性孔状结构的模板，孔径大小优选为70-90nm，最大范围可为50-150nm。模板可基于电子束曝光工艺或具有孔装阵列的模板201。作为低成本制备方案，该模板优选为具有孔装阵列的模板201，进一步的，该具有孔装阵列的模板201为胶体纳米球阵列模板或阳极氧化铝模板等。随后，加工过程中的沉积次数优选为两次，即单个孔结构中生成两个相邻的金属纳米颗粒。方案优选为沉积具有高度定向性的电子束热蒸发，两次沉积中，基底和沉积方向202的夹角α、β优选为5
°
至10
°
之间。具体步骤为：
[0061]
步骤一为首次沉积，基底和沉积方向202的夹角为α，可得到每个单元中的金属纳米颗粒单体203。
[0062]
步骤二为二次沉积，通过改变相对沉积方位、角度，基底和沉积方向的夹角为β，可以精确调节单个孔道中及相邻孔道中颗粒与颗粒间的相对位置。
[0063]
如图4所示，为进行实际验证，实验中采用了约1cm2大小的模板，得到同样面积尺寸的阵列结构，设计并制备了两种形态的颗粒阵列，一种结构单元对称，步骤一为首次沉积，基底和沉积方向的夹角为α，对应的步骤二沉积角可为步骤一的镜像，即β＝-α，主要利用同单元中两个单体的横向间隙作为热点。如果为了实现纵向间隙，步骤二沉积角需要区别于-α，主要利用相邻单元的两个颗粒。如有需要创造更多间隙，也可在此方案的基础上增
加第三、四次沉积。
[0064]
最后，步骤三采用湿法刻蚀去除模板。除此之外，其余可行方案包括基于电子束直写等纳米光刻技术的“揭开一剥离”(lift-off)工艺等。
[0065]
为了对上述的实施例进行更好的验证，下面按照上述制备方法得到两种构型的荧光增强基底，一种的最小间隙g位于单元内的相邻金属纳米颗粒的短轴之间，也就是侧重短轴间横向耦合产生热点的对称结构，另一种的最小间隙g位于相邻单元之间的相邻金属纳米颗粒的长轴之间，也就是侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构。选择金作为颗粒材料，纳米颗粒的长轴l
x
选为62nm，短轴ly选为32nm，高度选为30nm，最小间隙g选为10nm，对该荧光增强基底进行电磁场仿真，结果如图5所示。可见，两种构型的荧光增强基底，采用可见光区间中的两个正交偏振的激发源，验证两个“亮”模，即可被有效激发的共振模式的存在。在模式波长位置存在明显消光极大值，即吸收和散射的增强，并在金属表面附近存在近场电磁场增强。模式均可随着受激发的自由电子震荡朝向(即偏振方向)、颗粒与颗粒间隔dy而有效调控。其中长轴方向共振震荡模式在约650-700nm附近可调，短轴方向共振模式在约550-600nm附近可调。此外，改变g、l
x
、ly均可有效调控共振波长位置。
[0066]
图6a)-6d)展示了上述两种构型的荧光增强基底的电磁场仿真中的电场强度分布图。与6e)-6f)阵列单元为单体、尚未构造出间隙的情况对比，其阵列单元中存在有效等离激元耦合时，其特征间隙结构有助于获得更明显的局域电磁场增强。对于第一种实现方式的侧重短轴间横向耦合产生热点的对称结构，对于共振波长，纵向偏振实现了50倍场强增强，如图6a)所示，横向偏振在间隙处也实现了36倍的增强因子，如图6b)所示。对于第二种实现方式的侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构，采用dy＝20nm，纵向间隙形成，仿真结果显示纵向偏振下间隙处增强因子提高为80倍。原本横向间隙因错位，效应被削弱，横向增强因子下降为16倍。
[0067]
本发明具体实施方式的第二个方便还提供了上述荧光增强基地的应用，其用于大尺寸荧光增强基底的偏振分辨测试及相关装置中。如图7所示，为一种可行的、具备偏振分辨功能的荧光增强信号检测装置，其中激发光源可为激光、汞灯或高功率led光源。激发光通过滤波片后，起偏器(可为偏振片加二分之一波片)可自由调节输入激发光偏振。优选方案为采取二向色镜，可基于单个物镜同时进行激发光的聚焦以及发射荧光的收集。高数值孔径(na》0.5)的物镜可以提升对荧光发射的收集效率和空间分辨率，有利于对于低浓度荧光分子的测量。收集得到的荧光信号的偏振特性可通过检偏组件进行区分。荧光探测组件可分为成像部分及光谱部分，通过由分光镜可同时采集，成像部分优选为高效率、低噪声的光电探测元件，如具备电子制冷的ccd、cmos，scmos的相机，光谱读取部分优选为具备光栅分光的光谱仪。通常，单片基底可划分为多个参数调控下的区块(图中命名为001、002、003
……
)。基于引入电控位移平台，实现聚焦激发光斑与阵列位置的扫描，可有效分辨得到极低浓度状况下的荧光分子检测、乃至单分子检测。如有需要，可以以外加针孔的形式进行共聚焦激发，以提高空间分辨率。
[0068]
本发明具体实施方式还提供了上述荧光增强基地的另一种应用，为面向高浓度荧光分子的探测，可取消物镜聚焦，以入射光束直接激发。荧光信号较强时，通过滤波片后可用肉眼直接观测，或基于便携式rgb彩色相机采集信号。
[0069]
为表明实际效果，本实施例按照上述步骤在硅基基底制备了一种非对称结构的金
属颗粒阵列的荧光增强基底(也就是侧重长轴间纵向耦合产生热点的非对称结构)，开展了偏振分辨的荧光增强探测。作为一种实施方案，选用花青染料类分子(分子式：c
25h27
n2nao8s2，相对分子量：570.6g/mol)，该类分子在高浓度下的荧光光谱如图8所示。在荧光增强实验中，采用了100
×
物镜(na＝0.7)对波长405nm的泵浦激光聚焦，在约0.8μm2大小的有效激发光斑中，估算存在约～104组阵列单元同时提供热点进行荧光增强。在基底表面滴加浓度约为10-10
mol/l的染料溶液，在染料充分吸附后以高速氮气气流吹净。在偏振分辨测试下可以看到各向异性的荧光发射分布，纵向和横向偏振下荧光强度比值为4.2，体现出两组共振模式主导下的不同表现的增强效应。
[0070]
图9展示了一组荧光光谱，与在无增强结构的基底上测得的原始光谱对照，荧光发射峰从原本的605nm劈裂为560nm和640nm。沿颗粒长轴(即纵向)共振的偏振取向下，对比无增强结构的基底附近，纵向间隙(最小相邻颗粒间隙)中的热点实现了高达40倍的荧光增强。而在沿颗粒短轴方向的模式，即580nm附近，增强倍数相对较弱。该增强现象通过近50个点的随机选择测量，证实具备高度可重复性和均匀度。
[0071]
上述验证方案采用了具备圆偏振属性的激发波长(405nm)，避免激发光偏振带来的影响，以验证荧光自身发光的偏振属性。本发明同时声明更优选的方案，将激发波长调整为与发射波长接近，采用与高增强因子的局域等离激元共振模式匹配的激发光偏振，既能够将激发光能量和荧光分子很好的耦合，又能将分子发射的荧光放大并辐射到远场自由空间。考虑两者相似的增强倍数，粗略估算整体增强效果有望达到约～20-80倍的平方，即增强因子逾千倍。
[0072]
本发明具体实施方式的第三方面，涉及在大尺寸基底中的纳米间隙引入待测物进行荧光探测的应用检测。图10展示了包括已介绍的应用实例在内的四种可行的应用方案。
[0073]
第一种应用方案是最便捷、直接的方案，即将金属纳米颗粒阵列集成于常规的基底102，以旋涂、浸泡、转移等方式将含有待测荧光分子的溶液样本的荧光分子液滴301引入相邻颗粒间隙103中，如图10(a)所示。其中，所述基底101可以为如玻璃、石英基底或ito导电玻璃。
[0074]
第二种应用方案是将基底改用柔性透明基底302，如pdms、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)等材质。柔性透明基底302可以更好的适配存在褶皱、或曲面的待测物303，对其表面的荧光特性以“贴片”性方式，进行原位信号放大测量，如图10(b)所示。该方案可提供对于原待测荧光分子的表面密度、分布状况等信息。
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第三种应用方案也是采用第二种应用方案中的柔性透明基底302，就是将金属纳米颗粒面反向朝下，漂浮于待测荧光分子溶液304的表面，对吸附的荧光分子进行实时信号放大，该方案可保证荧光分子与样品作用的空间均匀度，并可测定结合的亲和度，如图10(c)所示。
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第四种应用方案是将荧光增强基底和微流控通道305结合，如图10(d)所示，微流控通道305优选方案为pdms，可采用光刻定义图案的硅或光刻胶结构作为模板，使用道康宁sylgard184中基本组分及固化剂在存有模具的容器中混合，搅拌均匀，然后放置于真空箱中去除气泡，静置固化，最后剥离。微流控通道305中与荧光增强基底连通的流体输入输出孔306可通过打孔器得到，并插入金属连接管与外部流体泵连接。将优选为玻璃、石英的荧光增强基底与pdms置于氧等离子处理，使二者表面形成不可逆键合。该方案可以制备得到
多路荧光增强通道，适用于复用式测量。
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可见，本发明实施例的荧光增强基底具有广阔的实用性，可适用于多种传统基底以及新型柔性基底，用于固相、液相、以及微流控集成下的原位实时测量。在基于荧光检测的疾病标志物免疫学快速筛查、痕量分析等应用中，有望提供比现有技术更优秀的检测性能。此外，该技术还可用于食品中农药、过敏原检测、水源中污染物监测等。
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以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。